вакцина поливалентная против псевдомоноза сельскохозяйственных животных

Формула изобретения

Вакцина поливалентная против псевдомоноза сельскохозяйственных животных, включающая инактивированные антигены, консервант и адъювант, отличающаяся тем, что в качестве антигенов содержит суспензию клеток чистых культур возбудителя Pseudomonas aeruginosa, принадлежащих к десяти серогруппам №18(O1); №47(O2); №37(O3); №19(O4); №2(O6); №13(O10); №70(O11); №66(O13); №29(O18); №28(O19), полученных путем отбора паренхиматозных пораженных органов от павших животных из местного эпизоотического очага, посева на дифференциально-диагностические среды, выделения чистых культур возбудителей, выращивание которых проводят раздельно в мясопептоном бульоне и агаре до концентрации каждой серогруппы микробных клеток 9,5-10,5 млрд в 1 мл, а затем смешивают в равных соотношениях, вносят в качестве консерванта формалин, а в качестве адъюванта - гидроокись алюминия при следующем соотношении компонентов, мас.%:

суспензия клеток чистой культуры возбудителя Pseudomonas aeruginosa десяти серогрупп №18(O1); №47(O2); №37(O3); №19(O4); №2(O6); №13(O10); №70(O11); №66(O13); №29(O18); №28(O19), выделенного из местного эпизоотического очага в питательной среде с титром 9,5-10,5 млрд микробных клеток в 1 мл 84,6-89,5; формалин 0,4-0,5; гидроокись алюминия остальное.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к вакцинам, и может быть использовано в учреждениях, занимающихся созданием вакцинных препаратов.

Известна мукоидная экзополисахаридная вакцина против PSEUDOMONAS AERUGINOSA (см. заявка ЕПВ (ЕР) №0120532, кл. А61К 39/104, 1984), которая индуцирует иммунную реакцию на многочисленные штаммы Pseudomonas aeruginosa.

Известна вакцина против псевдомоноза норок, содержащая в качестве инактивированных антигенов суспензии штаммов Pseudomonas aeruginosa, принадлежащие к серотипам О5; О6; О8 и О11, консервант и адъювант (см. Временное наставление по применению поливалентной формол-гидроокисьалюминиевой вакцины против псевдомоноза норок, Москва, 1984 г. - прототип).

Известные вакцины не обеспечивают достаточную эффективность профилактических мер против заболеваний, вызванных возбудителем Pseudomonas aeruginosa.

Техническим решением задачи является повышение эффективности профилактических мер против заболеваний сельскохозяйственных животных, вызванных возбудителем Pseudomonas aeruginosa и расширение спектра действия.

Поставленная задача достигается тем, что в вакцине поливалентной против псевдомоноза сельскохозяйственных животных, включающей инактивированные антигены, консервант и адъювант, согласно изобретению в качестве антигенов содержит суспензию клеток чистых культур возбудителя Pseudomonas aeruginosa, принадлежащих десяти серогруппам №18(О1); №47(О2); №37(О3); №19(О4); №2(О6); №13(О10); №70(О11); №66(О13); №29(О18); №28(О19), полученных путем отбора парэнхимотозных пораженных органов от павших животных из местного эпизоотического очага, посева на дифференциально-диагностические среды: выделения чистых культур возбудителей, выращивание проводят раздельно в мясопептонном бульоне и агаре до концентрации каждой серогруплы микробных клеток 9,5-10,5 млрд в 1 мл, смешивают в равных соотношениях, вносят в качестве консерванта формалин, а в качестве адъюванта - гидроокись алюминия при следующем соотношении компонентов, мас.%:

суспензия клеток чистой культуры возбудителя Pseudomonas aeruginosa десяти серогрупп №18(О1); №47(О2); №37(О3); №19(О4); №2(О6); №13(О10); №70(О11); №66(О13); №29(О18); №28(О19), выделенного из местного эпизоотического очага в питательной среде с титром 9,5-10,5 млрд микробных клеток в 1 мл 84,6-89,5;

формалин 0,4-0,5;

гидроокись алюминия остальное.

Новизна заявляемого технического решения обусловлена тем, что за счет использования суспензии клеток чистой культуры возбудителя Pseudomonas aeruginosa десяти серогрупп в качестве бактериального сырья обеспечивается повышение иммуногенной активности и расширение спектра иммунной защиты у животных, а использование гидроокиси алюминия в определенной концентрации обеспечивает у привитых животных формирование напряженного и длительного иммунитета. Кроме того, после введения предлагаемой вакцины у животных не возникает поствакциональных осложнений.

По данным научно-технической и патентной литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность компонентов, позволяющая получить технический результат, который ранее не достигался известными средствами, что позволяет судить об изобретательском уровне заявляемого предложения.

Предложенная вакцина соответствует критерию "промышленная применимость", поскольку воспроизводима, проста в исполнении и доступна.

Вакцину поливалентную против псевдомоноза сельскохозяйственных животных получают следующим образом.

Для изготовления серии поливалентной вакцины против псевдомоноза животных каждый раз используют отдельные ампулы с лиофилизированными культурами Pseudomonas aeruginosa штаммов десяти серогрупп №18(О1); №47(О2); №37(О3); №19(О4); №2(О6); №13(О10); №70(О11); №66(О13); №29(О18); №28(О19) (см. "Отчет о работе отделения ветеринарной медицины Российской академии сельскохозяйственных наук за 2001-2005 годы", М., 2006 г.).

Культуры в ампулах ресуспендируют до первоначального объема стерильным мясопептонным бульоном и дробно высеивают на (мясопептонном агаре) МПА в чашках Петри и инкубируют 18-24 часа при 37-37,5°С. Рост вакцинных штаммов на (мясопептонном агаре) МПА и (мясопептонном бульоне) МПБ в пробирке должен быть типичным для возбудителя псевдомоноза с выраженной продукцией пигмента пиоцианина. В мазках, окрашенных по Граму, - средней величины грамотрицательные палочки. Из выросших колоний на агаре в чашках Петри отбирают 3-5 пигментообразующих колоний каждого штамма и высевают в пробирки с бульоном Хоттингера, инкубируют 18-24 часа при 37-37,5°С. Проверяют чистоту роста просмотром мазков, окрашенных по Граму, после чего высевают на бульон Хоттингера во флаконы или колбы в соотношении 1:100. Из флаконов или колб суточные культуры пересевают в подогретый до 35-37°С бульон Хоттингера в баллоны из расчета 80-100 мл на 10 литров среды. Выращивают при 37-37,5°С в течение 18-24 часов, проверяют чистоту, как указано выше и путем посева на МПА, МПБ и МППБ под вазелиновым маслом. В каждый из 10 реакторов с питательной средой, подогретой до 35-37°С, вносят расплодку одного из штаммов в количестве 5-8% к объему питательной среды и 0,03-0,05 пеногасителя (подсолнечного, сливового, абрикосового или персикового масла). Питательные среды в реакторах перемешивают механической мешалкой в течение 1-2 минут, мешалку выключают. Через 1,5-2 часа проводят непрерывное перемешивание культуры механической мешалкой с одновременной аэрацией растущей культуры воздухом. Количество оборотов механической мешалки 150-240 в минуту; количество продуваемого стерильного воздуха должно быть в пределах 1-1,5 объема в минуту к общему объему аэрируемой культуры. Культивирование проводят при температуре 37-37,5°С в течение 24-25 часов до получения концентрации 18-20 млрд микробных клеток в 1 мл, что контролируется по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. После начала культивирования через 5-3 часов из каждого реактора берут пробу для определения рН и чистоты роста микроскопией мазков. Для поддержания рН в пределах 7,2-7,4 использует 10%-ный раствор натрия гидроокиси, если рН выше 7,4 снижают его 0,5% раствором соляной кислоты. Последующие пробы берут через каждые 2-3 часа. После 24-х часов культивирования в отобранных пробах определяет также концентрацию микробов по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. По окончании срока инкубации нагревание реакторов прекращают. Культуру контролируют по показателям: чистоты (микроскопия, посев на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновый маслом), рН и концентрации микробных клеток. Концентрация микробных клеток по оптическому стандарту мутности в каждом реакторе должна быть не менее 18-20 млрд микробных клеток в 1 мл. При хороших показателях оптической концентрации и чистоты культуры в реакторах подогревает до 37-37,5°С и при включенной мешалке через посевной кран добавляют стерильный 0,9%-ный раствор хлористого натрия рН 7,2-7,4 до концентрации 10 млрд микробных клеток в 1 мл. При разведении культуры до необходимой концентрации ее в 1 мл допускается перекачивание определенной части бактериальной массы в другие стерильные емкости, обеспечивающие перемешивание и поддержание температурного режима. В полученную суспензию бактерий вносят 0,5% формалина, с содержанием не ниже 36% формальдегида. Инактивируют культуру в течение двух недель, подвергая три раза в сутки по 20 минут перемешиванию с применением механической мешалки. Через 5 дней после добавления формалина отбирают пробы для контроля полноты убивки и определения концентрации микробных клеток. Для этого проводят посевы на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, определяют концентрацию микробных клеток по оптическому стандарту мутности. Посевы должны быть стерильными в течение 10 дней наблюдения. Концентрация должна составлять 10 млрд м.к. в миллилитре, несвязанного формальдегида не более 0,25%. Проверенные, инактивированные культуры всех 10 штаммов смешивают в равных количествах в других стерильных реакторах большей емкости. Проверяют на стерильность вышеописанным способом. В проверенные, инактивированные и смешанные культуры 10 штаммов через посевной кран вносят адъювант 6%-ный стерильный раствор гидроокиси алюминия (ГОСТ 18287-72) из расчета 15% к объему культуры. Адъювант вносят при непрерывной работе механической мешалки. Через трое суток после внесения адъюванта в смешанную культуру формируют серию вакцины, что считают датой ее изготовления, рН готовой вакцины должен быть в пределах 7,0-7,4.

Полученная вакцина представляет собой суспензию серо-зеленоватого цвета, с бело-сероватым рыхлым осадком, которую фасуют по 100-200 мл в стерильные флаконы. Вакцину хранят при температуре 2-15°С. Срок годности 1 год.

Вакцина предназначена для профилактики псевдомоноза крупного рогатого скота и свиней.

Коровам и свиноматкам вакцину вводят за 1-1,5 месяца до родов двукратно с интервалом 12-14 дней в дозе по 5 мл, с осторожностью, чтобы не вызвать травматических повреждений. Хряков и быков - производителей вакцинируют дважды по 5 мл через каждые 6 месяцев.

Клинически здоровых телят и поросят в возрасте 15-17 дней в неблагополучных или угрожаемых по заболеванию псевдомонозом хозяйствах вакцинируют всех двукратно через 12-14 дней в дозе по 1 мл внутримышечно поросятам в область бедра с внутренней стороны и по 2 мл телятам в область верхней трети шеи. Ревакцинацию проводят однократно поросятам в дозе 2 мл, а телятам - 3 мл через 3-4 месяца. Иммунизацию поросят и телят с профилактической целью следует проводить в период массовых растелов и опоросов.

К факторам, обусловливающим получение вакцины определенного свойства, относятся бактериальное сырье, последовательность его приготовления и процентное соотношение компонентов, входящих в состав вакцины.

Приведено пять примеров, содержащих компоненты в различных соотношениях на 100 мл вакцины.

Пример 1.

Берут чистые культуры возбудителя Pseudomonas aeruginosa, принадлежащие к десяти серогруппам №18(О1); №47(О2); №37(О3); №19(О4); №2(О6); №13(О10); №70(О11); №66(О13); №29(О18); №28(О19), полученные путем отбора, выращивают раздельно в мясопептонном бульоне и агаре до концентрации в каждой серогруппе микробных клеток 9,5-10,5 млрд в 1 мл, смешивают в равных соотношениях, вносят в качестве консерванта 0,5% формалин, а качестве адъюванта - гидроокись алюминия при следующем соотношении компонентов, мас.%:

суспензия клеток чистой культуры возбудителя Pseudomonas aeruginosa десяти серогрупп №18(О1); №47(О2); №37(О3); №19(О4); №2(О6); №13(О10); №70(О11); №66(О13); №29(О18); №28(О19), выделенного из местного эпизоотического очага в питательной среде с титром 9,5-10,5 млрд микробных клеток в 1 мл 83,8;

формалин 0,5;

гидроокись алюминия остальное.

При данном соотношении компонентов вакцина обладает слабой иммунной активностью: у поросят - 72,6%, у телят - 78,6%.

Пример 2.

Берут чистые культуры возбудителя Pseudomonas aeruginosa, принадлежащие к десяти серогруппам №18(О1); №47(О2); №37(О3); №19(О4); №2(О6); №13(О10); №70(О11); №66(О13); №29(О18); №28(О19), полученные путем отбора, выращивают раздельно в мясопептонном бульоне и агаре до концентрации в каждой серогруппе микробных клеток 9,5-10,5 млрд в 1 мл, смешивают в равных соотношениях, вносят в качестве консерванта 0,5% формалин, а качестве адъюванта - гидроокись алюминия при следующем соотношении компонентов, мас.%:

суспензия клеток чистой культуры возбудителя Pseudomonas aeruginosa десяти серогрупп №18(О1); №47(О2); №37(О3); №19(О4); №2(О6); №13(О10); №70(О11); №66(О13); №29(О18); №28(О19),выделенного из местного эпизоотического очага в питательной среде с титром 9,5-10,5 млрд микробных клеток в 1 мл 84,6;

формалин 0,5;

гидроокись алюминия остальное.

При данном соотношении компонентов вакцина обладает достаточной иммунной активностью у поросят - 88,4%, у телят - 93,0%.

Пример 3.

Берут чистые культуры возбудителя Pseudomonas aeruginosa, принадлежащие к десяти серогруппам №18(О1); №47(О2); №37(О3); №19(О4); №2(О6); №13(О10); №70(О11); №66(О13); №29(О18); №28(О19), полученные путем отбора, выращивают раздельно в мясопептонном бульоне и агаре до концентрации в каждой серогруппе микробных клеток 9,5-10,5 млрд в 1 мл, смешивают в равных соотношениях, вносят в качестве консерванта 0,5% формалин, а качестве адъюванта - гидроокись алюминия при следующем соотношении компонентов, мас.%:

суспензия клеток чистой культуры возбудителя Pseudomonas aeruginosa десяти серогрупп №18(О1); №47(О2); №37(О3); №19(О4); №2(О6); №13(О10); №70(О11); №66(О13); №29(О18); №28(О19), выделенного из местного эпизоотического очага в питательной среде с титром 9,5-10,5 млрд микробных клеток в 1 мл 87,7;

формалин 0,5;

гидроокись алюминия остальное.

При данном соотношении компонентов вакцина обладает незначительной иммуногенной эффективностью у поросят - 91,0%, у телят - 93,1%.

Пример 4.

Берут чистые культуры возбудителя Pseudomonas aeruginosa, принадлежащие к десяти серогруппам №18(О1); №47(О2); №37(О3); №19(О4); №2(О6); №13(О10); №70(О11); №66(О13); №29(О18); №28(О19), полученные путем отбора, выращивают раздельно в мясопептонном бульоне и агаре до концентрации в каждой серогруппе микробных клеток 9,5-10,5 млрд в 1 мл, смешивают в равных соотношениях, вносят в качестве консерванта 0,5% формалин, а качестве адъюванта - гидроокись алюминия при следующем соотношении компонентов, мас.%:

суспензия клеток чистой культуры возбудителя Pseudomonas aeruginosa десяти серогрупп №18(О1); №47(О2); №37(О3); №19(О4); №2(О6); №13(О10); №70(О11); №66(О13); №29(О18); №28(О19), выделенного из местного эпизоотического очага в питательной среде с титром 9,5-10,5 млрд микробных клеток в 1 мл 89,5;

формалин 0,5;

гидроокись алюминия остальное.

При данном соотношении компонентов вакцина обладает высокой иммуногенной эффективностью: у поросят - 91,0%, у телят - 93,8%.

Пример 5.

Берут чистые культуры возбудителя Pseudomonas aeruginosa, принадлежащие к десяти серогруппам №18(О1); №47(О2); №37(О3); №19(О4); №2(О6); №3(О10); №70(О11); №66(О13); №29(О18); №28(О19), полученные путем отбора, выращивают раздельно в мясопептонном бульоне и агаре до концентрации в каждой серогруппе микробных клеток 9,5-10,5 млрд в 1 мл, смешивают в равных соотношениях, вносят в качестве консерванта 0,5% формалин, а качестве адъюванта - гидроокись алюминия при следующем соотношении компонентов, мас.%:

суспензия клеток чистой культуры возбудителя Pseudomonas aeruginosa десяти серогрупп №18(О1); №47(О2); №37(О3); №19(О4); №2(О6); №13(О10); №70(О11); №66(О13); №29(О18); №28(О19), выделенного из местного эпизоотического очага в питательной среде с титром 9,5-10,5 млрд микробных клеток в 1 мл 90;

формалин 0,5;

гидроокись алюминия остальное.

При данном соотношении компонентов вакцина обладает иммуногенной эффективностью: у поросят - 89,1%, у телят - 92,0%, у отдельных животных вызывает в месте введения трудно рассасываемые уплотнения тканей.

Таблица Сравнительная оценка эффективности вакцины
Вакцина	Доза вакцины, мл	Метод введения	Иммунобиологические свойства
			Кол-во животных в опыте	Наличие поствакцинальных осложнений	Результат заражений Пало в опыте	Защита, %
Аналог	Двукратно по 2 мл	Телятам внутримышечно	78	8	24	69,2
		и поросятам внутримышечно	126	7	211	67,4
Прототип	Двукратно по 2 мл	Телятам внутримышечно	106	4	7	93,3
	Двукратно по 1 мл	и поросятам внутримышечно	722	6	77	89,3