способ клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца

Формула изобретения

Способ клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца, заключающийся в инкубировании клеток, помещенных в культуральную среду в СО₂-инкубатор при 37°С, 5% СО₃ и 100%-ной влажности воздуха, отличающийся тем, что сердечную мышцу лабораторных животных предварительно подвергают механической и ферментативной диссоциации, затем полученные клеточные элементы помещают в культуральную среду, а в качестве культуральной среды используют смесь следующего состава: 90% среды DMEM, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 6 г/л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 8000 МЕ/л гепарина, 25 мг/л инсулина, 20 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 10 нг/мл интерлейкина-6, 25 нг/мл фактора роста фибробластов, 10 нг/мл эндотелиального фактора роста- , и инкубируют в течение 7-14 сут.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицине и касается способа клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца.

Известно большое количество способов культивирования in vitro клеточных элементов многих тканей в культуральных средах различного состава, с различными добавками, при этом чаще всего используют инкубацию клеточного материала в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха [1, 2].

Однако недостатком существующих способов является то, что их использование не дает возможности клонировать in vitro региональные клетки-предшественники, находящиеся в сердечной мышце взрослого организма.

Разработка данного способа является актуальной задачей, решение которой необходимо для проведения фундаментальных исследований по изучению пролиферативно-дифференцировочного баланса регионарных сердечных стволовых клеток in situ и закономерностей их функционирования и жизнедеятельности, а также для изучения влияния на данные элементы имеющихся в лечебной практике препаратов и создания новых средств, стимулирующих данную фракцию резидентных клоногенных клеточных элементов сердца с целью повышения эффективности терапии сердечных заболеваний.

Задачей, решаемой данным изобретением, является создание способа клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца взрослого организма.

Поставленная задача достигается тем, что клеточные элементы диссоциированной с помощью механической и ферментативной обработки сердечной мышцы лабораторных животных (мышей) помещают в культуральную среду следующего состава: 90% среды DMEM, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 6 г/л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 8000 МЕ/л гепарина, 25 мг/л инсулина, 20 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 10 нг/мл интерлейкина-6, 25 нг/мл фактора роста фибробластов, 10 нг/мл эндотелиального фактора роста- и инкубируют в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 7-14 сут.

Новым в предлагаемом способе является использование последовательной механической и ферментативной диссоциации сердечной мышцы и состав культуральной среды.

Заболевания сердца и сердечно-сосудистой системы являются наиболее распространенными во всем мире и занимают ведущее место в структуре заболеваемости и смертности населения нашей страны. Опасность для здоровья и социальная значимость данных заболеваний определяют необходимость постоянной разработки новых эффективных патогенетически обоснованных методов их фармакологической терапии и профилактики. Известно значительное количество медикаментозных и немедикаментозных способов профилактики и лечения заболеваний сердца с разнонаправленными механизмами действия. Вместе с тем благодаря развитию клеточных технологий на сегодняшний день и связанному с этим обнаружением в различных органах резидентных мультипотентных стволовых клеток (назначением которых является регенерация тканей в ответ на физиологическую убыль клеток, либо их гибель, вызванную повреждающим фактором) [3], появилась возможность создания новых патогенетически обоснованных методов лечения, в том числе болезней сердца [4], основанных на стимуляции пролиферации и дифференцировки стволовых клеток. Однако, как было описано выше, для разработки таких методов необходим способ клонирования регионарных клеток-предшественников сердца, позволяющий изучать действие на них различных препаратов и веществ в условиях in vitro.

Факт применения культуральной среды из используемых компонентов и их концентрация, в том числе добавление в среду указанной совокупности полифункциональных цитокинов, представляющих собой раннедействующие ростовые факторы, с разнонаправленными механизмами действия на функциональное состояние клеточных элементов, и использование сочетания механической и ферментативной обработки сердечной мышцы с целью ее диссоциации, с достижением нового результата: создание способа клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца взрослого организма, для специалиста является не очевидным.

Используемый в предлагаемом изобретении способ диссоциации мышечной ткани и состав среды в совокупности являются оптимальными для клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца взрослого организма.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не являющиеся очевидными для специалиста и не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют клонировать in vitro регионарные клетки-предшественники сердца взрослого организма, и предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение для создания новых способов лечения болезней сердца. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему чертежей.

На фиг.1А - гетерогенная колония, выросшая на 7-е сут культивирования (микрофото нативного препарата), ув. 250 х; на фиг.1 Б - сплошной рост гетерогенных клеток на 14-е сут культивирования (микрофото нативного препарата), ув. 250 х.

На фиг.2А - рост множества миоцитоподобных двухядерных клеточных элементов (микрофото гистологического препарата культуры на 14-е сут), окраска гематоксилин-эозин, ув. 250 х; на фиг.2Б - миоцит (микрофото гистологического препарата культуры на 14-е сут), окраска гематоксилин-эозин, ув. 600 х;

Способ осуществляют следующим образом:

Сердечную мышцу лабораторных животных (мышей) диссоциируют на отдельные клеточные элементы с помощью механической и ферментативной обработки, затем полученную взвесь клеток помещают в культуральную среду следующего состава: 90% среды DMEM, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 6 г/л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 8000 МЕ/л гепарина, 25 мг/л инсулина, 20 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 10 нг/мл интерлейкина-6, 25 нг/мл фактора роста фибробластов, 10 нг/мл эндотелиального фактора роста- и инкубируют в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 7-14 сут.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши) в количестве 20 шт, массой 18-20 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

Пример 1.

Способ осуществляют следующим образом. У мыши линии СВА/ CaLac, массой 20 г, умерщвленной с помощью дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом, в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром) извлекали сердце. Сердце дважды отмывали от эритроцитов в физиологическом растворе. Затем сердечную мышцу измельчали с помощью ножниц и помещали на 10 мин в раствор ЭДТА, содержащий 1,25 мг/мл трипсина, при комнатной температуре. После этого материал диссоциировали до получения клеточной взвеси, сначала путем пипетирования инкубационной среды при помощи шприца через иглу диаметром 2 мм в течение 5 мин, а затем с помощью гомогенизатора. После чего клеточный материал фильтровали через капроновую сеточку для удаления крупных агрегатов, дважды отмывали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5-10 мин и подсчитывали общее количество нуклеаров, определяя их жизнеспособность с помощью трипанового синего. Затем клетки помещали в среду следующего состава: 90% DMEM ("Serva", ФРГ), 10% инактивированной ЭТС ("Sigma", США), 6 г/ л глюкозы, 280 мг/л L-глугамина ("Sigma", США), 50 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ), 8000 МЕ/л гепарина ("Biochemie", Австрия), 25 мг/л свиного многокомпонентного инсулина ("Novo Nordisk", Дания), 20 нг/мл фактора роста стволовых клеток ("Sigma", США), 10 нг/мл интерлейкина-6 ("Sigma", США), 25 нг/мл основного фактора роста фибробластов ("Sigma", США), 10 нг/мл эндотелиального фактора роста- ("Sigma", США). Доводили концентрацию клеточных элементов до 200 тыс/мл и по 3 мл приготовленной взвеси помещали в пластиковые 6-луночные планшеты ("Costar", США). Культуру инкубировали в течение 7-14 сут в СО ₂ инкубаторе ("Jouan", Франция) при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха. После инкубации с помощью бинокулярного микроскопа МБС-9 (ув.56х) подсчитывали число колоний, содержащих миоцитоподобные клетки. Под колонией подразумевали образование, содержащее более 30 клеток (фиг.1). Проинкубированный клеточный материал в планшете фиксировали метанолом и окрашивали гематоксилином-эозином в течение 30-40 мин, после чего препараты изучали под иммерсией (фиг.2).

Предлагаемый способ позволяет in vitro клонировать регионарные клетки-предшественники сердца взрослого организма.

Источники информации

1. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.

2. Gritti A., Bonfanti L., Doetsch F., Caille I., Alvarez-Buylla A., Daniel A. Lim, Galli R., Jose Manuel Garcia Verdugo, Daniel G. Herrera, Vescovi A.L. Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents // J. Neuroscience. - 2002. - V.22. - P.437-445.

3. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. Современные взгляды на проблему стволовых клеток и возможности их использования в медицине // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - №4. - С.184-199.

4. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Anversa P. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival //Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. - V.98. - P.10344.