способ выделения эстрогенов из мочи кобыл

Формула изобретения

1. Способ выделения из мочи жеребых кобыл природной смеси конъюгированных эстрогенов со сниженным содержанием в ней фенольных компонентов мочи, при осуществлении которого

а) мочу, которая представляет собой мочу, из которой необязательно удалены слизь и твердые вещества, сгущенный концентрат этой мочи или полученный путем фильтрации этой мочи через мембранный фильтр сгущенный ретентат, вводят в контакт с достаточным для адсорбции содержащейся в моче смеси конъюгированных эстрогенов количеством полимерной адсорбирующей смолы и насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов полимерную адсорбирующую смолу отделяют от остальной мочи,

б) насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов полимерную адсорбирующую смолу промывают промывочной жидкостью со значением рН, установленным по меньшей мере на 12,0, и

в) промытую адсорбирующую смолу вводят в контакт с достаточным для десорбции адсорбированной ею смеси конъюгированных эстрогенов количеством элюента, который представляет собой смешивающийся с водой органический растворитель из группы, включающей смешивающиеся с водой простые эфиры, низшие алканолы и низшие алифатические кетоны, либо смесь из смешивающегося с водой органического растворителя и необязательно подщелаченной воды, и содержащий природную смесь конъюгированных эстрогенов элюат отделяют от адсорбирующей смолы и необязательно сгущают, отличающийся тем, что между стадиями б) и в) проводят промежуточную промывку, при которой насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов адсорбирующую смолу промывают водой.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что промежуточную промывку проводят при температуре ниже комнатной, прежде всего при температуре в интервале от 0 до 10°С, предпочтительно при температуре несколько выше 0°С.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используемую для промежуточной промывки промывочную жидкость предварительно охлаждают до температуры ниже комнатной, прежде всего до температуры в интервале от 0 до 10°С, предпочтительно до температуры несколько выше 0°С.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что используемую на стадии б) подщелаченную промывочную жидкость предварительно охлаждают до температуры ниже комнатной, прежде всего до температуры в интервале от 0 до 10°С, предпочтительно до температуры несколько выше 0°С.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что промежуточную промывку и предшествующую ей стадию б) проводят при температуре ниже комнатной, прежде всего при температуре в интервале от 0 до 10°С, предпочтительно при температуре несколько выше 0°С.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что используемую для промежуточной промывки промывочную жидкость предварительно охлаждают до температуры ниже комнатной, прежде всего до температуры в интервале от 0 до 10°С, предпочтительно до температуры несколько выше 0°С.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что используемую на стадии б) подщелаченную промывочную жидкость предварительно охлаждают до температуры ниже комнатной, прежде всего до температуры в интервале от 0 до 10°С, предпочтительно до температуры несколько выше 0°С.

8. Способ по одному из пп.1-7, отличающийся тем, что используемые при его осуществлении устройства, такие как реакторы, в которые загружают полимерную адсорбирующую смолу, или уже содержащие ее реакторы, и/или используемую МЖК предварительно охлаждают соответственно до температуры ниже комнатной, прежде всего до температуры в интервале от 0 до 10°С, предпочтительно до температуры несколько выше 0°С.

9. Способ по одному из пп.1-7, отличающийся тем, что в качестве полимерных адсорбирующих смол используют семиполярные адсорбирующие смолы, предпочтительно неионогенные семиполярные адсорбирующие смолы.

10. Способ по п.8, отличающийся тем, что в качестве полимерных адсорбирующих смол используют семиполярные адсорбирующие смолы, предпочтительно неионогенные семиполярные адсорбирующие смолы.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к способу выделения природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл.

Эстрогены широко используются в медицине для гормонзаместительной терапии. Смеси эстрогенов применяют прежде всего в лечебных и профилактических целях при недомоганиях, возникающих у женщин в климактерический период после естественной или искусственно вызванной менопаузы. Для применения в подобных целях как особо эффективные и хорошо переносимые пациентами зарекомендовали себя природные смеси конъюгированных эстрогенов, содержащиеся в моче жеребых кобыл.

Содержание твердого вещества, растворенного в моче жеребых кобыл (в последующем описании сокращенно обозначаемой как "МЖК"), может, как очевидно, колебаться в достаточно широких пределах и обычно составляет от 40 до 90 г сухого вещества на литр. Наряду с мочевиной и прочими обычными компонентами мочи в твердом веществе, содержащемся в МЖК, присутствуют также фенольные компоненты в количествах, составляющих от примерно 2 до 5 мас.% в пересчете на массу сухого вещества. К числу таких фенольных компонентов относятся крезолы и дигидро-3,4-бис[(3-гидроксифенил)метил]-2(3Н)-фуранон, сокращенно обозначаемый как ГФМФ. Эти вещества могут быть представлены в свободной или конъюгированной форме. В МЖК содержится далее природная смесь эстрогенов, которая преимущественно представлена в конъюгированной форме, например, в виде натриевой соли полуэфира серной кислоты (ниже кратко называемой как "сульфат"). Содержание конъюгированных эстрогенов (рассчитываемое для сульфата эстрогенов) может составлять от 0,3 до 1 мас.% в пересчете на массу сухого вещества.

Из заявки WO 98/08526 уже известен соответствующий способ, который позволяет путем твердофазной экстракции на семиполярной, прежде всего на неионогенной семиполярной, полимерной адсорбирующей смоле получать содержащую практически все количество присутствующих в МЖК природных эстрогенов смесь, в которой снижено содержание фенольных компонентов мочи и которая практически не содержит крезол и ГФМФ. Этот экстракт может использоваться в качестве исходного материала для получения фармацевтических препаратов, которые в качестве действующего вещества содержат природную смесь конъюгированных эстрогенов.

Однако выделенная из МЖК природная смесь конъюгированных эстрогенов для возможности ее использования в качестве действующего вещества в фармацевтических препаратах должна удовлетворять определенным фармацевтическим спецификациям, например должна соответствовать спецификациям, изложенным в USP (фармакопея США) или в европейской фармакопее. Помимо этого и содержание свободных эстрогенов в такой смеси в пересчете на массу сухого вещества не должно превышать определенных предельных значений. Смеси конъюгированных эстрогенов, выделенные из МЖК описанным в WO 98/08526 способом, обычно удовлетворяют установленным фармацевтическим спецификациям.

Однако было установлено, что обеспечить соответствие продукта необходимым фармацевтическим спецификациям, например касательно вышеуказанного предельного значения максимально допустимого содержания в нем свободных эстрогенов, часто не удается в тех случаях, когда на переработку по выделению природной смеси конъюгированных эстрогенов попадает "состарившаяся" моча, например МЖК, хранившаяся или транспортировавшаяся к месту ее переработки в течение более продолжительного промежутка времени и/или, возможно, при повышенных температурах. Подобное старение МЖК предположительно обусловлено тем, что в зависимости от условий ее хранения и/или транспортировки содержание в ней конъюгированных эстрогенов может с течением времени или под воздействием повышенных температур снижаться, а содержание нежелательных свободных эстрогенов, наоборот, возрастать. Тем самым у состарившейся мочи исходный состав содержащейся в ней природной смеси эстрогенов может изменяться и в отрицательную сторону отличаться от состава природной смеси эстрогенов в свежей моче. В случае выделенной описанным в WO 98/08526 способом природной смеси конъюгированных эстрогенов возможное изменение состава состарившегося исходного продукта часто связано с опасностью того, что полученный экстракт не сможет более удовлетворять необходимым фармацевтическим спецификациям и прежде всего касательно максимально допустимого содержания в нем свободных эстрогенов. Особый недостаток при этом состоит в том, что в подобном случае получаемая из состарившейся МЖК партия продукции, которая содержит представляющий собой ценное действующее вещество экстракт в виде смеси конъюгированных эстрогенов, не может использоваться для получения фармацевтического препарата и поэтому ее приходится направлять в отходы. На практике и с экономической точки зрения потеря столь ценного природного фармацевтического действующего вещества крайне нежелательна с учетом исключительно трудоемкого и проводимого только в определенные периоды беременности кобыл сбора МЖК и обусловленных этим ограничений, связанных с материально-техническим обеспечением.

Исходя из вышеизложенного, в основу настоящего изобретения была положена задача разработать технически и экономически оптимальный способ выделения из МЖК природной смеси конъюгированных эстрогенов со сниженным содержанием в ней фенольных компонентов мочи, который допускал бы возможность эффективной и исключающей получение некондиционной продукции переработки в качестве исходного материала и состарившейся МЖК, т.е. хранившейся или транспортировавшейся в течение более продолжительных промежутков времени и/или при повышенных температурах МЖК с повышенным при определенных условиях относительным содержанием в ней свободных эстрогенов, и который позволял бы выделять прежде всего из подобной МЖК природную смесь конъюгированных эстрогенов, содержание в которой действующего вещества достигало бы достаточно высокого уровня и которая удовлетворяла бы установленным фармацевтическим спецификациям, в том числе и касательно главным образом максимально допустимого содержания в ней свободных эстрогенов.

Для решения указанной задачи согласно изобретению был разработан способ, который неожиданно простым путем позволяет выделять даже из состарившейся, т.е. прежде всего из характеризующейся при определенных условиях повышенным относительным содержанием свободных эстрогенов, МЖК смесь конъюгированных эстрогенов, которая в качестве получаемого этим способом продукта обладает высоким качеством и в полной мере удовлетворяет фармацевтическим спецификациям, в том числе и касательно, главным образом, максимально допустимого содержания в ней свободных эстрогенов.

Аналогом предлагаемого в изобретении способа служит описанный в WO 98/08526 способ выделения из МЖК природной смеси конъюгированных эстрогенов со сниженным содержанием в ней фенольных компонентов мочи. В соответствии с этим в изобретении предлагается способ выделения из мочи жеребых кобыл природной смеси конъюгированных эстрогенов со сниженным содержанием в ней фенольных компонентов мочи, при осуществлении которого

а) мочу, которая представляет собой мочу, из которой необязательно удалены слизь и твердые вещества, сгущенный концентрат этой мочи или полученный путем фильтрации этой мочи через мембранный фильтр сгущенный ретентат (вещество, не прошедшее через мембранный фильтр) вводят в контакт с достаточным для адсорбции содержащейся в моче смеси конъюгированных эстрогенов количеством семиполярной полимерной адсорбирующей смолы и насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов семиполярную полимерную адсорбирующую смолу отделяют от остальной мочи;

б) насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов семиполярную полимерную адсорбирующую смолу промывают промывочной жидкостью со значением рН, установленным по меньшей мере на 12,0, прежде всего на 12,5-14,0;

в) промытую адсорбирующую смолу вводят в контакт с достаточным для десорбции адсорбированной ею смеси конъюгированных эстрогенов количеством элюента, который представляет собой смешивающийся с водой органический растворитель из группы, включающей смешивающиеся с водой простые эфиры, низшие алканолы и низшие алифатические кетоны, либо смесь из смешивающегося с водой органического растворителя и необязательно подщелаченной воды, и содержащий природную смесь конъюгированных эстрогенов элюат отделяют от адсорбирующей смолы и необязательно сгущают, при этом предлагаемый в изобретении способ отличается от известного из уровня техники способа тем, что между стадиями б) и в) проводят промежуточную промывку, при которой насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов семиполярную адсорбирующую смолу промывают водой.

Подготовка партии продукции на известных как таковых стадиях а), б) и в), а также применение полученного на стадии в) элюата, содержащего природную смесь конъюгированных эстрогенов, в целом уже описаны в заявке WO 98/08526 и тем самым известны специалистам в данной области из этой публикации. В соответствии с этим, указанная заявка WO 98/08526 в полном объеме включена в настоящее описание в качестве ссылки. Дополнительные детали касательно общей методики проведения процесса и используемых при этом материалов в обобщенном виде представлены в настоящем описании в разделе, в котором рассматриваются примеры осуществления изобретения. Так, например, при осуществлении предлагаемого в изобретении способа могут использоваться указанные в WO 98/08526 семиполярные, прежде всего неионогенные семиполярные адсорбирующие смолы. Помимо этого благодаря предусмотренной изобретением стадии промежуточной промывки насыщенной смесью конъюгированных эстрогенов адсорбирующей смолы в качестве таковой при осуществлении предлагаемого в изобретении способа можно, что является неожиданным фактом, использовать и иные адсорбирующие смолы без ухудшения качества получаемого продукта или без ущерба для его обязательного соответствия фармацевтическим спецификациям. Адсорбирующие смолы, которые могут использоваться при осуществлении предлагаемого в изобретении способа, более подробно рассмотрены ниже в последующем описании.

Согласно изобретению, насыщенную на стадии а) смесью конъюгированных эстрогенов семиполярную адсорбирующую смолу подвергают после выполнения стадии б) промывке водой. Количество промывочной жидкости выбирается при этом с таким расчетом, чтобы смесь конъюгированных эстрогенов в получаемом на последующей стадии в) элюате отвечала бы необходимым требованиям касательно максимально допустимого содержания в ней свободных эстрогенов и тем самым могла бы использоваться в качестве действующего вещества в фармацевтических препаратах. Так, например, целесообразно использовать от 2 до 8, предпочтительно от 3 до 5 объемов слоя промывочной жидкости на один объем слоя адсорбирующей смолы. При этом промывочную жидкость целесообразно пропускать через содержащий адсорбирующую смолу реактор с расходом от 3 до 10, предпочтительно от 5 до 7 об. ч. на 1 об. ч. адсорбирующей смолы в час.

Как особенно неожиданный, следует отметить тот установленный согласно изобретению факт, что кажущаяся простой операцией проводимая между стадиями б) и в) промывка адсорбирующей смолы водой даже при переработке состарившейся МЖК приводит к оптимизации фармацевтических характеристик получаемой в качестве экстракта природной смеси конъюгированных эстрогенов, представляющей собой ценное действующее вещество. Наиболее неожиданным является прежде всего тот факт, что предлагаемый в изобретении подход позволяет эффективно снижать повышенное при определенных условиях, главным образом в состарившейся МЖК, относительное содержание свободных эстрогенов до такого уровня, при котором появляется возможность получать на стадии в) в качестве элюата природную смесь конъюгированных эстрогенов, которая удовлетворяет высоким требованиям, устанавливаемым фармацевтическими спецификациями, например требованиям, предъявляемым фармакопеей США или европейской фармакопеей, и прежде всего позволяет получать даже из состарившейся МЖК содержащий природные смеси конъюгированных эстрогенов качественно и количественно высокосортный экстракт, используемый в качестве соответствующего действующего вещества в фармацевтических препаратах. Содержание свободных эстрогенов в подобных экстрактах гарантированно остается ниже максимально допустимого уровня вне зависимости от возраста используемой МЖК и источника, из которого она поступает на переработку, и поэтому такие экстракты оказываются оптимальным, соответственно ценным исходным материалом для получения на их основе фармацевтических препаратов. Тем самым даже при наиболее неблагоприятных условиях удается избежать нежелательной и экономически убыточной потери ценного фармацевтического сырья, которым в данном случае являются смеси природных конъюгированных эстрогенов.

Еще одно преимущество предлагаемого в изобретении способа состоит в получении на стадии в) элюата, общее содержание в котором гормонов в пересчете на массу сухого вещества превышает содержание гормонов в элюате, получаемом известным из уровня техники способом. За счет этого удается значительно повысить качество получаемого продукта, например, с точки зрения содержания в нем действующего вещества.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления предлагаемого в изобретении способа промежуточную промывку проводят при температуре ниже комнатной, прежде всего при температуре от 0 до 10°С, поскольку, как было установлено, проведение дополнительной стадии промежуточной промывки именно в этом интервале температур позволяет значительно уменьшить обусловленную ею при определенных условиях потерю гормонов соответственно действующих веществ. За комнатную обычно принимается температура окружающей среды, например температура в интервале от 20 до 30°С. Предлагаемый в изобретении способ наиболее целесообразно осуществлять при температуре, фактически равной 0°С, соответственно при температурах, близких к 0°С. Поэтому на практике рекомендуется работать при температурах несколько выше 0°С и за счет принятия соответствующих мер обеспечить ее поддержание в указанном интервале. С этой целью могут приниматься обычные меры, направленные на снижение температуры, например применение охлаждаемых реакторов, охлажденных материалов и/или охлажденных исходных веществ, в частности МЖК. За температуру, равную 0°С, соответственно за температуры, близкие к 0°С, с практической точки зрения можно принимать интервал температур от 0 до примерно 5°С, прежде всего от 0 до примерно 3°С.

Для удержания возможной потери гормонов в процессе промежуточной промывки на минимально возможном уровне согласно этому варианту осуществления изобретения используемую на стадии промежуточной промывки и/или также на стадии б) подщелаченную промывочную жидкость предварительно охлаждают до температуры ниже комнатной, прежде всего до температуры в интервале от 0 до 10°С. Другими целесообразными, соответственно предпочтительными интервалами температур, до которых можно предварительно охлаждать промывочную жидкость, являются указанные выше интервалы температур от 0 до примерно 5°С, прежде всего от 0 до примерно 3°С. Предпочтительно работать при температуре, равной 0°С, соответственно при температурах, близких к 0°С, т.е. используемую на стадии промежуточной промывки и/или также на стадии б) подщелаченную промывочную жидкость предпочтительно предварительно охлаждать до температуры несколько выше 0°С. Использование охлажденной подщелаченной промывочной жидкости на стадии б) обеспечивает своего рода предварительное охлаждение адсорбирующей смолы или поддержание в охлажденном состоянии уже охлажденной адсорбирующей смолы, например, во избежание при применении охлажденной промывочной жидкости для промежуточной промывки нежелательного ее повторного нагрева. Предпочтительно поэтому проводить обе стадии, т.е. стадию промежуточной промывки и предшествующую ей стадию б), в одном и том же интервале температур, например при температуре ниже комнатной, прежде всего при температуре от 0 до 10°С, или предпочтительно в указанных выше интервалах температур.

В вышеописанном варианте осуществления изобретения, предусматривающем проведение предлагаемого в нем способа при температуре ниже комнатной, может оказаться целесообразным предварительно охлаждать все используемые устройства, такие как реакторы, в которые загружается семиполярная адсорбирующая смола, или уже содержащие ее реакторы, и/или используемую МЖК соответственно до температуры ниже комнатной, прежде всего до температуры, составляющей от 0 до 10°С, или до температуры, лежащей в указанных выше предпочтительных интервалах.

В качестве адсорбента в предлагаемом в изобретении способе могут использоваться полимерные адсорбирующие смолы. К наиболее предпочтительным адсорбирующим смолам относятся семиполярные, прежде всего неионогенные семиполярные, полимерные адсорбирующие смолы. Используемые в предлагаемом в изобретении способе в качестве адсорбентов семиполярные полимерные адсорбирующие смолы в предпочтительном варианте представляют собой пористые органические неионогенные полимеры, которые в отличие от неполярных гидрофобных полимерных адсорбирующих смол обладают промежуточной полярностью (соответствующей, например, дипольному моменту активной поверхности смолы от 1,0 до 3,0 Д, прежде всего от 1,5 до 2,0 Д) и имеют несколько более гидрофильную структуру и в качестве примера которых можно назвать поликарбоксилатные смолы. Целесообразно использовать макропористые семиполярные смолы с предпочтительно макросетчатой структурой и со средним диаметром пор от 50 до 150 Å, предпочтительно от 70 до 100 Å, а также с удельной поверхностью от 300 до 900 м²/г, предпочтительно от 400 до 500 м²/г. В качестве наиболее пригодных для применения в предлагаемом в изобретении способе зарекомендовали себя макропористые поперечно-сшитые алифатические поликарбоксилатные смолы, прежде всего поперечно-сшитые полиакрилатные смолы, такие, например, как смола Amberlite XAD-7 ^® фирмы Rohm and Haas, которые являются неионогенными семиполярными адсорбирующими смолами.

Наряду с указанными выше предпочтительными адсорбентами могут использоваться и иные адсорбирующие смолы. В качестве таких адсорбирующих смол при этом могут использоваться неполярные, семиполярные, а также полярные адсорбирующие смолы. Количество мочи, которое можно прокачивать через адсорбент, следует при этом определять заранее исходя из адсорбционной емкости конкретного адсорбента. В качестве примера пригодных для применения адсорбирующих смол можно назвать имеющиеся в продаже типы адсорбирующих смол, такие как полимерные адсорбенты типа амберлитов со стиролдивинилбензольными каркасами (например, типа XAD-1180, XAD-2, XAD-4, XAD-16), с акрилатными каркасами (например, XAD-7) или же с высокополярными каркасами, содержащими азот и кислород (например, XAD-12). К числу других приемлемых адсорбирующих смол относятся смолы типа доуэкс (сополимеры стирола и дивинилбензола), например доуэкс 112, доуэкс оптипор, доуэкс оптипор V 493, смолы типа леватитов (сшитые полистиролы), например леватит ОС 1064, леватит ОС 1066 или леватит ОС 1163, и полиаминовые анионообменные смолы, например смолы типа доуэкс. Предпочтительными адсорбирующими смолами являются прежде всего XAD-7, XAD-16 (тип HP), XAD 118 и доуэкс оптипор, предпочтительно в виде доуэкс оптипор V 493, а также леватиты ОС 1064, ОС 1066 и ОС 1163.

Предлагаемый в изобретении способ обладает, как уже подробно описывалось выше, целым рядом преимуществ перед известным из уровня техники способом. Так, в частности, предлагаемым в изобретении способом можно перерабатывать также состарившуюся МЖК, в которой допустимо даже повышенное относительное содержание свободных эстрогенов, без ущерба для обязательного соответствия получаемого продукта фармацевтическим спецификациям. Поэтому предлагаемый в изобретении способ обладает и целым рядом экономических преимуществ, достигаемых благодаря значительному снижению опасности потери ценных действующих веществ при несоответствии исходного материала фармацевтическим спецификациям, например при не допустимо высоком содержании в нем свободных эстрогенов. Предлагаемый в изобретении способ позволяет получать действующее вещество более высокого качества с повышенным в пересчете на содержание сухого вещества содержанием гормонов. Такое действующее вещество наиболее пригодно для получения на его основе фармацевтических препаратов, содержащих в качестве такового смесь природных конъюгированных эстрогенов.

Ниже изобретение более подробно рассмотрено на примерах, которые, однако, не ограничивают его объем.

Примеры

В последующих примерах рассмотрены общие рабочие методы выделения содержащих действующее вещество экстрактов из МЖК, которые содержат природную смесь содержащихся в МЖК конъюгированных эстрогенов и в которых значительно снижено содержание фенольных компонентов мочи. В этих примерах описывается, каким образом согласно изобретению даже из состарившейся МЖК с возможно повышенным относительным содержанием в ней свободных эстрогенов можно получить качественный экстракт с высоким содержанием в нем действующего вещества.

Способ согласно WO 98/08526

Предлагаемым в настоящем изобретении способом аналогично описанному в WO 98/08526 способу можно перерабатывать МЖК как таковую, полученный из нее путем сгущения концентрат либо полученный из нее путем фильтрации через мембранный фильтр ретентат. Собранную мочу сначала известным методом очищают от слизи и твердых примесей или веществ. В предпочтительном варианте таким твердым веществам и слизи сначала дают осесть, а затем отделяют от них остальную мочу известными методами разделения, например декантацией, сепарацией и/или фильтрацией. Так, например, МЖК можно пропускать через известное как таковое разделительное устройство, в частности сепаратор, фильтровальную установку или отстойник. Разделяющей средой может служить, например, песок или же для разделения могут использоваться имеющиеся в продаже сепараторы, например сопловые сепараторы либо сепараторы камерного типа. При необходимости можно также использовать установку для микрофильтрации или установку для ультрафильтрации, применение которых одновременно обеспечивает также практически полное отсутствие микробов и вирусов в профильтрованной МЖК.

При необходимости к моче можно добавлять консерванты, гермициды, бактерициды и/или гельминтоциды.

Если вместо МЖК как таковой должен использоваться ее концентрированный ретентат, то его можно получать из МЖК путем ее известной фильтрации через мембранный фильтр. Содержание твердого вещества в ретентате и его состав могут варьироваться в зависимости от перерабатываемой МЖК и используемой для фильтрации мембраны, например от размера ее пор, а также в зависимости от условий фильтрации. Так, в частности, использование мембранного фильтра с размером пор, лежащим в нанометровом диапазоне, обеспечивает практически без потерь концентрирование содержащихся в МЖК эстрогенов в ретентате при одновременном удалении до 50 мас.% низкомолекулярных компонентов МЖК. При осуществлении предлагаемого в изобретении способа можно использовать ретентаты МЖК, степень или коэффициент концентрации которых может достигать порядка 1:10, например может составлять порядка 1:7, и объем которых тем самым может быть уменьшен до порядка 1/10, например может составлять порядка 1/7 от первоначального объема МЖК.

Используемые на стадии а) семиполярные полимерные адсорбирующие смолы представляют собой пористые органические неионогенные полимеры, которые в отличие от неполярных гидрофобных полимерных адсорбирующих смол обладают промежуточной полярностью (соответствующей, например, дипольному моменту активной поверхности смолы от 1,0 до 3,0 Д, прежде всего от 1,5 до 2,0 Д) и имеют несколько более гидрофильную структуру и в качестве примера которых можно назвать поликарбоксилатные смолы. Целесообразно использовать макропористые семиполярные смолы с предпочтительно макросетчатой структурой и со средним диаметром пор от 50 до 150 Å, предпочтительно от 70 до 100 Å, а также с удельной поверхностью от 300 до 900 м ²/г, предпочтительно от 400 до 500 м² /г. В качестве наиболее пригодных для применения в предлагаемом в изобретении способе зарекомендовали себя макропористые поперечно-сшитые алифатические поликарбоксилатные смолы, прежде всего поперечно-сшитые полиакрилатные смолы, такие, например, как смола Amberlite XAD-7 ^® фирмы Rohm and Haas.

Для адсорбции конъюгированных эстрогенов семиполярной адсорбирующей смолой МЖК или ее ретентат можно в соответствии с описанным в WO 98/08526 способом равно как и в соответствии с предлагаемым в настоящем изобретении способом вводить в контакт с адсорбирующей смолой, для чего мочу загружают в содержащий адсорбирующую смолу реактор и выдерживают в нем в контакте с адсорбирующей смолой в течение промежутка времени, достаточного для адсорбции содержащихся в моче эстрогенов. По завершении адсорбции конъюгированных эстрогенов семиполярной адсорбирующей смолой насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов адсорбирующую смолу можно известным путем отделить от остальной мочи. Мочу целесообразно пропускать через содержащую адсорбирующую смолу колонку с такой скоростью или с таким расходом, чтобы моча оставалась в контакте с адсорбирующей смолой в течение промежутка времени, достаточного для адсорбции содержащихся в моче эстрогенов. Мочу можно пропускать через содержащую адсорбирующую смолу колонку, например, со скоростью или с расходом из расчета 3-10, предпочтительно 5-7 об. ч. МЖК на 1 об. ч. адсорбирующей смолы в час. Регулировать скорость прохождения мочи через реактор в предпочтительном варианте можно ведением процесса при слегка повышенном или пониженном давлении. Количество используемой семиполярной адсорбирующей смолы может варьироваться в зависимости от типа применяемой адсорбирующей смолы и количества содержащегося в моче твердого вещества. Так, в частности, при переработке МЖК как таковой степень насыщения одной объемной части адсорбирующей смолы, например поперечно-сшитой алифатической поликарбоксилатной адсорбирующей смолы, может достигать 80 об.ч. предварительно обработанной МЖК, и при такой степени насыщения адсорбирующей смолы в отводимом потоке мочи уже не обнаруживается заметных количеств эстрогенов. При переработке же концентрата МЖК или ее ретентата сорбционная емкость адсорбирующей смолы, как очевидно, уменьшается в степени, пропорциональной степени их концентрации. Так, например, 1 об. ч. поперечно-сшитой алифатической поликарбоксилатной адсорбирующей смолы способна в этом случае адсорбировать мочу в количестве, соответствующем 20-80, предпочтительно 30-50 об. ч. МЖК.

После этого на стадии б) насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов семиполярную адсорбирующую смолу промывают промывочной жидкостью со значением рН, установленным по меньшей мере на 12,0, прежде всего на 12,5-14, предпочтительно примерно на 12,5-13,5. В качестве промывочной жидкости можно использовать водные растворы растворимых в моче инертных основных веществ достаточной для повышения значения рН промывочной жидкости до по меньшей мере 12,5 концентрации или крепости. В качестве инертных по отношению к семиполярной полимерной адсорбирующей смоле растворимых в воде основных веществ предпочтительно использовать растворимые в воде неорганические основания, такие как гидроксиды щелочных или щелочно-земельных металлов, прежде всего гидроксид натрия. В предпочтительном варианте промывочная жидкость должна содержать основные вещества лишь в таких количествах, которые необходимы для достижения требуемого значения рН, равного предпочтительно примерно 13. Количество промывочной жидкости выбирается с таким расчетом, чтобы его было достаточно только для практически полного удаления из мочи ее фенольных компонентов во избежание совместного вымывания с ними существенных количеств конъюгированных эстрогенов. Так, например, целесообразно использовать от 2 до 10, предпочтительно от 4 до 6 объемов слоя промывочной жидкости на объем слоя адсорбирующей смолы. При этом промывочную жидкость целесообразно пропускать через содержащий адсорбирующую смолу реактор с расходом от 3 до 10, предпочтительно от 5 до 7 об. ч. на 1 об. ч. адсорбирующей смолы в час.

Затем на стадии в) промытую, насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов адсорбирующую смолу обрабатывают элюентом в достаточном для элюирования из нее смеси конъюгированных эстрогенов количестве с получением в результате содержащего природную смесь конъюгированных эстрогенов МЖК элюата. В качестве элюента согласно изобретению используется смешивающийся с водой органический растворитель из группы, включающей смешивающиеся с водой простые эфиры, низшие алканолы и низшие алифатические кетоны, либо смесь из такого смешивающегося с водой растворителя и необязательно подщелаченной воды. К простым эфирам, которые могут использоваться в составе элюента, относятся смешивающиеся с водой циклические простые эфиры, такие как тетрагидрофуран или диоксан, но также смешивающиеся с водой простые эфиры с открытой цепью, такие, например, как метиловый эфир этиленгликоля (моноглим), диметиловый эфир диэтиленгликоля (диглим) или этилоксиэтилоксиэтанол (карбитол). В качестве низших алканолов можно использовать смешивающиеся с водой алкиловые спирты с 1-4, предпочтительно 1-3, атомами углерода, прежде всего этанол или изопропанол. В качестве низших алифатических кетонов можно использовать смешивающиеся с водой кетоны с 3-5 атомами углерода, прежде всего ацетон. В качестве наиболее эффективных зарекомендовали себя элюенты, в которых органическим растворителем является этанол. В качестве элюентов целесообразно далее использовать смеси из одного из указанных выше смешивающихся с водой органических растворителей и необязательно подщелаченной воды. Значение рН подобных содержащих воду элюентов лежит в нейтральном или щелочном диапазоне, достигая 13, и в предпочтительном варианте может составлять от примерно 10 до 12. В качестве растворителя в составе содержащего воду элюента следует применять стабильный в используемом диапазоне значений рН растворитель. В составе содержащих воду щелочных элюентов, значение рН которых составляет от примерно 10 до 12, в качестве растворителей рекомендуется использовать низшие алканолы, предпочтительно этанол. Значение рН содержащего воду элюента устанавливают на требуемое добавлением соответствующего количества растворимого в воде инертного основного вещества, предпочтительно неорганического основания, например гидроксида щелочного или щелочноземельного металла, прежде всего гидроксида натрия. В содержащих воду элюентах объемное соотношение между смешивающимся с водой органическим растворителем и водой может составлять от 40:60 до 20:80, предпочтительно около 30:70. Элюент можно использовать в количестве, составляющем от примерно 3 до 10, прежде всего от примерно 4 до 6 объемов слоя на объем слоя адсорбирующей смолы. Элюент целесообразно пропускать через содержащий насыщенную смесью эстрогенов адсорбирующую смолу реактор с такой скоростью или с таким расходом, чтобы адсорбирующая смола оставалась в контакте с элюентом в течение промежутка времени, достаточного для полного элюирования смеси конъюгированных эстрогенов. При использовании смеси этанола с водой в объемном соотношении между ними, равном 30:70, элюент можно пропускать через реактор, например, с расходом, составляющим от 3 до 10, предпочтительно 5 до 7 об. ч. на 1 об. ч. адсорбирующей смолы в час. Процесс элюирования целесообразно проводить при температуре в интервале от комнатной до примерно 60°С, предпочтительно от примерно 40 до 50°С. При необходимости расход элюента можно регулировать проведением процесса при слегка повышенном давлении, например при давлении, превышающем окружающее давление на величину, достигающую 0,2 бара, и собирать элюат несколькими фракциями. Содержание конъюгированных эстрогенов и фенольных компонентов мочи, таких как крезолы и ГФМФ, в отдельных фракциях элюата можно определять известным методом с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения (сокращенно "ЖХВР").

В процессе элюирования сначала получают практически не содержащую эстрогенов фракцию, которая имеет слабовыраженную окраску, соответственно вовсе не имеет цвета и количество которой в целом соответствует примерно одному объему слоя. Основное же количество конъюгированных эстрогенов, составляющее, например, от 80 до 99% от всего количества конъюгированных эстрогенов, присутствующих в исходной МЖК, находится в последующих основных фракциях элюата, окраска которых меняется от темно-желтой до коричневой и количество которых в целом соответствует 2-4 объемам слоя. В получаемых в последующем последних фракциях конъюгированные эстрогены содержатся в целом лишь в следовых количествах. При получении последних фракций, содержание в которых конъюгированных эстрогенов все еще превышает 10 мас.% в пересчете на сухое вещество, а содержание крезолов и ГФМФ составляет менее 0,6 мас.% в пересчете на сухое вещество, эти фракции можно объединять для последующей переработки с основным элюатом с высоким содержанием в нем эстрогенов.

Пример 1 (сравнительный)

а) Адсорбция содержащихся в МЖК эстрогенов на семиполярной полиакрилатной адсорбирующей смоле

Колонку высотой 220 мм и диаметром 40 мм заполняют 300 мл набухшей в воде семиполярной полиакрилатной адсорбирующей смолы (в качестве которой используют смолу Amberlite XAD-7 фирмы Rohm and Haas, крупность зерен от 0,3 до 1,2 мм, дипольный момент 1,8 Д, средний диаметр пор 80 Å, удельная поверхность около 450 м²/г в сухом состоянии). После этого через колонку при комнатной температуре пропускают 10,5 л (что соответствует 35 объемам слоя) профильтрованной в установке для ультрафильтрации МЖК (определенные с помощью ЖХВР данные о содержании в ней сульфата эстрона и крезола приведены ниже в таблице) с расходом, составляющим в среднем 24 мл/мин (что соответствует 4,8 объема слоя в час). Содержащиеся в МЖК эстрогены полностью адсорбируются на колонке с подобной набивкой из семиполярной адсорбирующей смолы. Выходящий из колонки поток мочи, который анализируют с помощью ЖХВР на содержание в нем конъюгированных эстрогенов (рассчитываемое на сульфат эстрона), практически не содержит эстрогенов. Эту вытекающую из аппарата мочу направляют в отходы.

б) Промывка колонки с насыщенной адсорбирующей смолой

Колонку с насыщенной адсорбирующей смолой промывают 1,5 л водного раствора гидроксида натрия со значением рН, равным 13. С этой целью щелочную промывочную жидкость пропускают через колонку с расходом, составляющим в среднем 24,6 мл/мин (что соответствует 4,9 объема слоя в час). Вытекающую из колонки промывочную жидкость анализируют с помощью ЖХВР на содержание в ней сульфата эстрона и крезола. По данным этого анализа в процессе промывки вымывается менее 5% от всего количества поступивших с мочой в колонку эстрогенов.

в) Десорбция конъюгированных эстрогенов из промытой колонки с адсорбирующей смолой

Через колонку, предварительно нагретую до указанной ниже в таблице температуры элюирования, пропускают 1,5 л элюента (этанол/вода в соотношении 30:70) с расходом, составляющим 25 мл/мин (что соответствует 5,0 объемам слоя в час). Вытекающий из колонки элюат собирают 5 фракциями. Эти фракции, объем каждой из которых составляет 300 мл (что соответствует 1 объему слоя), анализируют с помощью ЖХВР на содержание в них сульфата эстрона и крезола.

Первая фракция содержит сульфат эстрогена только в следовых количествах. Элюат выглядит как бесцветный, соответственно как имеющий бледно-желтую окраску. В последующих фракциях, количество которых составляет от 2 до 4, содержится около 80-98% от всего адсорбированного на колонке количества конъюгированных эстрогенов. В этом случае элюаты имеют интенсивную темно-коричневую окраску. Последняя фракция содержит лишь небольшое количество сульфата эстрогена, что заметно также по уменьшению интенсивности ее окраски.

В представленной ниже таблице для каждой из содержащих основное количество конъюгированных эстрогенов фракций приведены данные о содержании в них сухого вещества (СВ) в мас.% и определенные с помощью ЖХВР данные о содержании сульфата эстрона и крезола. Эти фракции представляют собой пригодные для последующей галеновой переработки экстракты.

г) Регенерация колонки с адсорбирующей смолой

Для регенерации колонку сначала промывают 600 мл смеси этанол/вода с 50%-ным содержанием этанола и установленным на 12 значением рН, затем промывают 600 мл смеси этанол/вода с 70%-ным содержанием этанола и установленным на 12 значением рН, после чего промывают 600 мл 10%-ного водного раствора цитрата натрия и в завершение промывают 600 мл дистиллированной воды. Весь процесс регенерации проводят при температуре 45°С. Содержащуюся в колонке адсорбирующую смолу можно насыщать и вновь регенерировать многократно, например до 40 раз.

Пример 2 (предлагаемый в изобретении способ)

В этом примере повторяют все описанные в примере 1 операции, но с проведением предусмотренной изобретением промежуточной промывки между стадиями б) и в).

Промежуточная промывка

Колонку с насыщенной адсорбирующей смолой промывают 900 мл воды. С этой целью нейтральную промывочную воду пропускают через колонку с расходом, составляющим в среднем 25,0 мл/мин (что соответствует 5,0 объемам слоя в час).

Вытекающую из колонки промывочную жидкость анализируют с помощью ЖХВР на содержание в ней сульфата эстрона и крезола. По данным этого анализа в процессе такой промежуточной промывки вымывается лишь незначительная часть (максимум лишь порядка нескольких процентов) от всего количества поступивших с мочой в колонку эстрогенов. Однако согласно изобретению при осуществлении предлагаемого в нем способа уменьшается также и относительное содержание свободных эстрогенов (см. пример 4).

Таблица I: Результаты, полученные в сравнительном примере 1 и примере 2 по изобретению
Пример №	1	2
Стадия а)
Исходная МЖК:
эстрон, мг/л	86,4	92,3
эквилин, мг/л	57,0	57,0
крезол, мг/л	1191,1	877,6
Стадия б)
Промывочная жидкость: водный раствор	рН13	рН13
NaOH
Промежуточная промывка
Промывочная жидкость: вода
Полученная при промывке фракция 1:
эстрон, мг/л		0,0
эквилин, мг/л		20,9
крезол, мг/л	в сравнительном	18,0
Полученная при промывке фракция 2:	примере
эстрон, мг/л	промежуточная	125,0
эквилин, мг/л	промывка не	0,0
крезол, мг/л	проводилась	0,0
Полученная при промывке фракция 3:
эстрон, мг/л		290,6
эквилин, мг/л		138,0
крезол, мг/л		31,5

Стадия в)
Элюент	этанол/вода	этанол/вода
	30:70	30:70
Температура элюирования	45°С	45°С
Элюированная фракция 1:
СВ, мас.%	4,3	0,2
эстрон, мг/л (мас.% СВ)	0,0 (0,00)	342,7 (17,14)
эквилин, мг/л (мас.% СВ)	24,8(0,06)	182,6(9,13)
Элюированная фракция 2:
СВ, мас.%	1,9	0,9
эстрон, мг/л (мас.% СВ)	2788,6 (14,68)	2053,5 (22,81)
эквилин, мг/л (мас.% СВ)	1528,0 (8,04)	1120,1 (12,45)
Элюированная фракция 3:
СВ, мас.%	0,2	0,2
эстрон, мг/л (мас.% СВ)	193,2 (9,66)	38,9(1,95)
эквилин, мг/л (мас.% СВ)	99,8 (4,99)	19,8 (0,99)
Элюированная фракция 4:
СВ, мас.%	0,1	0,1
эстрон, мг/л (мас.% СВ)	7,1 (0,71)	0.0 (0,00)
эквилин, мг/л (мас.% СВ)	9,3 (0,93)	0,0 (0,00)

Пример 3 (предлагаемый в изобретении способ с охлаждением) Уменьшение потери гормонов при нейтральной промывке

В этом примере работают аналогично примерам 1 и 2, но с охлаждением. Подобное охлаждение служит для минимизации потери гормонов на стадии промежуточной промывки. Проведение промежуточной промывки не при комнатной температуре, а при охлаждении смесью воды со льдом позволяет уменьшить потерю гормонов на величину, достигающую порядка 50%, и прежде всего при проведении процесса при температуре, фактически равной 0°С, соответственно близкой к 0°С. При этом целесообразно не только добавлять смесь воды со льдом, которая относительно быстро может нагреваться содержимым колонки, температура которого равна комнатной, но и более того, охлаждать до 0°С всю колонку.

Проведение экспериментов

Температуру колонки снижали до температуры, необходимой для промежуточной промывки и равной 0°С, за счет охлаждения в процессе предшествующей щелочной промывки, т.е. щелочную промывку уже проводили при 0°С. При этом для снижения температуры содержимого колонки от комнатной до 0°С достаточным оказалось добавление в процессе щелочной промывки 5 объемов слоя с температурой 0°С. Благодаря этому последующая промежуточная промывка уже могла протекать при 0°С. В процессе щелочной промывки наряду с минимизацией потери гормонов анализировали также возможное влияние температуры на отделение крезола.

В целях прямого сравнения проводили два следующих эксперимента:

Пример 3а

В этом примере щелочную промывку и промежуточную промывку проводили при комнатной температуре.

Пример 3б

В этом примере щелочную промывку и промежуточную промывку проводили при 0°С.

Все остальные операции выполняли в соответствии со стандартной методикой, рассмотренной выше для описанного в WO 98/08526 способа или в примерах 1 и 2.

Результаты экспериментов

В таблице III приведены условия проведения экспериментов при комнатной температуре и при температуре, поддерживаемой на уровне 0°С, и полученные при этом результаты.

Результаты экспериментов со всей очевидностью свидетельствуют о том, что

а) снижение температуры до 0°С не оказывает отрицательного влияния на щелочную промывку, т.е. на эффективность отделения крезола, которое протекает количественно, что подтверждают приведенные в таблице III данные;

б) потеря гормонов в процессе промежуточной промывки уменьшается в результате понижения температуры примерно на 50%, что подтверждают приведенные в таблице II данные.

Таблица II: Потеря гормонов и ее минимизация за счет проведения промежуточной промывки при 0°С
Пример №	За	36
	комнатная температура (Т около 25°С)	охлаждение смесью воды со льдом (Т около 0°С)
эстрон	2,7 мас.%	1,8 мас.%
эквилин	3,4 мас.%	1,4мас.%

В соответствии с этим добавление раствора едкого натра с поддерживаемой на уровне примерно 0°С температурой в процессе щелочной промывки позволяет также простым путем уменьшить потерю гормонов в процессе промежуточной промывки за счет ее проведения при температуре примерно 0°С без снижения эффективности отделения крезола.

Снижение температуры в процессе промежуточной промывки до примерно 0°С позволяет минимизировать неизбежную при дополнительной промежуточной промывке потерю гормонов, т.е. уменьшить ее на величину, достигающую порядка 50%.

Поддержание температуры содержимого колонки в процессе промежуточной промывки на заданном уровне можно обеспечить простым путем, проводя предшествующую промежуточной промывке щелочную промывку также при температуре около 0°С. При этом снижение температуры в процессе щелочной промывки не оказывает отрицательного влияния на эффективность происходящего в ходе нее отделения крезола.

Таблица III: Проведение предлагаемого в изобретении способа при комнатной температуре и при охлаждении
Пример №	3а	3б
	комнатная	охлаждение
	температура	смесью воды со
	(Т около 25°С)	льдом
		(Т около 0°С)
Стадия а)
Исходная МЖК
эстрон, мг/л	64,9	65,4
эквилин, мг/л	57,9	57,6
крезол, мг/л	329,0	333,0
Стадия б)
Промывочная жидкость: водный раствор	рН13	рН13
NaOH
Полученная при промывке фракция 1:
эстрон, мг/л	4,4	1,7
эквилин, мг/л	0,0	1,6
крезол, мг/л	55,1	51,6
Полученная при промывке фракция 2:
эстрон, мг/л	28,8	27,9
эквилин, мг/л	31,5	24,8
крезол, мг/л	6942,5	7011,0
Полученная при промывке фракция 3:
эстрон, мг/л	0,0	0,0
эквилин, мг/л	11,5	18,3
крезол, мг/л	2215,2	2774,0
Полученная при промывке фракция 4:
эстрон, мг/л	0,0	0,6
эквилин, мг/л	0,0	3,2
крезол, мг/л	280,6	268,6
Полученная при промывке фракция 5:
эстрон, мг/л	0,0	0,0
эквилин, мг/л	0,0	0,0
крезол, мг/л	76,6	44,1
Потеря гормонов в полученных при
промывке фракциях 1-5:
эстрон	1,5%	1,3%
эквилин	2,1%	2,4%

Промежуточная промывка
Промывочная жидкость: вода
Полученная при промывке фракция 1:
эстрон, мг/л	0,0	0,0
эквилин, мг/л	0,0	0,0
крезол, мг/л	22,8	19,4
Полученная при промывке фракция 2:
эстрон, мг/л	13,3	8,2
эквилин, мг/л	9,7	5,9
крезол, мг/л	33,2	11,8
Полученная при промывке фракция 3:
эстрон, мг/л	48,0	32,0
эквилин, мг/л	58,3	23,3
крезол, мг/л	76,0	0,0
Потеря гормонов в полученных при
промывке фракциях 1-3:
эстрон	2,7%	1,8%
эквилин	3,4%	1,4%

Стадия в)
Элюент	этанол/вода	этанол/вода
	30:70	30:70
Температура элюирования	45°С	45°С
Элюированная фракция 1:
СВ, мас.%	0,2	0,2
эстрон, мг/л (мас.% СВ)	76,0 (3,80)	58,0 (2,90)
эквилин, мг/л (мас.% СВ)	65,8 (3,29)	48,2 (2,41)
Элюированная фракция 2:
СВ, мас.%	1,0	0,9
эстрон, мг/л (мас.% СВ)	1237,0 (12,37)	1145,6 (12,73)
эквилин, мг/л (мас.% СВ)	1093,8 (10,94)	1135,0 (12,61)
Элюированная фракция 3:
СВ, мас.%	0,4	0,5
эстрон, мг/л (мас.% СВ)	607,8 (15,20)	840,0 (16,80)
эквилин, мг/л (мас.% СВ)	524,7 (13,12)	748,4 (14,97)
Элюированная фракция 4:
СВ, мас.%	0,1	0,1
эстрон, мг/л (мас.% СВ)	84,6 (8,46)	144,6 (14,46)
эквилин, мг/л (мас.% СВ)	58,2 (5,82)	107,4 (10,74)
крезол, мг/л (мас.% СВ)	0,0 (0,00)	0,0 (0,00)
Элюированная фракция 5:
СВ, мас.%	0,1	0,1
эстрон, мг/л (мас.% СВ)	21,1 (2,11)	34,3 (3,43)
эквилин, мг/л (мас.% СВ)	7,5 (0,75)	17,9 (1,79)
Элюированная фракция 6:
эстрон, мг/л	9,0	15,2
эквилин, мг/л	0,0	3,4

Пример 4 (Уменьшение содержания свободных гормонов)

В этом примере, в котором работали аналогично предшествующим примерам 1-3, анализировали, насколько уменьшается содержание свободных гормонов при переработке мочи предлагаемым в изобретении способом. Полученные результаты приведены в последующих таблицах IVa (в которой представлены данные, полученные в сравнительных экспериментах без промежуточной промывки) и IVб (в которой представлены данные, полученные в соответствующих изобретению экспериментах с промежуточной промывкой).

Таблица IV: Минимизация содержания свободных гормонов

Таблица IVa: Сравнительные эксперименты без промежуточной промывки
	Содержание свободных эстрогенов в концентрате (мас.%)		Общее содержание в концентрате конъюгированных эстрогенов в пересчете на содержание сухого вещества (мас.%)
Эксперимент 1	3,21		3,2
Эксперимент 2	3,67		4,4
Эксперимент 3	2,38		9,2
Эксперимент 4	4,14		12,2
Эксперимент 5	4,03		9,9
Таблица IVб: Эксперименты с промежуточной промывкой (по изобретению)
		Содержание свободных эстрогенов в концентрате (мас.%)		Общее содержание в концентрате конъюгированных эстрогенов в пересчете на содержание сухого вещества (мас.%)
Эксперимент 6		0,0		25,2
Эксперимент 7		0,77		17,2
Эксперимент 8		0,35		23,9
Эксперимент 9		0,20		29,3
Эксперимент 10		0,0		27,7