композиция, обладающая бактериостатической и бактерицидной активностью против спор бактерий и вегетативных клеток, и способ обработки ею продуктов питания

Формула изобретения

1. Композиция для обработки пищевого продукта, обладающая бактериостатической и бактерицидной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных вегетативных бактерий, грамположительных и грамотрицательных спорообразующих бактерий и их спор в продуктах питания, включающая, по меньшей мере, один метаболит пропионово-кислых бактерий в комбинации с а) лантибиотиком; б) литическим ферментом и в) органической кислотой или ее солью.

2. Композиция по п.1, в которой указанный лантибиотик выбран из группы, в основном состоящей из низина и лактицина.

3. Композиция по п.1, в которой литический фермент выбран из группы, в основном состоящей из лизоцима и хитиназы.

4. Композиция по п.1, в которой органическая кислота или ее соль выбраны из группы, в основном состоящей из уксусной кислоты, молочной кислоты, лимонной кислоты, пропионовой кислоты, диацетата натрия, ацетата натрия, ацетата калия, лактата натрия, лактата калия, цитрата натрия, цитрата калия, пропионата натрия, пропионата калия и их смесей.

5. Композиция по п.4, в которой органическая кислота или ее соль представляет собой диацетат натрия.

6. Композиция по п.1, дополнительно включающая один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из дополнительных антибактериальных средств, хелатообразующих агентов, натуральных пряностей, синтетических пряностей, вкусовых веществ, красок, окрашивающих веществ, витаминов, минеральных веществ, пищевых веществ, ферментов и связывающих агентов.

7. Способ подавления роста или уничтожения бактерий на пищевом продукте, предусматривающий нанесение на одну или более поверхностей композиции для обработки пищевого продукта по любому из пп.1-6.

8. Способ по п.7, где указанная композиция снижает число грамположительных бактерий в пищевом продукте.

9. Способ по п.8, где грамположительные бактерии выбраны из родов, состоящих из Bacillus, Clostridia, Staphylococcus, Listeria, Micrococcus, Streptococcus, Lactobacillus и Leuconostoc.

10. Способ по п.9, где бактерии выбраны из группы, состоящей из Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium sporogenes, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium putrefasciens, Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes.

11. Способ по п.7, где указанная композиция снижает число грамотрицательных бактерий в пищевом продукте.

12. Способ по п.11, где грамотрицательные бактерии выбраны из родов, состоящих из Escherichia, Campylobacter, Vibrio, Pectobacteria, Pseudomonas и Salmonella.

13. Способ по п.12, где бактерии выбраны из группы, состоящей из Е.coli H7:0157, Campylobacter jejuni, Vibrio parahaemolytica, Pectobacterium carotovorum и Pseudomonas fluorescens.

14. Способ по п.7, где пищевой продукт выбран из группы, состоящей из молочных продуктов, фруктов, овощей, продуктов, полученных из фруктов, продуктов, полученных из овощей, зерновых, продуктов, полученных из зерновых, мясных продуктов, продуктов из птицы, морепродуктов, готовых к употреблению блюд, гастрономических салатов, заправок для салатов, приправ, паст, супов, продуктов в асептических упаковках и их сочетаний.

15. Способ по п.7, где пищевой продукт содержит более 1% жира, липидов или растворимых масел.

16. Способ по п.7, где пищевой продукт включает жировую эмульсию.

17. Способ по п.16, где указанную композицию включают в водную фазу жировой эмульсии.

18. Способ по п.7, где указанную композицию либо наносят на поверхность пищевого продукта, либо наносят на упаковочный материал для продукта, который затем контактирует с поверхностью пищевого продукта.

19. Способ по п.7, где указанную композицию наносят на пищевой продукт погружением, орошением, инъецированием, распылением или смешиванием.

20. Способ по п.7, где указанную композицию применяют для пищевого продукта в качестве компонента маринада, панировки, натирки из пряностей, глазури или окрашивающей смеси.

21. Способ по п.7, где указанную композицию используют в сочетании с технологической обработкой пищевого продукта в сублетальных дозах.

22. Способ по п.21, где технологическая обработка в сублетальных дозах выбрана из группы, состоящей из обработки теплом, гамма-облучением, высоким давлением, ультразвуком, озоном, нитритами или их сочетанием.

23. Пищевой продукт, имеющий пониженную популяцию живых бактерий в результате нанесения на одну или более его поверхностей композиции для обработки пищевого продукта по любому из пп.1-6.

24. Пищевой продукт по п.23, который выбран из группы, состоящей из молочных продуктов, фруктов, овощей, продуктов, полученных из фруктов, продуктов, полученных из овощей, зерновых, продуктов, полученных из зерновых, мясных продуктов, продуктов из птицы, морепродуктов, готовых к употреблению блюд, гастрономических салатов, заправок для салатов, приправ, паст, супов, продуктов в асептических упаковках и их сочетаний.

25. Пищевой продукт по п.23, где указанную композицию используют в сочетании с технологической обработкой пищевого продукта в сублетальных дозах.

26. Пищевой продукт по п.23, где технологическая обработка пищевого продукта в сублетальных дозах выбрана из группы, в основном состоящей из обработки теплом, гамма-облучением, высоким давлением, ультразвуком, озоном и нитритами.

Описание изобретения к патенту

Предпосылки изобретения

Данная заявка заявляет преимущество по 35 U.S.C. § 119(е), ранее поданной и находящейся на рассмотрении предварительной заявки на выдачу патента США № 60/305114, поданной 13 июля 2001 года под названием «Композиция для обработки продуктов питания, обладающая бактериостатической и бактерицидной активностью, и способ обработки ею продуктов питания», содержание которой включено здесь для сведения.

1. Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композиции, обладающей бактериостатической и бактерицидной активностью в отношении нежелательных бактерий, находящихся в продуктах питания, и способу обработки продуктов питания данной композицией для придания продуктам питания устойчивости к порче и безопасности для потребления.

2. Описание уровня техники

Широко практикуются способы и композиции для обработки пищевых продуктов для предупреждения или подавления порчи под действием бактерий и/или развития вредных бактерий. Обычной практикой при промышленной стерилизации продуктов питания с низким содержанием кислот (т.е. рН > 4,5) является применение сочетания тепловой обработки и давления для консервированных или упакованных продуктов, достаточного для достижения по меньшей мере 12-десятичного (12D) уменьшения числа спор Clostridium botulinum, с учетом того, что у большинства устойчивых к тепловой обработке опасных бактерий в продуктах питания имеется способность образовывать высокоустойчивые к теплу споры, которые выживают при более слабых способах обработки.

К сожалению, обычные способы стерилизации с эффективностью 12D могут привести к изменению внешнего вида и вкуса продуктов питания, что делает их менее привлекательными по сравнению с продуктами питания, обработанными при температурах, которые являются менее губительными (сублетальными) для спор С. botulinum.

В последние годы большинство продуктов питания подвергают обработке сублетальными дозами тепла, давления, облучения, ультразвука или их сочетаниями, которые могут привести к снижению числа бактерий в продуктах питания, одновременно обеспечивая их более высокую органолептическую привлекательность. В результате воздействия данных способов обработки в сублетальных дозах продукты питания изменяются не так резко, чем при традиционных тепловых обработках с эффективностью 12D, используемых для стерилизации продуктов питания, но большинство продуктов питания, обработанных таким образом, затем нуждаются в хранении при охлаждении для того, чтобы защитить их от возможного роста спорообразующих бактерий.

Несмотря на то, что технологические обработки в сублетальных дозах приводят к гибели большинства вегетативных, приводящих к порче продуктов и патогенных бактериальных клеток, обычно в результате погибает только часть потенциальных спор бактерий, которые обладают повышенной устойчивостью к теплу, облучению и другим видам обработок. Эти споры могут выживать при технологических обработках в сублетальных дозах и затем расти в обработанных продуктах питания, вызывая порчу, отравление и, в худших случаях, смерть потребителя. По этой причине большую часть продуктов, обработанных данным способом, хранят при охлаждении, чтобы замедлить или предупредить рост таких спор.

Продукты питания, зараженные данными спорообразующими бактериями, многочисленны и включают, но не ограничиваются, готовой к употреблению пищей и основными блюдами, гастрономическими салатами, молочными продуктами, заправками и приправами, обработанными или консервированными мясными продуктами, продуктами из птицы и морепродуктами, а также обработанными фруктами и овощами, продуктами, полученными из фруктов и овощей, зерновыми и продуктами из зерновых, пастами, супами и продуктами в асептической упаковке. Готовые продукты длительного хранения при охлаждении, особенно в вакуумной упаковке, упакованные в измененной атмосфере (МАР), и консервированные продукты питания вызывают особое беспокойство, поскольку в них могут размножаться и расти споры некоторых бактерий, таких как Clostridium botulinum, с образованием смертельных токсинов. Подобный риск может быть выше для продуктов питания, обработанных сублетальными дозами, поскольку способы обработки в сублетальных дозах, как правило, приводят к гибели непатогенных вегетативных видов бактерий, которые иначе приведут к порче или будут конкурировать со спорообразующими видами. Дополнительным риском для данной группы продуктов является применение способов вакуумной упаковки или упаковки в измененной атмосфере, в результате которых создаются анаэробные условия, необходимые для развития и роста спор клостридий.

Интенсивные исследования проводились в области безопасности продуктов питания по разработке пищевых композиций, которые могут функционировать в качестве антибактериальных средств. Патенты США № 5096718 и 5260061 представляют релевантные документы, и приводятся здесь для сведения. В данных патентах раскрывается применение метаболитов пропионово-кислых бактерий в некоторых продуктах питания для повышения сохраняемости получаемых продуктов. Данные метаболиты проявляют активность против грамотрицательных бактерий, но, как правило, не так эффективны против грамположительных бактерий или их спор.

В патенте Японии 07-115950 раскрывается комбинация бактериоцинов, продуцированных молочнокислыми бактериями рода пропионово-кислых бактерий, в сочетании с органическими кислотами и их солями, эфирами жирных кислот и многоатомных спиртов, аминокислотами, антибактериальными пептидами и белками, сахарами, входящими в состав полисахаридов, сахарными кислотами и аминосахарами и продуктами их частичного разрушения, пряностями и их эфирными маслами, растительными компонентами и спиртами.

В патенте США № 5217250 раскрывается применение композиций на основе низина в качестве бактерицидных средств. Низин представляет собой лантибиотик, точнее полипептид, обладающий антимикробными свойствами, который продуцируется в природе различными штаммами бактерии Streptococcus lactis. Низин в основном эффективен против грамположительных бактерий. В данном патенте раскрывается, что комбинация хелатообразователя, такого как ЭДТА или других ацетатных солей или цитратных солей, с низином может быть бактерицидом широкого спектра действия.

В патенте США № 5458876 раскрывается комбинация лантибиотика с лизоцимом в качестве антибактериальной композиции.

В Европейском патенте 0466244 раскрывается композиция, обладающая повышенными антибактериальными свойствами, которая представляет собой смесь, по меньшей мере, одного из следующих групп соединений: (I) соединения или его соли, лизирующего клеточную стенку, (II) антибактериального соединения и (III) адъюванта, выбранного из органических кислот, приемлемых для использования в продуктах питания, косметических препаратах и средствах личной гигиены, или солей этих кислот; фосфатов и конденсированных фосфатов или их соответствующих кислот; и других удаляющих агентов. Предпочтительно (I) представляет собой лизоцим, (II) может быть бактериоцином (например, низином или педиоцином) и (III) может быть уксусной кислотой, молочной кислотой, лимонной кислотой, пропионовой кислотой, винной кислотой, ортофосфатами, гексаметафосфатами, триполифосфатами, другими полифосфатами или удаляющими агентами, содержащими замещенные или незамещенные аминогруппы, например ЭДТА.

В Европейском патенте 0453860 раскрывается комбинация низина с фосфатным буфером, эффективная при значении рН 5,5-6,5 для уничтожения грамотрицательных бактерий на поверхностях.

В патенте США № 5989612 раскрывается комбинация метаболита пропионово-кислых бактерий, не только пропионовой кислоты, и интенсификатора, который включает хелатообразователи, эфирные масла или органические кислоты (другие чем пропионовая кислота, уксусная кислота, молочная кислота и их типичные соли).

В патенте США № 6207210 раскрывается комбинация метаболита пропионово-кислых бактерий, не только пропионовой кислоты, лантибиотика и одной или более фосфатных солей, которые действуют в качестве хелатообразующего агента.

По-прежнему имеется потребность в антибактериальной композиции, эффективной как против грамположительных бактерий, так и грамотрицательных бактерий, а также против спор грамположительных бактерий, особенно в продуктах питания, подвергающихся технологической обработке в сублетальных дозах (менее 12D).

Краткое описание изобретения

В настоящее время с удивлением было установлено, что композиция для обработки продуктов питания, содержащая, по меньшей мере, один метаболит пропионово-кислых бактерий и, по меньшей мере, два дополнительных компонента, выбранных из группы, состоящей из а) лантибиотиков, b) литических ферментов и с) органических кислот и/или солей органических кислот, проявляет высокую бактериостатическую и бактерицидную активность против грамположительных и грамотрицательных вегетативных бактерий, а также против грамположительных спорообразующих бактерий, как правило, обнаруживаемых на или в продуктах питания. Данная композиция особенно эффективна как бактериостатик и бактерицид в отношении содержащихся в продуктах питания потенциально опасных, патогенных бактерий при ее использовании в сочетании с одной или более технологической обработкой в сублетальных дозах.

В наиболее предпочтительных воплощениях лантибиотик (а) в композиции представляет собой низин или лактицин; литический фермент (b) представляет собой лизоцим или хитиназу, и органическая кислота и/или соль органической кислоты (с) выбрана из группы, состоящей из уксусной кислоты, соли уксусной кислоты, такой как ацетат натрия, диацетат натрия или ацетат калия, молочной кислоты, соли молочной кислоты, такой как лактат натрия или лактат калия, пропионовой кислоты, пропионатов, включая, но не ограничиваясь пропионатом натрия и пропионатом калия, лимонной кислоты, соли лимонной кислоты, такой как цитрат натрия или цитрат калия, или их смеси.

В еще одном воплощении настоящее изобретение обеспечивает способ снижения общего числа или популяции бактерий в или на продуктах питания применением к продуктам питания эффективного в бактериостатическом аспекте или эффективного в бактерицидном аспекте количества данной композиции.

В дополнительном воплощении настоящее изобретение обеспечивает пищевые продукты, имеющие пониженную популяцию живых бактерий в результате применения к ним эффективного в бактериостатическом аспекте или эффективного в бактерицидном аспекте количества вышеуказанной композиции.

На практике композицию вещества по настоящему изобретению можно применять для продуктов в сочетании с одной или более технологической обработкой в сублетальных дозах, такой как обработка теплом в сублетальных дозах.

Подробное описание предпочтительных воплощений

Антибактериальная композиция по настоящему изобретению включает, по меньшей мере, один метаболит пропионово-кислых бактерий и, по меньшей мере, два дополнительных компонента, выбранных из группы, состоящей из (а) лантибиотиков, (b) литических ферментов и (с) органических кислот и/или солей органических кислот. Антибактериальная композиция проявляет высокую бактериостатическую и бактерицидную активность против нежелательных грамположительных и грамотрицательных вегетативных бактерий, а также грамположительных спор, как правило, обнаруживаемых на или в продуктах питания.

В том смысле, в котором этот термин здесь используется, «метаболит» относится к органическому соединению, иному, чем вода или двуокись углерода, продуцируемому пропионово-кислыми бактериями. «Бактериостатический» или «эффективный в бактериостатическом аспекте» относится к способности соединения или композиции подавлять рост или размножение бактерий. «Бактериоцидный» или «эффективный в бактериоцидном аспекте» относится к свойству соединения или композиции разрушать, т.е. приводить к гибели бактерий. Оба выражения «активный метаболит» и «ингибирующий метаболит» относятся к бактериостатическому метаболиту.

«Литический фермент» включает любое соединение, способное разрушать клеточную стенку бактерий, приводя к лизису (или гибели) клеток.

Выражение «вредные бактерии» включают все бактерии, находящиеся в продуктах питания, которые вызывают, ускоряют и участвуют или как-то иначе играют роль в порче продуктов питания и/или которые могут быть опасны для здоровья, особенно здоровья человека, если бактерии или их побочные продукты (например, токсины) попадают в организм потребителя.

Термин «продукт питания» или «пищевой продукт» включает все съедобные пищевые соединения и композиции, особенно предназначенные для потребления человеком, и включают необработанные, а также обработанные, например прошедшие кулинарную обработку, пищевые соединения и композиции. Выражение «присутствует в продуктах питания» относится ко всем внешним поверхностям и внутренним поверхностям и/или частям продуктов питания, которые контактируют с вредными бактериями.

Для целей настоящего изобретения «обработка в сублетальных дозах» означает любую операцию, которая достаточна для значительного снижения популяции бактерий в продукте питания, но которая недостаточна для осуществления 12-десятичного (12D) уменьшения числа спор C. botulinum . Обработки в сублетальных дозах, которые здесь подразумеваются, включают обработку теплом, облучением, давлением, ультразвуком, озоном, нитритами и т.п., которые, когда применяются для продукта питания, будут приводить к значительному снижению числа бактерий, но будут недостаточными для осуществления 12-десятичного (12D) снижения числа спор C. botulinum.

Первый компонент композиции по настоящему изобретению для обработки продуктов питания является эффективным в бактериостатическом аспекте количеством, по меньшей мере, одного метаболита пропионово-кислых бактерий. Данные метаболиты раскрываются в патентах США № 5096718 и 5260061, содержание которых включено здесь путем ссылки. Данные метаболиты могут подавлять рост или размножение бактерий, в частности в данном случае грамотрицательных бактерий. Данное действие достигается без появления нежелательного вкуса, запаха или внешнего вида, даже в случае продуктов «с нежным вкусом и запахом», что не ухудшает их восприятие.

Метаболиты можно получить культивированием пропионово-кислых бактерий, например Propionibacterium shermanii , P. freudenreichii, P. pentosaceum, P. thoenii , P. arabinosum, P. rubrum, P. jensenii, P. peterssonii и близких видов (указанных у Malik et al., Can. J. Microbiol. 14:1185, 1968). Штаммы Propionibacterium имеются в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под определенным номером. Другие культуры являются широко доступными, или их можно получить из Университета штата Орегон, Corvallis, Oregon, бесплатно. Например, по настоящему изобретению можно использовать Propionibacterium freudenreichii подвид shermanii, штамм #9616 в АТСС.

Несмотря на то, что пропионовую кислоту можно использовать по настоящему изобретению, специалистам в данной области известно, что она придает сильные вкусовые качества продуктам питания. Несмотря на то, что такие вкусовые качества желательны в некоторых продуктах питания, таких как швейцарский сыр, для многих продуктов они нежелательны. Композиции на основе цельной ферментационной фракции, содержащие другие метаболиты пропионово-кислых бактерий в смеси, проявляют антибактериальную активность без сильных вкусовых качеств, связанных с пропионовой кислотой. Примеры таких композиций, содержащих данные метаболиты, включают таковые производства Rhodia Inc. под торговым названием MICROGARD^®.

Культуры Propionibacterium можно использовать для получения пищевого компонента, включая один или более метаболитов, которые могут подавлять рост грамотрицательных бактерий при нормальном значении рН многих продуктов питания. Метаболиты, которые можно получить в качестве побочных продуктов при ферментации с помощью культуры пропионово-кислых бактерий сепарированного молока или на другой подходящей для ферментации среде, могут служить в качестве вкусовых добавок и также они могут ингибировать целый ряд микроорганизмов после окончания ферментации. Степень подавления, достигаемая для смесей исследованных метаболитов, выше, чем для одной пропионовой кислоты, например для композиций MICROGARD^®. Сохраняемость пищевого продукта увеличивается при обеспечении в или на продукте одного или более таких активных метаболитов в комбинации с другими компонентами композиции по настоящему изобретению.

Культуральная среда для видов Propionibacterium может быть составлена с включением молока, молочной сыворотки или декстрозы, плюс дрожжевые экстракты, белковые гидролизаты или любой другой белок, содержащий стимуляторы. Можно включить различные буферы, соли, кислоты и другие вспомогательные средства для усиления продукции метаболитов и облегчения обращения с конечной композицией. Культуральную жидкость после размножения пропионово-кислых бактерий до титра примерно от 10⁶ до 10¹⁰ клеток на мл можно подвергнуть тепловой обработке (пастеризации) для уничтожения внесенных для посева и случайных бактерий перед использованием содержащей метаболит культуральной среды в жидкой, конденсированной, высушенной или замороженной форме.

Для облегчения хранения и перевозки культуральную смесь пропионово-кислых бактерий можно выпарить, или заморозить, или сконцентрировать, или обезводить, например, сушкой распылением или сушкой вымораживанием с получением порошка. Метаболиты можно выделить, или очистить, или использовать в виде смеси. Порошкообразные или жидкие естественные метаболиты пропионово-кислых бактерий можно включать в различные продукты питания и корма, что делает последние более устойчивыми к порче в результате роста и/или ферментативной активности грамотрицательных бактерий. Активность против порчи также можно получить включением живых пропионово-кислых бактерий непосредственно в продукт питания.

В большинстве случаев значительное снижение числа бактерий можно получить включением в антибактериальную композицию по настоящему изобретению достаточно небольшого количества метаболита пропионово-кислых бактерий, так чтобы при этом не проявлялось его отрицательное влияние на вкус или запах пищевого продукта. Конкретнее, жидкий, конденсированный или высушенный продукт, который обычно включает пастеризованные культуральные твердые вещества или жидкости, содержащие метаболиты пропионово-кислых бактерий, в дополнение к другим компонентам антибактериальной композиции по настоящему изобретению, как правило, добавляют в пищевой продукт таким образом, чтобы количество пропионово-кислых бактерий находилось в пределах от 0,01 до примерно 2,0% к массе продукта, предпочтительно примерно от 0,05 до примерно 1,0% к массе продукта и более предпочтительно примерно от 0,1 до примерно 0,75% к массе продукта. В случае, когда композицию по настоящему изобретению добавляют к сухой смеси, к которой затем добавляют жидкие компоненты и подвергают кулинарной обработке, например такой, как торт, то добавляемое количество определяется массой сухой смеси перед кулинарной обработкой.

Промышленно доступные вещества, конкретнее пастеризованные культивированные твердые вещества или жидкости, включающие метаболиты пропионово-кислых бактерий, производятся Rhodia Inc. под торговым названием MICROGARD^®. Данные продукты представляют неочищенную цельную ферментационную фракцию молока или аналогичной среды. MICROGARD^® MG 100 представляет пастеризованное культивированное сепарированное молоко, которое стандартизируют по сухому веществу сепарированного молока и высушивают распылением. MICROGARD^® MG 200 представляет пастеризованную культивированную декстрозу, которую стандартизируют по мальтодекстрину и высушивают распылением. MICROGARD^® MG 250 представляет конденсированный (замороженный или жидкий) вариант продукта на основе культивированной декстрозы.

Композиция для обработки продуктов питания по изобретению может также включать эффективное в бактерицидном аспекте количество, по меньшей мере, одного лантибиотика в качестве второго компонента. Термин «лантибиотик» был введен Schnell et al. (Nature 333:276-278 (1988)) для обозначения группы бактерицидных соединений, которые включают аминокислоту лантионин и другие не входящие в состав белков аминокислоты. Общие свойства данных бактериоцидов приведены в обзоре Kellner et al. (Eur. J. Biochem 177:53-59 (1988)), в котором отмечается, что «...антибиотики на основе полициклических полипептидов обладают высоким содержанием ненасыщенных аминокислот (дегидроаланина, дигидробутрина) и аминокислот с тиоэфирной группой (мезо-лантионина, (2S,3S,6R)-3-метиллантионина). Кроме того, в некоторых соединениях этой группы обнаружены лизиноаланин, 3-гидроксиаспарагиновая кислота и S-(2-аминовинил)-D-цистин». Лантибиотики включают низин, субтилин, пеп 5, эпидермин, галлидермин, циннамицин, Rо09-0198, дурамицин и анковенин. Данные антибиотики на основе синтезированных с помощью рибосом пептидов включают от 19 до 34 аминокислот и продуцируются различными микроорганизмами, включая виды Staphylococcus, виды Bacillus и виды Streptomyces. Кроме того, в дополнение к их уникальному составу из небелковых аминокислот их можно отличить от других антибиотиков на основе полипептидов благодаря их специфичности. Бактериоцины, в целом, и лантибиотики, в частности, характеризуются очень узким спектром действия. Так, только несколько видов бактерий чувствительны к конкретному бактериоцину в приемлемых для практики концентрациях. Это контрастирует с широким спектром действия полипептидных антибиотиков, которые активны против большинства бактерий, и «литические пептиды», обсуждаемые Jaynes et al. в опубликованной международной заявке на патент WO 89/00194, эффективны против большинства бактерий, дрожжей и даже клеток млекопитающих.

Низин, один из наиболее хорошо изученных бактериоцинов, представляет кодируемый с помощью рибосом пептид, который иногда находится в виде димера с молекулярной массой примерно 7000. Низин является собирательным названием нескольких очень близких соединений, которые имеют схожий аминокислотный состав и ограниченный спектр антибиотической активности. Данное явление обсуждается E.Lipinska в «Antibiotics and Antibiosis in Agriculture» (M.Woodbine, Ed.) pp. 103-130. Он содержит несколько необычных аминокислот, включая бета-метиллантионин, дегидроаланин и лантионин, среди 34 аминокислот в целом. В пептиде имеется пять необычных тиоэфирных связей, которые вносят вклад в сохранение его стабильности в кислых растворах. Низин имеет заметную гомологию по структуре и действию с другими лантибиотиками, например субтилином и эпидермином (Buchman et al., J. Bio. Chem. 263 (31):16260-16266 (1988)). Недавние обзоры по низину, его физическим свойствам и применениям включают «Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria», T.R.Klaenhammer, Biochimie 70:337-349 (1988), «Nisin», A.Hurst, Avd. Appl. Microbiol. 27:85-121 (1981) и патент США № 4740593.

M.Doyle сообщил о применении низина для борьбы с L. monocytogenes, «Effect of Environmental and Processing Conditions on Listeria Monocytogenes», Food Technology, 42(4):169-171 (1988). В этой статье описывается первоначальное подавление роста микроорганизма (в течение примерно 12 ч), и в ней сообщается, что L. monocytogenes может расти при таком низком значении рН, как 5,0, и он устойчив к щелочному значению рН со способностью расти при рН 9,6.

Сам по себе низин не очень эффективен в качестве антимикробного средства в такой сложной среде как продукт питания. Например, известно, что активность низина против С. botulinum, как правило, снижается в такой сложной среде, как продукты питания (Rogers and Montville, J. Food Sci., 59(3):663-668 (1994)).

Низин промышленно доступен от Rhodia Inc. в виде стандартизированного 2,5% по массе препарата под торговым названием Novasin . Когда низин добавляют в качестве компонента в антибактериальную композицию по настоящему изобретению, то он может находиться в количествах в пределах примерно от 0,5% до 10% к массе антибактериальной композиции.

Лантибиотики, включающие белки, могут также присутствовать в небольшом количестве в качестве побочного продукта в ферментационной среде при получении некоторых сортов сыра чеддер или американского сыра и в продукте на основе ферментированного сепарированного молока, известном как MICROGARD ^® MG 300. При добавлении лантибиотика в антибактериальную композицию по настоящему изобретению в виде ферментированного молочного продукта, такого как MICROGARD^® MG 300, используемое количество MICROGARD^® MG 300 может находиться в пределах примерно от 75% до примерно 95% к массе антибактериальной композиции.

На практике, когда лантибиотик используют в качестве компонента антибактериальной композиции по настоящему изобретению, лантибиотик добавляют к пищевому продукту так, чтобы он находился в концентрации в пределах примерно от 1 до примерно 100 ppm [частей на миллион (к массе пищевого продукта)] активного компонента (например, низина) с предпочтительными концентрациями в пределах примерно от 1 до примерно 12,5 ppm, основываясь на безопасности и применимости для различных продуктов питания.

В качестве альтернативы описанным выше лантибиотикам метаболит бактерий Pediococcus , в частности педиоцин, может приводить к эффективным результатам при его включении в композицию по настоящему изобретению. Кроме того, новый класс стрептококковых бактериоцинов, называемых лактицинами, особенно лактицин 3147, описанный в заявке на патент WO 96/32482, должен проявлять аналогичную активность против грамположительных бактерий. Как педиоцины, так и лактицины в основном обладают бактериостатической активностью против ограниченного ряда грамположительных бактерий.

В предпочтительном воплощении используют низин или лактицин в качестве лантибиотика в композиции по настоящему изобретению.

Другой компонент антибактериальной композиции по настоящему изобретению может быть лизирующим клеточную стенку соединением, таким как литический фермент. Данные ферменты можно использовать для остановки или предупреждения роста целевых микроорганизмов. Для литического фермента, пригодного для пищевой индустрии в качестве антибактериального компонента или средства, необходимо обладать способностью разрушать широкий ряд бактерий, в частности, приводящих к порче продуктов питания и/или патогенов.

В предпочтительном воплощении в качестве литического фермента используют лизоцим. Лизоцимы (мурамидаза; мукопептид-N-ацетилмукамоилгидролаза; 1,4-бета-N-ацетилгексозаминодаза, Е.С. 3.2.1.17) являются хорошо известными литическими ферментами, которые были выделены из различных источников, и хорошо изученными ферментами. В большинстве случаев лизоцимы получают из яичного альбумина способом экстракции пищевой категории, но также их можно получить из арктических гребешков, женского молока, слез и других естественных источников. Впервые открытый в 1922 году W.Fleming лизоцим из яичного белка был среди первых белков, для которых была определена аминокислотная последовательность, первым, для которого была установлена трехмерная структура с использованием рентгеновской кристаллографии и первым, для которого был предложен детальный механизм действия. Имеется много сведений о его антимикробной активности против грамположительных бактерий, например, у V.N.Procter et al. in CRC Crit. Reviews in Food Science and Nutrition, 26(4):359-395 (1988). Молекулярная масса лизоцима яичного белка составляет примерно 14300-14600, изоэлектрическая точка находится при рН 10,5-10,7. Он состоит из 129 аминокислот, связанных между собой четырьмя дисульфидными мостиками. Были выделены и охарактеризованы аналогичные ферменты из других источников, включая такие различные продуценты, как Escherichia coli и человеческие слезы. Несмотря на небольшие различия (например, в человеческом лизоциме имеется 130 аминокислот), способность к гидролизу полимеров ацетилгексозамина остается в основном одинаковой. Следовательно, для целей настоящего изобретения термин лизоцим предназначен для включения ферментов, разрушающих клеточную стенку или пептидогликаны, которые способны гидролизовать ацетилгексозамин или близкие полимеры.

Известно, что лизоцим приводит к гибели или подавляет рост бактерий и грибов, и используется в Европе для остановки роста Clostridium tyrobutyricum, приводящих к порче, в самых различных сырах. Также он был предложен для применения в целях предохранения от порчи других продуктов питания, и сообщалось, что он подавляет рост (в некоторых случаях приводит к гибели) Listeria monocytogenes (Hughey et al., Appl. Environ. Microbiol. 53:2165-2170 (1987)). Лизоцим, полученный из яичного альбумина с активностью примерно 20000 единиц Шугара/мг, промышленно доступен от Rhodia под торговым названием NovaGARD .

Когда лизоцим используют в качестве антимикробного средства в продуктах питания, то его добавляют в пищевой продукт в концентрации в пределах от 20 до 500 ppm по массе раствора, используемого для обработки, более предпочтительно примерно от 50 до 200 ppm, в основном для подавления роста Clostridum tyrobutyricum в зрелых сырах. Лизоцим не обладает бактерицидной активностью в этих концентрациях против других грамположительных бактерий, но его применяют в более высоких концентрациях (выше 1000 ppm, обычно 2000 ppm или выше) для разрушения клеточной стенки широкого ряда грамположительных бактерий.

Когда лизоцим добавляют в качестве компонента в антибактериальную композицию по настоящему изобретению, то он находится в количестве в пределах примерно от 0,25% до примерно 10% к массе антибактериальной композиции. Предпочтительно, когда лизоцим используется в качестве компонента антимикробной композиции по настоящему изобретению, то он находится в концентрации в пределах примерно от 50 ppm до примерно 150 ppm по массе пищевого продукта, обработанного композицией по настоящему изобретению.

Другим предпочтительным литическим ферментом, который можно использовать в композиции по настоящему изобретению, является хитиназа.

Антибактериальная композиция по настоящему изобретению также может включать органические кислоты, приемлемые для применения в пищевых продуктах, или соли этих кислот. Антибактериальная композиция может содержать отдельные кислоты или соли, или их смеси. Предпочтительные органические кислоты или соли для использования в композиции включают уксусную кислоту, ацетат натрия, диацетат натрия, ацетат калия, молочную кислоту, лактат натрия, лактат калия, пропионовую кислоту, пропионаты, включая, но не ограничиваясь пропионатом натрия и пропионатом калия, лимонную кислоту или ее соли, такие как цитрат натрия или цитрат калия, или их смеси. В более предпочтительном воплощении используют диацетат натрия в количестве в пределах примерно от 1% до примерно 25% к массе антибактериальной композиции. Предпочтительно полученный пищевой продукт, обработанный антимикробной композицией по настоящему изобретению, будет содержать примерно от 500 ppm до примерно 1500 ppm диацетата натрия.

Другие добавки, которые могут находиться в композиции по изобретению, включают, но не ограничиваются следующими веществами: дополнительными антибактериальными и/или хелатообразующими средствами, натуральными или синтетическими пряностями и/или вкусовыми веществами, красками и/или окрашивающими веществами, витаминами, минеральными веществами, пищевыми веществами, ферментами и связывающими агентами, такими как гуаровая камедь, ксантановая камедь и тому подобное. Добавление этих веществ не является решающим для успешного воплощения настоящего изобретения и должно решаться специалистами в данной области.

В особо предпочтительном воплощении антимикробная композиция настоящего изобретения включает метаболит пропионово-кислых бактерий в смеси с различными органическими кислотами или их солями, включая диацетат натрия, в сочетании с лантибиотическим бактериоцином, таким как низин или лактицин, и литическим ферментом, таким как лизоцим, для остановки роста широкого ряда грамположительных и грамотрицательных, приводящих к порче продуктов, и/или спорообразующих бактерий в пищевых продуктах.

Антимикробная композиция по настоящему изобретению может быть использована для любого пищевого продукта, который подвержен росту бактерий или разрушению бактериями. Таковые включают, но не ограничиваются молочными продуктами, фруктами и овощами, продуктами, полученными из фруктов и овощей, зерновыми и продуктами, полученными из зерновых, мясными продуктами, продуктами из птицы и морепродуктами. Предпочтительное воплощение включает обработку пищевых продуктов способами в сублетальных дозах, включая готовую к употреблению пищу, основные блюда для обеда и мясные продукты, гастрономические салаты, заправки (включая заправки для салатов), соусы и приправы, пасты, супы и продукты в асептических упаковках, а также сочетания вышеуказанного.

Антимикробная композиция по настоящему изобретению наиболее просто используется при смешивании и/или нанесении на смешиваемые пищевые продукты, но также может быть эффективной при обработке ею поверхности твердых пищевых продуктов погружением, орошением или опрыскиванием, или внесением во внутрь таких продуктов, например инъецированием. В других воплощениях антибактериальную композицию можно внести в маринад, панировку, натирку из пряностей, глазурь, смесь окрашивающих веществ и тому подобное, или в качестве ингредиента, который смешивают или включают в пищевой продукт, при этом решающим критерием является то, чтобы антимикробная композиция находилась на поверхности (включая внутренние поверхности), подверженной росту бактерий и/или разрушению бактериями. В еще одних воплощениях антимикробную композицию можно непосредственно привести в контакт с поверхностью продукта питания нанесением композиции на упаковочные материалы для продуктов питания и затем помещением упаковки на поверхность продукта питания таким образом, чтобы антибактериальная композиция контактировала с внешней поверхностью продуктов питания. Оптимальное количество, которое необходимо использовать, будет зависеть от антибактериальной композиции для конкретного пищевого продукта, который подвергается обработке, и способа, используемого для нанесения антибактериальной композиции на поверхность продукта питания, но его легко определить простым экспериментированием.

Антимикробные композиции по настоящему изобретению эффективны против грамположительных бактерий, включая, но не ограничиваясь анаэробными спорообразующими бактериями, включая виды клостридий, такие как Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium sporogenes, Clostridium tyrobutyricum и Clostridium putrefasciens; аэробными спорообразующими бактериями, включая виды бацилл, такие как Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis и Bacillus coagulans; грамположительными вегетативными патогенами, включая виды стафилококков, такие как Staphylococcus aureus; листериями, такими как Listeria monocytogenes и, наконец, приводящими к порче продуктов вегетативными бактериями из групп Micrococcus, Streptococcus и молочнокислых бактерий, включая, но, не ограничиваясь видами Lactobacillus и Leuconostoc.

Антимикробные композиции по настоящему изобретению также эффективны против грамотрицательных бактерий, включая, но не ограничиваясь Escherichia , такими как E. coli H7:0157; Campylobacter, такими как Campylobacter jejuni; Vibrio, такими как Vibrio parahaemolytica; Pectobacteria, такими как Pectobacterium carotovorum; Pseudomonas, такими как Pseudomonas fluorescens и видами Salmonella .

Кроме того, было установлено, что композиция по настоящему изобретению является эффективной для снижения числа живых бактерий в продуктах питания, содержащих более 1% жира, липидов или растворимых масел, а также продуктах питания, представляющих жировые эмульсии. Когда пищевой продукт представляет жир в водной эмульсии, то особенно выгодно включить композицию в водную фазу пищевого продукта для того, чтобы свести до минимума распределение в липидную фазу, будучи в которой, композиция будет недоступна для антибактериальной защиты пищевого продукта.

Продукты питания, обработанные композицией по настоящему изобретению, можно также обработать способами обработки в сублетальных дозах, такими как обработка теплом, облучением, давлением, ультразвуком, замораживанием, в пульсирующем электрическом поле, озоном, нитритами и т.д. Было установлено, что композиция по изобретению в сочетании с обработкой в сублетальных дозах является более эффективной для снижения числа живых бактерий в продуктах питания, чем только одна обработка. Данные продукты питания остаются стабильными при комнатной температуре в течение примерно 3 суток или дольше. При охлаждении данные продукты питания остаются стабильными в течение примерно 7 суток или дольше.

В последующих неограничивающих примерах представлен широкий ряд антимикробных композиций, которые можно использовать для предохранения продуктов питания от порчи по настоящему изобретению.

ПРИМЕРЫ

В последующих примерах будет представлена сравнительная оценка эффективности антибактериальной композиции, обозначенной СВ-1, на обезжиренном сухом молоке (NFDM) с низином (Novasin ) в качестве контроля. СВ-1 включала Novasin , MICROGARD^® MG 200, диацетат натрия и лизоцим. Компоненты данных композиций представлены ниже в таблице 1.

Таблица 1 Антибактериальные композиции
	% в смеси
Смесь	NovasinTM	MG-200®	Диацетат натрия	Лизоцим	NFDM
Контроль	8	0	0	0	92
СВ-1	2	87	10	1	0

Пример 1

Подавляющее действие антибактериальной композиции в отношении Bacillus cereus в цельном и сепарированном молоке при 30 ЕС

Цельное и сепарированное молоко стерилизовали, добавляли 2,3,5-триферилтетразолия хлорид (ТТС) (для идентификации роста бактерий по изменению цвета), и в полученную смесь высевали споры Bacillus cereus (аэробные спорообразующие бактерии) из расчета 4-5 log клеток/мл. Добавляли антибактериальную композицию (СВ-1) и Novasin в качестве контроля (контроль) в виде 10% исходных растворов (в контроле было в 4 раза более высокое количество низина по сравнению с СВ-1). Подавление роста выражали в минимальной концентрации, полностью подавляющей рост в течение данного периода времени, и значения приведены ниже в таблице 2.

Таблица 2 Эффективность композиций
Обработка	MIC* (% антибактериальной композиции, необходимый для полного подавления роста)	Концентрация Novasin (ppm)
В цельном молоке
Контроль	>4	>3200
СВ-1	3	600
В сепарированном молоке
Контроль	0,5	400
СВ-1	2	400
*MIC=минимальная ингибирующая концентрация

Чашечный подсчет B. cereus для данных композиций проводили на чашках с агаром TSA при инкубации при 30 ЕС в течение 24 ч, и результаты представлены в таблице 3 ниже.

Таблица 3 Данные чашечного подсчета Подавление роста В. cereus в цельном молоке
Обработка	КОЕ/мл
Контроль	3×10е8
Novasin	5×10е6
CB-1	1×10е4

Пример 2

Подавляющее действие антибактериальной композиции в отношении L. monocytogenes в цельном и сепарированном молоке при 25 ЕС

Цельное и сепарированное молоко стерилизовали, добавляли 2,3,5-триферилтетразолия хлорид (ТТС) (для идентификации роста бактерий по изменению цвета), и в полученную смесь высевали L. monocytogenes АТСС 19115 (вегетативный, грамположительный патоген) из расчета примерно 4-5 log клеток/мл. Добавляли антибактериальную композицию (СВ-1) и Novasin в качестве контроля (контроль) в виде 10% исходных растворов (в контроле было в 4 раза более высокое количество низина по сравнению с СВ-1). Подавление роста выражали в минимальной концентрации, полностью подавляющей рост в течение данного периода времени, и значения приведены ниже в таблице 4.

Таблица 4 Эффективность композиций
Обработка	MIC* (% антибактериальной композиции, необходимый для полного подавления роста)	Концентрация Novasin (ppm)
В цельном молоке
Контроль	4	3200
СВ-1	2	400
В сепарированном молоке
Контроль	0,5	400
СВ-1	1	100
*MIC=минимальная ингибирующая концентрация

Чашечный подсчет L. monocytogenes для данных композиций проводили на чашках с агаром TSA при инкубации при 30 ЕС в течение 24 ч, и результаты представлены в таблице 5 ниже.

Таблица 5 Данные чашечного подсчета
Обработка смеси (ppm)	КОЕ**/мл на 2 сутки при 3%	Концентрация Novasin при 3%
В цельном молоке
Необработанный контроль	2,4×10е8	0
Контроль	5,6×10е7	2400
СВ-1	5×10е5	600
В сепарированном молоке	На 2 сутки при 0,5%	На 5 сутки при 0,5%
Необработанный контроль	1,6×10е8	2,0×10е8
Контроль	1800	2,0×10е5
СВ-1	1,1×10е6	1,0×10е3 при 2%*
*В 2% СВ-1 низин содержится в той же концентрации, что и в контроле при 0,5% **КОЕ=колониеобразующие единицы (# клеток)

Пример 3

Подавляющее действие антибактериальной композиции в отношении C. sporogenes в цельном молоке при 30 ЕС

Цельное молоко стерилизовали, добавляли 2,3,5-триферилтетразолия хлорид (ТТС) (для идентификации роста бактерий по изменению цвета), и в полученную смесь высевали C. sporogenes (анаэробные, непатогенные спорообразующие бактерии) из расчета примерно 4-5 log клеток/мл. Добавляли антибактериальную композицию (СВ-1) и Novasin в качестве контроля (контроль) в виде 10% исходных растворов (в контроле было в 4 раза более высокое количество низина по сравнению с СВ-1). Чашечный подсчет C. sporogenes для данных композиций проводили затем на чашках с агаром TSA при инкубации при 30 ЕС в течение 24 ч, и результаты представлены в таблице 6 ниже.

Таблица 6
Обработка	КОЕ/мл
Контроль	2×10е8
Novasin	6×10е6
CB-1	2×10е4

Пример 4

Эффективность антибактериальной композиции в отношении замедления продукции токсинов в пищевых продуктах

10 штаммовых смесей спор протеолитических бактерий C. botulinum (анаэробные, спорообразующие патогены), имеющие примерно 100 спор/г, подвергали тепловому шоку при 88°С в течение 10 мин с продуктами. В некоторых продуктах питания было высокое содержание жира, и они включали соус Альфредо, готовые к употреблению блюда (подвергнутую кулинарной обработке грудку цыпленка в соусе), готовый к употреблению суп и свежую пасту. Пробы продуктов с внесенным посевным материалом инкубировали при 15°С или 27°С. Добавляли антибактериальную композицию (СВ-1), Novasin и в одном случае СВ-1 без лизоцима в виде 10% исходных растворов (при обработке Novasin было тоже самое количество низина, что и в СВ-1 и СВ-1 без лизоцима). Необработанные пробы продуктов использовали в качестве контроля (контроль). Пробы исследовали в трех параллелях на 0 время и на каждый период отбора проб, что зависело от конкретного продукта питания, который подвергался обработке, его рН, температуры и т.д. Для оценки наличия ботулинического токсина использовали стандартный тест на мышах, который подтверждали при применении трехвалентного ботулинического антитоксина АВЕ. Данные по эффективности этих антибактериальных композиций в отношении замедления продукции токсина в данных продуктах питания представлены ниже в таблицах 7-10.

Таблица 7 Эффективность антибактериальной композиции в замедлении продукции токсина в соусе Альфредо при рН 5,2, 27°С
Обработка	Дни для продукции токсина
Контроль	9-15
CB-1	>60

Таблица 8 Эффективность антибактериальной композиции в замедлении продукции токсина в готовом к употреблению блюде при рН 5,6, 27°С
Обработка	Дни для продукции токсина
Контроль	7-10
Novasin*	13-20
CB-1	>30
* Обработанная Novasin проба содержит то же количество низина, что и проба, обработанная СВ-1

Таблица 9 Эффективность антибактериальной композиции в замедлении продукции токсина в готовом к употреблению супе при рН 6,5, 15°С
Обработка	Дни для продукции токсина
Контроль	12-18
Novasin**	12-18
CB-1 без лизоцима	12-18
СВ-1	18-25
** Обработанная Novasin проба содержит то же количество низина, что и проба, обработанная СВ-1, и проба, обработанная СВ-1 без лизоцима

Таблица 10 Эффективность антибактериальной композиции в замедлении продукции токсина в свежей пасте при рН 6,0, 27°С
Обработка	Дни для продукции токсина
Контроль	<10
CB-1	>20

Понятно, что в отношении раскрытых здесь воплощений могут быть сделаны различные модификации. Следовательно, вышеприведенное описание не следует расценивать как ограничивающее, а только в качестве примера предпочтительных воплощений. Например, различные комбинации компонентов в описанной здесь антибактериальной композиции и ее применение для различных продуктов питания станут очевидными из или на основе вышеприведенного описания. Специалисты в данной области смогут предвидеть другие модификации, не отступая от объема и сущности прилагаемой формулы изобретения.