способ ранней диагностики перинатальных гипоксических поражений цнс у доношенных новорожденных от матерей с гестозом

Формула изобретения

Способ ранней диагностики перинатальных гипоксических поражений ЦНС у доношенных новорожденных от женщин с гестозом путем иммунологического исследования пуповинной крови, отличающийся тем, что в крови определяют соотношение показателей относительного содержания CD3+HLA-DR+ к CD3+ лимфоцитам и при его значении, равном 8,1% или более, диагностируют перинатальные гипоксические поражения ЦНС при рождении.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, и может быть использовано для ранней диагностики перинатальных гипоксических поражений ЦНС у доношенных новорожденных от женщин с гестозом.

Актуальность разработки способа определяется ростом частоты перинатальных гипоксических поражений ЦНС, высокой летальностью и инвалидизацией при них [1]. Диагностика перинатальных поражений ЦНС у новорожденных детей нередко бывает затруднена вследствие не всегда четкой и ясной картины неврологических симптомов [2]. Одной из основных причин развития перинатальных поражений ЦНС у новорожденных является гестоз у матери. Частота встречаемости данной патологии у детей, рожденных от женщин с гестозом, по литературным данным, достигает 49,9%, что в 4,8 раза выше, чем при неосложненной беременности [3]. Клинические проявления патологии ЦНС у новорожденных не всегда отражают истинную тяжесть состояния, степень поражения ЦНС и дальнейший прогноз развития ребенка [4]. Поэтому разработка способа ранней диагностики перинатальных гипоксических поражений ЦНС новорожденных является актуальной. Способ позволит диагностировать перинатальные гипоксические поражения ЦНС в первые сутки жизни, назначить адекватную терапию церебральных нарушений и предотвратить инвалидизирующие последствия.

Известен способ диагностики перинатальных поражений ЦНС у новорожденных путем проведения нейросонографии головного мозга. При наличии неврологической симптоматики у новорожденных патологические изменения по данным ультразвукового исследования головного мозга выявлены у 83% детей [Сидорова И.С., Аснис Н.П., Макаров И.О. Ультразвуковая диагностика перинатальных повреждений центральной нервной системы у плода и новорожденного. // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 1995. - №3. - С.15-18].

Недостатки способа:

1) при проведении данного способа выявляют преимущественно грубые повреждения мозговой ткани: внутрижелудочковые кровоизлияния, перивентрикулярную лейкомаляцию и остаются недоступными гипоксически-ишемические повреждения, возникающие на клеточном уровне [4];

2) существует риск некорректной интерпретации данных нейросонографии [4];

3) заключение по нейросонографии корректно осуществлять не ранее 3-го дня жизни ребенка [Пальчик А.Б., Шабалов Н.П. Гипоксически-ишемическая энцефалопатия новорожденных. СПб: Питер, 2001. - 224 с.];

4) для осуществления метода требуется специальное оборудование.

Известен способ диагностики тяжелых перинатальных гипоксических поражений ЦНС у новорожденных путем исследования в сыворотке периферической крови концентрации белка S-100 в динамике на 1-е, 3-и, 7-е, 14-е и 21-е сутки жизни. При повышении содержания белка S-100 относительно исходного уровня, превышающего норму, диагностировались тяжелые перинатальные поражения ЦНС [Голосная Г.С., Петрухин А.С., Маркевич К.А., Трифонова О.Е. Изменение уровня белка S-100 у новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС. // Педиатрия. - 2004. - №1. - С.10-15].

Недостатки способа:

1) уровень белка S-100 достоверно повышается только при тяжелых формах перинатальных поражений ЦНС, что не позволяет использовать его для диагностики перинатальных поражений ЦНС легкой и средней степени тяжести;

2) для осуществления метода требуется пятикратный забор крови, что наносит болевую травму новорожденному и может отрицательно сказаться на течении основного заболевания;

3) высокая экономическая стоимость способа (необходимость закупки дорогостоящих специальных наборов реактивов для определения уровня белка S-100 методом непрямого иммуноферментного анализа).

Наиболее близким по техническому решению является способ ранней диагностики нарушений гемоликвородинамики гипоксического генеза у новорожденных путем исследования уровня продукции моноцитами пуповинной крови интерлейкина 1 (ИЛ-1 ) и фактора некроза опухолей (ФНО- ). При нарушениях гемоликвородинамики гипоксического генеза моноциты пуповинной крови спонтанно продуцировали больше ИЛ-1 (0,746 нг/мл против 0,259 нг/мл) и достоверно больше ФНО- (1,301 нг/мл против 0,128 нг/мл) [Таболин В.А., Володин Н.Н., Дегтярева М.В., Дегтярев Д.Н. и соавт. Актуальные вопросы перинатальной иммунологии. // International Journal on Immunorehabilitation. - 1997. - № 6. - P.112-122].

Недостатки способа:

1) ИЛ-1 и ФНО- не являются специфичными показателями, т.к. их содержание может изменяться при различных патологических состояниях, в частности при сепсисе [Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Хорева М.В., Соколова Е.В. Система цитокинов, комплемента и современные методы иммунного анализа. М., 2001. - 158 с.];

2) для проведения данного метода требуется больше времени (3 часа), чем для заявляемого способа;

3) не указывается точность данного метода диагностики.

Данный способ избран нами в качестве ближайшего аналога (прототипа). Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.

Техническим решением заявляемого способа является ранняя диагностика перинатальных гипоксических поражений ЦНС у доношенных новорожденных от женщин с гестозом путем определения в пуповинной крови при рождении соотношения показателей относительного содержания CD3+HLA-DR+ к CD3+ лимфоцитам, при значении показателя, равном 8,1% или более, диагностируют перинатальное гипоксическое поражение ЦНС с точностью 89,28%.

Новизна способа

Впервые предлагается раннее (при рождении ребенка) диагностирование перинатальных гипоксических поражений ЦНС у доношенных новорожденных от женщин с гестозом по определению соотношения показателей относительного содержания CD3+HLA-DR+ к CD3+ лимфоцитам.

Мы предполагаем, что данный параметр имеет непосредственную патогенетическую связь с развитием перинатальных гипоксических поражений ЦНС, т.к. отражает изменение активации Т-лимфоцитов, которое может быть связано с развитием аутоиммунных процессов в ответ на изменение проницаемости гематоэнцефалического барьера, формирующейся в результате хронической внутриутробной гипоксии, сопровождающейся выходом в периферическую циркуляцию аутомозговых антигенов.

Повышение относительного содержания CD3+ и CD3+HLA-DR+ лимфоцитов в периферической крови отмечается при различных инфекционных заболеваниях, сопровождающихся активацией иммунного ответа с преобладанием Т×1 реакций [5]. Снижение уровня относительного содержания CD3+ лимфоцитов отмечается при Т-клеточном иммунодефиците [5], снижение относительного содержания CD3+HLA-DR+ клеток может наблюдаться при атопическом дерматите [6] и при ожирении у детей [7].

Отличительные признаки способа

Установлен диагностический параметр относительного содержания CD3+HLA-DR+ к CD3+ лимфоцитам, при значении которого, равном 8,1% или более, диагностируют поражение ЦНС у доношенных новорожденных от женщин с гестозом.

Способ осуществляется следующим образом

1. При рождении ребенка производят забор в пробирку 0,5 мл пуповинной крови.

2. Выделение лимфоцитов из пуповинной крови осуществляется стандартным методом - центрифугированием при 1500 об/мин в градиенте плотности фиколл-верографин в течение 30 минут [8].

3. В 1 пробирку, содержащую 100 мкл лимфоцитов в концентрации 1×10⁶ кл/мл, добавляют 20 мкл моноклональных анти-CD3 AT, меченных FITC или РЕ, в другую пробирку добавляют 20 мкл моноклональных анти-CD3 AT, меченных FITC или РЕ и 20 мкл моноклональных анти-HLA-DR AT меченных FITC или РЕ (в зависимости от первой метки). Клетки инкубируют с моноклональными антителами в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте, после чего отмывают 1 раз 1 мл физиологического раствора центрифугированием при 1500 об/мин в течение 2 минут. Клетки в пробирках ресуспендируют в 500 мкл физиологического раствора [9].

4. Учет реакции проводят на проточном цитометре, определяя в лимфоцитарном гейте процентное (относительное) содержание CD3+ и CD3+HLA-DR+ клеток.

5. Рассчитывается соотношение показателей относительного содержания CD3+HLA-DR+ к CD3+ клеткам. При значениях показателя, равных 8,1% или больших, диагностируют перинатальное поражение ЦНС с точностью 89,28%.

6. Способ осуществляется в течение 1 часа 10 минут.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.

Пример 1. Ребенок Г. родился от I беременности, протекавшей на фоне ожирения II, анемии I степени, осложнившейся гестозом средней степени тяжести. Своевременные I роды в 40 недель. Оценка по шкале Апгар 5-6 баллов. Масса тела при рождении 3600 г, рост 56 см. Общее состояние средней степени тяжести с момента рождения. Двигательная активность снижена, крик громкий. Отмечается мышечная гипотония, тремор конечностей, акроцианоз. Большой родничок 2×2 см.

При рождении по заявляемому способу в пуповинной крови определялось содержание CD3+, равное 44,3%, и CD3+HLA-DR+ клеток, равное 16,6%, и определено соотношение CD3+HLA-DR+ к CD3+, которое составило 37,5%, что выше заявляемого (8,1%) уровня. Заключение: диагностируется перинатальное поражение ЦНС.

На третьи сутки жизни проведена нейросонография. На основании полученных данных и с учетом клинической картины был поставлен диагноз: хроническая внутриутробная гипоксия плода, перинатальное поражение ЦНС, церебральная ишемия II степени гипоксически-ишемического генеза, гипертензивный синдром, синдром нейрорефлекторной возбудимости.

Таким образом, способ ранней диагностики перинатальных гипоксических поражений ЦНС у новорожденных от женщин с гестозом по предложенному методу подтвердился.

Пример 2. Ребенок Б. родился от VII беременности, осложнившейся угрозой прерывания в 12 недель, ОРВИ в 36 недель, гестозом легкой степени тяжести. Своевременные II роды в 38 недель. Оценка по шкале Апгар 8-9 баллов. Масса тела при рождении 2800 г, рост 48 см. Большой родничок 2,5×2,5 см. Состояние ребенка при рождении оценено как удовлетворительное. При рождении по заявляемому способу в пуповинной крови определялось содержание CD3+, равное 44,6%, и CD3+HLA-DR+ клеток, равное 3,0%, и определено соотношение CD3+HLA-DR+ к CD3+, которое составило 6,7%, что ниже заявляемого (8,1%) уровня. Заключение: перинатальное поражение ЦНС не диагностируется. На протяжении неонатального периода при осмотре неонатолога и невролога ребенок здоров.

Таким образом, способ ранней диагностики перинатальных гипоксических поражений ЦНС у новорожденных от женщин с гестозом по предложенному методу подтвердился.

Пример 3. Ребенок Л. родился от III беременности, осложнившейся ОРВИ в 6-7 недель, угрозой прерывания в 25 и 36 недель, гестозом легкой степени тяжести. Своевременные III роды в 38-39 недель. Оценка по шкале Апгар 7-8 баллов. Масса тела при рождении 3000 г, рост 50 см. Большой родничок 1×1 см. В первые сутки жизни состояние ребенка удовлетворительное.

При рождении по заявляемому способу в пуповинной крови определялось содержание CD3+, равное 64,2%, и CD3+HLA-DR+ клеток, равное 5,2%, и определено соотношение CD3+HLA-DR+ к CD3+, которое составило 8,1%, что соответствует заявляемому (8,1%) уровню как критерию ранней диагностики перинатальной патологии ЦНС.

На 2 сутки жизни состояние ребенка ухудшилось до средней тяжести, появилась гипервозбудимость, тремор подбородка и рук, акроцианоз. На основании клинической картины и данных нейросонографии поставлен диагноз: хроническая внутриутробная гипоксия плода, перинатальное поражение ЦНС, церебральная ишемия I степени гипоксически-ишемического генеза, гипертензивный синдром, синдром нейрорефлекторной возбудимости.

Таким образом, способ ранней диагностики перинатальных гипоксических поражений ЦНС у новорожденных от женщин с гестозом по предложенному методу подтвердился.

Преимущества способа

1. Возможность ранней (при рождении) диагностики перинатальных гипоксических поражений ЦНС у доношенных новорожденных от женщин с гестозом позволит назначить адекватную терапию церебральных нарушений и предотвратить инвалидизирующие последствия.

2. Заявляемый способ не требует больших временных затрат и осуществляется 1 час 10 мин.

3. Исследование может быть проведено в любое время суток.

4. Предлагаемый способ имеет высокую точность - 89,28%.

5. Исследуется малый объем крови (0,5 мл).

6. Предлагаемый способ нетравматичен.

Указанным способом обследовано 28 новорожденных детей, рожденных от женщин с гестозом.

Результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1
Результаты исследований
Количество обследованных	28
Истинно положительные результаты	16
Истинно отрицательные результаты	9
Ложноположительные результаты	2
Ложноотрицательные результаты	1
Точность способа	89,28%
Чувствительность способа	94,10%
Специфичность способа	81,82%

Литература

1. Скворцов И.А., Руденская Г.Е., Осипенко Т.Н и др. // Журнал невропатологии и психиатрии. - 1990. - Т.90. - №8. - С.5-10.

2. Барашнев Ю.И. Гипоксическая энцефалопатия: гипотезы патогенеза церебральных расстройств и поиск методов лекарственной терапии. // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2002. - №1. - С.6-13.

3. Афанасьева Н.В., Стрижаков А.В. Исходы беременности и родов при фетоплацентарной недостаточности различной степени тяжести. // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2004. - Т.3. - №2. - С.7-13.

4. Баканов М.И., Алатырцев В.В., Подкопаев В.Н. Новые биохимические критерии диагностики и прогноза перинатальных поражений ЦНС у новорожденных детей. // Педиатрия. - 1999. - №6. - С.33-37.

5. Барашнев Ю.И. Гипоксически-ишемическая энцефалопатия новорожденных: вклад перинатальных факторов, патогенетическая характеристика и прогноз. // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 1996. - №2. - С.29-35.

6. Справочник по иммунотерапии для практического врача. - СПб.: Диалог, 2002. - 478 с.

7. Булина О.В., Калинина Н.М. Исследования иммунного статуса у детей, больных атопическим дерматитом. // Медицинская иммунология. - 2002. - Т.4. - №2. - С.174.

8. Гришкевич Н.Ю., Манчук В.Т., Савченко А.А. Изменения в популяционном и субпопуляционном составе иммунокомпетентных клеток у детей различной формы ожирения. // Медицинская иммунология. - 2004. - Т.6. - №3-5. - С.283-284.

9. Boum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood and bone marrow // Scand. J.Clin. Invest. - 1968. - V.21 - № 97. - P.77.

10. Ohta G., Fujiwara K., Nishi Т., Oka H. Normal values of peripheral lymphocyte populatuon and Т cell subsets at a fixed time of day: A flow cytometric analysis with monoclonal antibodies in 210 healthy adults // Clin. Exp. Immunol. - 1986. - V.64. - P.146-149.