способ моделирования ревматоидного артрита

Формула изобретения

Способ моделирования ревматоидного артрита путем введения полного адъюванта Фрейнда (ПАФ), отличающийся тем, что введение ПАФ производят в количестве 0,07-0,08 мл (подпороговая доза), после чего организм животного подвергают воздействию иммобилизационного стресса в течение 1 ч ежедневно в период с 14-х по 28-е сутки.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемый способ относится к области экспериментальной медицины, патофизиологии.

Известен способ моделирования ревматоидного артрита (описание изобретения к авторскому свидетельству №1748174 А1). Он осуществляется путем введения животному бычьего сывороточного альбумина и полного адъюванта Фрейнда; последующей электростимуляцией при помощи имплантированных в полости голеностопных суставов и в хвостовую вену электродов.

Недостатком данного способа является его сложность, а также отсутствие постепенного поэтапного развития системного воспаления, клиники поражения суставов, характерной для ревматоидного артрита. Формируется скоротечная тяжелая картина альтеративно-пролиферативных изменений с выраженной деструкцией суставов общей продолжительностью 2 недели.

Известен также способ моделирования ревматоидного артрита (описание изобретения к авторскому свидетельству №1098027 А), являющийся наиболее близким по своей технической сущности к изобретению.

Он осуществляется внутрикожным введением в задние лапки ПАФ (инактивированная культура БЦЖ, 0,4-0,5 мг на 0,9-1,0 мл смеси равных объемов ланолина и вазелина) при предварительном 4-дневном воздействии на организм животного грязевыми аппликациями на зону проекции надпочечников.

Одним недостатком указанного способа является трудно выполнимое внутрикожное введение ПАФ в объеме 0,9-1,0 мл в подушечки задних лап. Другой недостаток - развитие клинически выраженной картины адъювантного артрита без фазы предболезни или продромального периода.

Нами предлагается способ моделирования ревматоидного артрита путем введения 0,07-0,08 мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ), состоящего из инактивированной культуры БЦЖ (2 мг/мл в масляной среде: 1 ч. ланолина и 30 ч. вазелинового масла) и последующего воздействия одночасового ежедневного иммобилизационного стресса с 14-х по 28-е сутки.

Сущность предлагаемого решения состоит в том, что модель ревматоидного артрита воспроизводится под влиянием двух основных факторов: одного - специфического: введение подпороговой дозы ПАФ; второго - неспецифического: воздействие иммобилизационного стресса.

Новизна предлагаемого решения заключается в том, что для воспроизведения модели ревматоидного артрита впервые применяется воздействие иммобилизационным стрессом на организм животных, которым предварительно вводится внутрикожно ПАФ в количестве 0,07-0,08 мл (подпороговая доза). Внутрикожное одноразовое введение ПАФ позволяет получить стадию предболезни адъювантного артрита. Применение иммобилизационного стресса на 14-28-е сутки после введения ПАФ, ежедневно, в течение 1 часа приводит к воспроизведению непосредственно болезни с ярко выраженными проявлениями полиартрита.

Новизна предлагаемого нами способа свидетельствуют о творческом характере решения, т.е. говорит о соответствии решения критерию "неочевидности".

Технический результат выражается в получении двухэтапной модели ревматоидного артрита: во-первых, внутрикожным введением подпороговой дозы ПАФ; во-вторых, воздействием иммобилизационного стресса с 14-х по 28-е сутки.

Технический результат достигается путем внутрикожного введения подпороговой дозы ПАФ с последующим воздействием на организм животного иммобилизационным стрессом.

Предлагаемый способ позволяет исследовать условия и механизмы перехода предболезни в болезнь; изучить различные неспецифические патогенные факторы, вызывающие полиартрит, характер и условия их патогенного действия на организм при весьма надежной воспроизводимости.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Белым лабораторным крысам-самцам средним весом 145 г вводят 0,07-0,08 мл полного адъюванта Фрейнда (состав ПАФ представляет собой инактивированную культуру БЦЖ (2 мг/мл) в масляной среде (1 ч. ланолина и 30 ч. вазелинового масла)) внутрикожно в подушечки задних лап. В течение последующих 14-ти суток у животных 1 раз в неделю регистрировались основные показатели динамики состояния животных: диаметр окружности голеностопных суставов, ректальная и локальная температуры, СОЭ, количество лейкоцитов в периферической крови. С 14-х по 28-е сутки после введения ПАФ крыс подвергали ежедневному иммобилизационному стрессу. Стресс воспроизводили фиксацией крыс на станке в течение 1 часа. На 28-е сутки животных декапитировали. Кровь бралась для анализа ряда биохимических показателей.

Приводим примеры конкретного осуществления предлагаемого способа моделирования ревматоидного артрита.

Пример 1.

40 белых лабораторных крыс-самцов весом 135-150 г после внутрикожного введения подпороговой дозы ПАФ наблюдались в течение 28 суток. 1 раз в неделю регистрировались основные показатели динамики состояния животных: диаметр 4 окружности голеностопных суставов, ректальная и локальная температуры, СОЭ, количество лейкоцитов в периферической крови.

Результаты показали, что к концу 1-й недели применения стресса была отмечена достоверная отрицательная динамика как по местным показателям: диаметр голеностопных суставов увеличился на 70,3%, локальная температура повысилась на 8,2%, так и по общим: повышение СОЭ на 84,4%, количества лейкоцитов на 50,0%. К концу 2-й недели достоверная динамика усилилась, что было отмечено по всем изучаемым показателям воспалительного процесса: увеличение диаметра голеностопных суставов на 75,7%; общей и локальной температур на 1,1 и 10,8%, соответственно; повышение СОЭ на 177,8%, лейкоцитов на 87,2%.

Основные результаты исследований приведены в таблице 1.

Пример 2.

40 лабораторных белых крыс-самцов средним весом 145 г подвергали ежедневному иммобилизационному стрессу с 14-х по 28-е сутки со дня введения подпороговой дозы ПАФ. Декапитировали на 28-е сутки. Исследовали следующие биохимические показатели крови: общий белок, общий холестерин, АЛТ, ACT, первичные продукты перекисного окисления липидов (диеновые конъюгаты и кетодиены) в сыворотке крови. Группой сравнения служили животные с адъювантным артритом, воспроизводимым введением 0,2 мл ПАФ в подушечки задних лап.

У опытных животных к 28-м суткам были отмечены достоверные изменения следующих показателей: снижение общего белка сыворотки крови на 16,7%, общего холестерина на 15,9%, повышение АЛТ на 67,3%, ACT на 23,4%.

В группе этих животных была выявлена активация процессов перекисного окисления липидов. Зарегистрировано повышение продуктов перекисного окисления липидов: диеновых конъюгат на 69,6%, кетодиенов на 74,1%.

При сравнении опытной группы животных с группой крыс с адъювантной болезнью по диаметру голеностопных суставов не было выявлено достоверной разницы.

Основные результаты исследований приведены в таблице 2.

Способ моделирования ревматоидного артрита выполним в условиях лаборатории патофизиологического профиля.

Таблица 1.
ВЛИЯНИЕ ИММОБИЗИЗАЦИОННОГО СТРЕССА НА ДИНАМИКУ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА У КРЫС С ПРЕДБОЛЕЗНЬЮ И С АДЪЮВАНТНЫМ АРТРИТОМ
Условия опыта		I	II	III	IV	V
Масса тела (I), ее прирост (II-V)	Интактная	157±6	12,1±0,8	14,6±0,8*	23,2±0,8*	29,5±0,9*
	Контроль (стресс)	157±6	7,9±0,8	19,8±0,9*	23,3±0,9*	18,3+1,0*
	Адъювантный артрит	170±4	-18,9±2,0*	-27,1±3,4*	-31,5±2,6*	-24,2+2,2*
	Адъюв. предб-знь	160±3	2,0±2,2	10,0±1,5*	15,0±2,5*	20,0+2,0*
	Адъюв. предб-знь + стресс	165±4	1,6±3,0	7,0±4,3	-3,4±5,2	-10,4+4,1*
Диаметр суставов	Интактная	6,7+0,1	6,7+0,1	6,8+0,1	6,8+0,1	6,9+0,1
	Контроль (стресс)	6,7+0,1	6,8+0,1	7,1+0,1	7,1+0,1	7,1+0,1
	Адъювантный артрит	6,7+0,1	10,6+0,1*	12,3+0,2*	13,5+0,1*	13,2+0,2*
	Адъюв. предб-знь	6,7+0,1	6,8+0,1	7,0+0,1	7,1+0,1	7,1+0,1
	Адъюв. предб-знь + стресс	6,7+0,1	6,9+0,1	7,4+0,4	12,6+0,2*	13,0+0,2*
Общая температура	Интактная	37,4+0,1	37,3+0,1	37,5+0,2	37,3+0,1	37,3+0,1
	Контроль (стресс)	37,6+0,1	37,5+0,1	37,5+0,1	37,0+0,1	37,4+0,1
	Адъювантный артрит	37,2+0,1	38,6+0,1*	39,2+0,2*	39,5+0,1*	39,4+0,1*
	Адъюв. предб-знь	37,4+0,1	37,4+0,1	37,2+0,1	37,3+0,1	37,2+0,1
	Адъюв. предб-знь + стресс	37,3+0,2	37,6+0,1	37,7+0,1	37,6+0,1	38,1+0,2*
Локальная температура	Интактная	30,1+0,1	30,1+0,1	30,5+0,2	30,1+0,1	30,1+0,1
	Контроль (стресс)	30,1+0,1	30,0+0,1	30,1+0,1	30,2+0,1	30,2+0,1
	Адъювантный артрит	30,1+0,1	33,1+0,1*	34,3+0,1*	34,6+0,1*	34,4+0,2*
	Адъюв. предб-знь	30,1+0,1	30,1+0,1	30,3+0,1	30,7+0,2	30,8+0,1
	Адъюв. предб-знь + стресс	30,1+0,1	30,4+0,1	30,5+0,5	33,0+0,1*	33,8+0,1*
СОЭ	Интактная	3,5+0,1	3,4+0,1	4,5+0,1	3,5+0,2	3,5+0,3
	Контроль (стресс)	3,7+0,3	3,8+0,2	3,6+0,3	3,8+0,3	3,4+0,2
	Адъювантный артрит	3,8+0,7	11,0+0,9*	13,8+0,4*	14,6+0,3*	13,5+0,4*
	Адъюв. предб-знь	3,6+0,3	4,7+0,4	4,4+0,3	4,6+0,4	4,3+0,2
	Адъюв. предб-знь + стресс	3,2+0,2	4,3+0,3*	4,5+1,1	8,3+0,4*	12,5+0,3*
Кол-во лейкоцитов	Интактная	13,3+0,5	13,1+0,2	14,9+1,8	13,5+0,4	13,3+0,4
	Контроль (стресс)	13,5+0,3	13,6+0,3	13,1+0,2	16,0+0,1	17,4+0,1
	Адъювантный артрит	13,3+0,3	25,8+0,3*	29,5+0,2*	31,4+0,2*	29,5+0,3*
	Адъюв. предб-знь	13,0+0,3	13,6+0,2	13,9+0,3	14,0+0,3	14,1+0,2
	Адъюв. предб-знь + стресс	13,3+0,2	14,2+0,2*	14,9+1,8*	22,2+0,5*	27,9+0,3*
Примечание: I, II, III, IV, V - сроки снятия показателей - в день введения ПАФ, на 7-е, 14-е, 21-е и 28-е сутки соответственно.
Звездочка (*) - р<0,05 внутри групп по срокам, сравнительно с днем введения ПАФ.

Таблица 2.
ВЛИЯНИЕ ИММОБИЗИЗАЦИОННОГО СТРЕССА НА ДИНАМИКУ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У КРЫС С ПРЕДБОЛЕЗНЬЮ И С АДЪЮВАНТНЫМ АРТРИТОМ
N	Условия опыта	Содержание ОБ, г %	Содержание OX, ммоль/л	N	Условия опыта	Содержание ОБ, г%	Содержание ОХ, моль/л
1	Интактная	7,0±0,1	76,0±1,4	3	Адъювантный артрит	5,9±0,2	65,3±1,5
2	Контроль (стресс)	6,4±0,1	67,0±1,3	4	Адъювантная предболезнь	6,4±0,1	73,4±1,9
				5	Адъюв. предболезнь + стресс	6,0±0,1	65,6±1,2
		Содержание АЛТ, ед.	Содержание ACT, ед.			Содержание АЛТ, ед.	Содержание ACT, ед.
1	Интактная	20,8+1,3	59,0+1,8	3	Адъювантный артрит	35,9+1,5	82,3+1,0
2	Контроль (стресс)	26,7+1,5	66,9+1,2	4	Адъювантная предболезнь	32,5+1,1	69,3+1,9
				5	Адъюв.предболезнь + стресс	34,8+2,0	72,8+2,2
		Содержание ДК, на мг липидов	Содержание КД, на мг липидов	N	Условия опыта	Содержание ДК, на мг липидов	Содержание КД, на мг липидов
1	Интактная	1,71+0,02	0,58+0,01	3	Адъювантный артрит	3,46+0,01	1,22+0,03
2	Контроль (стресс)	1,78+0,02	0,67+0,02	4	Адъювантная предболезнь	2,14+0,02	0,86+0,02
				5	Адъюв. предболезнь + стресс	2,90+0,03	1,01+0,02
Примечание: В каждой группе использовалось по 8 животных.