способ снятия барьера гистонесовместимости при ксеногенной клеточной терапии

Формула изобретения

Способ снятия барьера гистонесовместимости при ксеногенной клеточной терапии, включающий получение клеток, свободных от антигенов гистосовместимости и последующую их трансплантацию реципиенту, отличающийся тем, что свободные от антигенов гистосовместимости клетки получают путем гибридизации соматических клеток разных видов животных, которые культивируют в среде Игла с добавлением 2%-ной фертильной сыворотки крупного рогатого скота, 5%-ной сыворотки крупного рогатого скота, 2 mM L-глутамина и антибиотика-антимикотика из расчета 10 мкл/мл, содержащего в 1 мл 10 ИЕ пенициллина, 10 мг стрептомицина и 25 мкг амфотерицина В, в атмосфере с 5% CO ₂, а для получения хромосомных препаратов клетки рассевают с коэффициентом рассева 1:3, через 24 ч получают монослой, добавляют колхицин из расчета 1 мкг/мл, выдерживают 3 ч при 37°С, затем снимают клетки с субстрата с помощью раствора Версена и 0,25%-ного раствора трипсина в соотношении 9:1 и полученные клетки вводят реципиенту.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к клеточной инженерии, в частности к способам снятия барьера гистологической несовместимости при клеточной терапии.

Использование клеток животных в последние годы находит широкое применение в клеточной терапии человека. В отличие от аллогенной терапии с использованием клеток того же вида полностью исключается риск перерождения этих клеток в раковые клетки. Однако, с другой стороны, вследствие гистонесовместимости возникает проблема поддержания жизнедеятельности таких клеток после их введения в организм человека.

Одним из известных способов преодоления барьера гистонесовместимости является метод создания иммунологической депрессии путем дренирования грудного протока, результатом которого является уменьшение количества иммунокомпетентных клеток (Вершигора А.Е. Основы иммунологии. - 1980. - 503 с.). Однако это может привести к злокачественным новообразованиям, инфекционным заболеваниям и другим патологическим процессам, являющимися противопоказаниями при трансплантации клеточного материала.

Известно ингибирующее влияние на реакцию клеточного иммунитета антилимфоцитарной сыворотки, достигаемое путем введения Т-антисыворотки, специфичной к Т-лимфоцитам донора в больших дозах. При этом реципиенту вводятся иммунодепрессанты или стероиды, оказывающие супрессирующее действие на макрофаги и антигенпредставляющие клетки и снижающие экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) (Ройт А. Основы иммунологии. - 1991. - 327 с., Денисов В.К., Голубова Т.С. Эффективность антитимоцитарного глобулина в профилактике и лечении отторжения после трансплантации почки // Трансплантология. Т. 7, №3. 2004. - С.82-83). Однако этот метод связан с применением большого количества белоксодержащих препаратов, которые сами по себе могут вызвать негативную реакцию организма.

Известен способ использования в клеточной терапии клеток, трансформированных генами, кодирующими синтез молекул ГКГ, с помощью чего создаются линии клеток, к которым иммунная система реципиента будет толерантна (Tachibana К., Nakajima Т., Sato A., Igarashi К. et al. CXCR4/fusin Is Not a Species-specific Barrier in Murine Cells for HIV-1 Entry // Exp.Med. Volume 185, Number 10, May 19, 1997. - P.1865-1870, Сингер М., Берг П. Гены и геномы. T.1. 1998. - С.115-130, Сухих Г.Т. Бюллетень экспериментальной биологической медицины. Т.126. Прил.1. 2001. - С.3-13).

Известен способ преодоления барьера гистонесовместимости при клеточной терапии посредством ингибирования активности Т-лимфоцитов с использованием радиоактивного излучения, влияющего на процессы их пролиферации и дифференцировки (Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. 2000. - 582 с.). Этот метод является результативным, но опасным в плане применения радиоактивного излучения.

Известен способ предотвращения отторжения путем введения препаратов тканей хориона, клетки которого обладают выраженным иммуносупрессивным действием на организм реципиента (Садлер Т.В. Медична ембрiология за Лангманом. - 2000. - 518 с.). Этот метод позволяет частично заблокировать действие Т-лимфоцитов, главных участников иммунного ответа при попадании чужеродных агентов, однако проблема несовместимости клеток донора с клетками реципиента использованием данного способа полностью не решается.

Прототипом изобретения является известный способ снижения барьера гистонесовместимости при клеточной терапии, основанный на получении клеток, свободных от антигенов гистосовместимости, путем очищения от стромальных ретикулярных клеток и последующей трансплантации эмбриональных клеток реципиенту (Khosrotehrani К., Johnson K.L., Cha D.H. et al. Transfer of fetal cells with multilineage potential to maternal tissue // JAMA. 292(1). Jul 7. 2004. - P.104-105). В результате пересаживаемый материал, лишенный антигенов гистосовместимости, позволяет уменьшить реакции иммунного отторжения. Недостатком метода является то, что, как правило, в данном случае используются собственные клетки больного, что не всегда является возможным.

Целью настоящего изобретения явилась разработка способа, позволяющего снизить барьер гистонесовместимости клеток доноров и клеток реципиентов при клеточной терапии.

Технический результат изобретения заключается в том, что предложен способ преодоления барьера гистонесовместимости при ксеногенной клеточной терапии, включающий получение клеток, свободных от антигенов гистосовместимости, и последующую их трансплантацию реципиенту, отличающийся тем, что свободные от антигенов гистосовместимости клетки получают путем гибридизации соматических клеток разных видов животных.

Пример. Были использованы гибридные линии ПО-ЛК-3 (ТК^- почки овцы и лимфоциты кролика), БК-ПО ТК^- ( -клетки кролика и ТК^- почки овцы), полученные в отделе клеточной биотехнологии ВИЭВ. Кариотип и антигенные свойства этих клеток определяли следующим способом:

1) обе линии гибридных клеток культивировали в среде Игла с добавлением 2% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FCS), 5% сыворотки крупного рогатого скота, 2 mM L-глутамина и антибиотика-антимикотика из расчета 10 мкл/мл, содержащего в 1 мл 10 ИЕ пенициллина, 10 мг стрептомицина и 25 мкг амфотерицина В, в атмосфере с 5% СО₂;

2) для получения хромосомных препаратов клетки рассевали с коэффициентом рассева 1:3, через 24 ч получали монослой, добавляли колхицин из расчета 1 мкг/мл, выдерживали 3 ч при 37°С, затем снимали клетки с субстрата с помощью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 9:1. Дальнейшую подготовку препаратов для кариологического исследования проводили согласно методике (Кленовицкий П.М., Грезина Н.М. Получение и анализ хромосомных препаратов гибридных клеток // Школа-практикум «Методы исследований в биотехнологии сельскохозяйственных животных». Вып.3. - Дубровицы, 2004. - С.46-52);

3) выращенные гибридные клетки вводили в дозе 1 млн на семенник хрячкам, кроликам и 0,5 млн на семенник мышам. Через 7, 14, 21, 28 дней проводили кастрацию самцов с последующим истощением тканей семенников. Накопленные клетки in vitro, а также небольшой кусочек свежего семенника были протестированы ПЦР-анализом на наличие овечьих клеток;

4) гибридные клетки в дозе 1 млн вводили в мочку уха поросят. Анализ присутствия гибридных клеток проводили путем отбора материала через 7, 14, 21 день, трипсинизации тканей и последующего культивирования с проведением цитогенетического исследования;

5) для прижизненного окрашивания гибридных клеток, а также исходных клеток (ТК^-ПО, лимфоциты кролика) использовали витальный краситель Hoechst 33342, связывающийся с ДНК клеток и способный светиться в ультрафиолетовом свете. Для этого после накопления клеток in vitro с них сливали культуральную жидкость, промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и добавляли подогретую среду DMEM с 2% FCS и 10 mM HEPES, дополненную Hoechst 33342 с конечной концентрацией 5 мкг/мл. Окрашивание производили в течение 30 мин при 37°С, после чего клетки собирали и вводили 2-3 дневным хрячкам в дозе 3-5 млн на семенник;

6) проводили иммуноцитохимический анализ культуры ПО-ЛК-3 и первично-перевиваемой культуры селезенки новорожденных кроликов на наличие видоспецифических иммуноглобулинов, локализующихся преимущественно на мембранах лимфоцитов. Для этого культивировали гибридные линии и клетки селезенки 36-48 часов, после ростовую среду сливали, промывали средой DMEM и фиксировали в течение 15 мин охлажденным метанолом. Затем промывали ФСБ и инкубировали с первичными антителами, меченными пероксидазой, против Ig G кролика в концентрации 1:8000 в течение часа при 37°С, после чего в качестве вторичных антител применяли антитела против Ig G козы (1:8000). Для окрашивания комплекса антитело-антиген использовали краситель АЕС, дающий в положительном случае характерную красную окраску;

7) проверяли цитотоксическое действие сыворотки человека в присутствии комплемента человека и кролика на гибридные клетки. Для этого проводили культивирование изучаемых линий в сыворотках разных людей с добавлением комплемента.

Контрольное использование предложенного способа для преодоления барьера гистонесовместимости клеток донора и клеток реципиента при клеточной терапии показало, что гибриды ПО-ЛК-3, БК-ПО ТК^- в большинстве случаев не распознаются организмом животных как чужеродные клетки и не лизируются разными сыворотками человека в присутствии комплемента.

В культуре клеток ПО-ЛК-3 визуализировался в основном один тип клеток - эпителиоподобные клетки, а в культуре БК-ПО ТК ^- отмечалось два типа клеток - круглые и эпителиоподобные клетки с преобладанием последних.

Обе гибридные линии несут полный или неполный набор хромосом, как овцы, так и кролика, меняющийся в зависимости от количества пассажей.

В культуре ПО-ЛК-3 обнаружено от 88 до 142 хромосом. При выборочном кариотипировании отмечено, что в гибридных клетках отсутствует часть метацентрических и субметацентрических хромосом кролика, но присутствуют дополнительные акроцентрические хромосомы овцы (фиг.1). Диплоидный набор хромосом гибридной клетки ПО-ЛК-3, представленной на фигуре 1, составил 116, среди них отмечено 6 двуплечих хромосом овцы (а); 30 двуплечих хромосом кролика (b) с выявленной нулисомией по 11-й и 17-й парам; XY половые хромосомы кролика (с); XY половые хромосомы овцы (d); 70 акроцентрических хромосом (е), точная идентификация которых в силу малых размеров затруднена; по одной дополнительной хромосоме: 1-я хромосома кролика (f, 1), 2-я хромосома кролика (f, 2), 5-я или 6-я хромосома кролика (f, 3); 3 аберрантные хромосомы (g).

Среди гибридов БК-ПО ТК- преобладали клетки с числом хромосом от 76 до 124, отсутствовала часть метацентрических и субметацентрических хромосом кролика, а также отмечалась утеря крупных акроцентриков. Но число акроцентрических хромосом выше, чем сумма одноплечих хромосом у обоих видов (фиг.2). Диплоидный набор хромосом представленной на фигуре 2 гибридной клетки БК-ПО ТК- составил 102, среди которых 6 двуплечих хромосом овцы (а); 27 двуплечих хромосом кролика (b) с выявленной нулисомией по 8-й паре, моносомией по 5-й, 11-й, 13-й, 14-й и 17-й парам; XY половые хромосомы кролика (с); XY половые хромосомы овцы (d); 65 акроцентрических хромосом (е) с нулисомией по 2-паре хромосом овцы, моносомией по 3-й паре хромосом овцы и трем парам средних и мелких акроцентриков, точная идентификация акроцентриков кролика в силу малых размеров была затруднена.

В клетках с числом хромосом менее 54 (диплоидное число хромосом овцы) наблюдается утеря большинства кроличьих хромосом и части хромосом овцы (фиг.3). Кариотип гибридной клетки БК-ПО ТК^-, 2n=46 представлен 4 двуплечими хромосомами овцы с моносомией по 1-й и 2 парам) (а); 11 двухплечими хромосомами кролика с нулисомией по 2-й, 3-й, 4-й, 8-й, 9-й, 10-й, 13-й, 14-й и 15-й парам, моносомией по 1-й, 4-й, 7-й, 11-й, 12-й, 16-й и 17-й парам) (b); 29 акроцентрическими хромосомами (с) и 2 аберрантными хромосомами неясной природы (d).

Через 14, 21, 28 дней после введения ПО-ЛК-3 ПЦР-анализом установлено, что гибридные клетки сохранялись в семенниках хрячков, не вызывая при этом какой-либо внешней реакции на чужеродный белок, т.е. не развивалось воспаление. В семенниках кролика и мыши были обнаружены через 7 дней после введения гибридные клетки БК-ПО ТК ^-.

Среди свиных клеток, выделенных из уха через 14 дней и прокультивированных, были обнаружены клетки с хромосомами овцы и кролика.

В семенниках хрячков, кастрированных через 12 дней после введения меченых гибридных и исходных клеток, обнаружены клетки обеих линий гибридов (фиг.4). Гибридные клетки, меченные витальным красителем Hoechst 33342, флуоресцировали в ультрафиолетовом свете с длиной волны 360 нм. На фигуре 4 БК-ПО ТК ^- и ПО-ЛК-3 в ультрафиолетовом (а, в соответственно) и в обычном свете (б, г соответственно).

От ТК ^-ПО обнаруживались лишь обломки клеток, в то время как лимфоциты кролика вообще обнаружены не были, отсутствовало свечение клеток, выделенных из контрольного семенника.

Иммуноцитологическим методом в культуре ПО-ЛК-3 кроличьих клеток (лимфоцитов) обнаружено не было, в то время как среди клеток селезенки присутствовали положительно окрашенные лимфоциты.

Клетки ПО-ЛК-3 в присутствии комплемента человека лизировались на 57-80%, БК-ПО ТК ^- - на 32-60%. Сыворотка крови, а также комплемент кролика полностью лизировали гибридные клетки обеих линий. Сыворотка крови человека во всех случаях агглютинировала лимфоциты кролика. Исходные клетки ТК^-ПО лизировались на 45-50%.

Предлагаемый способ позволяет снизить барьер гистонесовместимости без использования иммунодепрессантов и иных дополнительных компонентов, что является практически значимым при клеточной терапии.

Изобретение может быть использовано в биотехнологии, в частности клеточной инженерии для преодоления барьера гистнесовместимости при клеточной терапии животных и человека.