способ диагностики силосуемости растений

Формула изобретения

Способ диагностики силосуемости растений, отличающийся тем, что из растения-сырья выделяют и стерилизуют сок, в которые вносят штамм молочнокислых бактерий: Lactobacillus sp. RS2, Lactobacillus sp. RS3, Lactobacillus sp. RS4, Lactobacillus sp. RS7 и культивируют его в соке при температуре выше 7°С не менее трех суток, затем определяют содержание молочной кислоты, количество бактерий, витаминов и при достижении количества молочной кислоты в соке более 10 мг/мл растение сырье является пригодным для силосования.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для силосования растений, преимущественно для кормопроизводства.

Известно [1], что качество корма, получаемого путем силосования (молочнокислого сбраживания) растительной массы, зависит от многих факторов - состава силосуемой массы, содержания ее компонентов, например сахаров, белков, минеральных веществ, а также от осмонапряженности и активной кислотности сбраживаемой массы. Кроме того, кормовые качества силоса зависят от эффективности процесса силосования, которая определяется ферментативной активностью бактерий - возбудителей молочнокислого брожения, адекватностью этих бактерий особенностям субстрата, например, химическому составу биомассы растений, а также содержанию сахаров и белков в конкретной растительной массе, используемой для силосования.

Известно [2], что предварительную оценку (диагностику) силосуемости растений, а также активности молочнокислых бактерий - потенциальных компонентов стартовых культур традиционно осуществляют путем сбраживания какой-либо измельченной растительной массы, происхождение и состав которой не регламентируется.

Недостатком известного способа и соответствующих испытаний являются трудоемкость, сезонность, нестрогость воспроизведения параметров процесса - химического состава сбраживаемой массы, температурного режима, влажности, содержания питательных веществ, аэрации, микробного окружения, реакции среды.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ определения эффективности препаратов молочнокислых бактерий при силосовании провяленных трав [3]. Известный способ [3] основан на применении искусственной среды - измельченная растительная масса + (плюс) 6-10% раствор NaCl с добавлением 2-3% сахара в соотношении 3:10. Искусственную среду применяют для ускорения предварительной оценки пригодности штаммов молочнокислых бактерий для силосования. Пригодность штаммов контролируют по изменению кислотности искусственной среды.

Недостатком известного [3] способа является то, что он не предусматривает выделения из фило- и ризосферы молочнокислых бактерий, естественным образом адаптированных к конкретным растениям и условиям их выращивания и обеспечивающих получение высококачественного силоса.

Известно [1], что неадаптированные стандартные препараты для силосования не универсальны, поэтому не обеспечивают максимальной эффективности силосования, например высокой кормовой ценности. Кроме того, химический состав искусственной среды [3] неадекватен составу растительной массы, подлежащей силосованию, например из-за того, что растительная масса составляет лишь треть в искусственной среде.

Целью изобретения является повышение достоверности оценки силосуемости растительной массы.

Цель достигают тем, что из фило- и ризосферы бобовых культур, подлежащих силосованию, силосов и растительных соков и на их основе выделяют молочнокислые бактерии, например, более 40 изолятов.

Суть предлагаемого способа поясняется на примере работ по обоснованию способа силосования растительного корма для животноводства.

Для получения индивидуальных штаммов бактерий, естественной средой обитания которых является надземная часть (филосфера) и корнеобитаемый слой (ризосфера) растений, являющихся сырьем для силосования, асептически отбирали соответствующие пробы фило- и ризосферы бобовых растений козлятника восточного, клевера лугового и люцерны посевной. Готовили смывы стерильной водопроводной водой, которые использовали для посева на селективную среду Рогозы [6] с последующим получением индивидуальных штаммов - возбудителей молочнокислого брожения [4]. Всего получено 15 штаммов с характерными морфофизиологическими свойствами молочнокислых бактерий. По скорости образования молочной кислоты и ее количеству семь из них выбраны для последующего изучения [5]. С целью идентификации этих микроорганизмов проведен анализ морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков, которые представлены в Табл.1. По совокупности результатов дифференциально-диагностического тестирования, выделенные молочнокислые бактерии отнесены к семейству Lactobacillaceae, роду Lactobacillus.

Индивидуальные штаммы выделены из надземной части вегетирующих бобовых растений (штаммы RS1, RS3, RS4), их ризосферы (RS5), растительных соков (RS6, RS7) и силосов (RS2) методом глубинного посева на селективную среду Рогозы (рН 5.5). Для сравнения взяли Lactobacillus plantarum BS 933 из коллекции ИБФМ РАН.

Модельные эксперименты проведены на базе соков бобовых растений, подлежащих силосованию, - козлятника восточного (Galega orientalis), клевера лугового (Trifolium pratense) и люцерны посевной (Medicago sativa).

Из растения-сырья выделяют и стерилизуют сок, вносят в сок штаммы выделенных молочнокислых бактерий и культивируют их в соке при температуре выше плюс 7°С не менее трех суток, определяют продукты брожения, количество бактерий, витаминов, и при достижении количества молочной кислоты в соке более 10 мг/мл растение-сырье оценивают как пригодное для силосования. В последующем из выделенных штаммов молочнокислых бактерий для силосования применяют те бактерии, которые обеспечивают оптимальные по целевому назначению показатели кормовой массы. Например, под целевым назначением подразумевается получение корма для конкретных видов животных.

Изобретение поясняется следующими конкретными примерами применения способа.

Пример 1. Из бобовых растений, находившихся в стадии бутонизации, получен натуральный сок, количество которого составило 227, 253 и 200 мл в 1 кг провяленной массы козлятника восточного, клевера лугового и люцерны посевной, соответственно. Водорастворимые углеводы, являющиеся главным источником энергии для молочнокислых бактерий и предшественниками естественных консервантов силоса - органических кислот, составили около 2.5%, 3.5% и 0.48% в соках вышеперечисленных растений, соответственно (Табл.2). Углеводный состав растительного сока анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе Series-200 (Perkin Elmer, USA), оснащенном колонкой (300×7,8 мм) и детектором (refractive index detector). Для элюции использовали воду особой чистоты (системы Millipore, Direct-Q). Скорость мобильной фазы - 0,5 мл/мин, температура 80°С. Для подготовки проб использовали картриджи SerPak С-18 фирмы TESSEK Ltd. Prague (Республика Чехия), заполненных сорбентом Separon марки SGX-C18 (зернение 60 мкм, диаметр пор 80А).

Для свежего растительного сока значения рН находятся в пределах 5.5-6.5 [1]. В наших экспериментах значения рН свежих растительных соков были сопоставимы: в соке козлятника 6.2, клевера 6.15 и люцерны 6.12 (Табл.3). Поскольку активная кислотность среды является важнейшим регулятором силосования, в Табл.3 суммированы данные по динамике рН в ходе сбраживания сока козлятника под действием Lactobacillus sp. RS1 Lactobacillus sp. RS2, Lactobacillus sp. RS3, Lactobacillus sp. RS4, Lactobacillus sp. RS5, Lactobacillus sp. RS6, Lactobacillus sp. RS7 и L.plantarum BS 933. Табл.3 дает представление как о скорости снижения рН, так и о максимально достижимой активной кислотности в опыте. После завершения ферментации (по истечении 45 суток) рН среды в растительном соке козлятника варьировал в пределах от 4.04 до 4.27, клевера - от 3.89 до 4.59. В варианте с люцерной отмечен сдвиг в щелочную область (8.42-8.85). Это объясняется высоким содержанием минерализуемого органического азота в растительной массе люцерны, которое в 1.4 и 1.6 раза больше по сравнению с таковым в массе козлятника и клевера, соответственно.

Эти данные согласуются с Табл.4, где приведено абсолютное содержание молочной и уксусной кислот при сбраживании испытуемых соков под действием каждого из восьми штаммов бактерий. Молочную кислоту определяли с использованием ВЭЖХ (Perkin Elmer,USA). Колонка (250×4,6 мм) с детектором (refractive index detector) [7]. Элюцию проводили 0,1% Н₃PO ₄ при скорости элюента 0,6 мл/мин, температуре 30°С. Пробоподготовку осуществляли с помощью картриджей SerPak С-18.

Молочная кислота является главным продуктом молочнокислого брожения, обладающим диетическими свойствами. Результаты, представленные в Табл.4, показывают содержание молочной и уксусной кислот по завершении процесса ферментации сока козлятника. Наибольшее количество этих кислот (молочная/уксусная) выявлено в вариантах со штаммами: L.plantarum BS 933 - 17.2/3.4, Lactobacillus sp. RS3 - 16.4/2.2, Lactobacillus sp. RS4 - 13.5/1.1, Lactobacillus sp. RS7 - 12.7/1.6 мг/мл растительного сока. Весовое соотношение кислот молочная/уксусная составило 5.1, 7.5, 12.3, и 7.9, соответственно.

В случае клевера максимальные концентрации молочной и уксусной кислот установлены в вариантах со штаммами Lactobacillus sp. RS3 (18.3/3.0 мг/мл), L.plantarum BS 933 (17.5/2.0 мг/мл), Lactobacillus sp. RS1 (15.1/0.8 мг/мл), Lactobacillus sp. RS4 (14.4/1.6 мг/мл) и Lactobacillus sp. RS7 (12.9/1.3 мг/мл), при кратности отношения молочной кислоты к уксусной 6.1, 8.8, 18.9, 9.0 и 9.9, соответственно.

Напротив, в модельном опыте с соком люцерны отмеченная выше слабощелочная реакция среды соотносится с низким содержанием органических кислот в сбраживаемом субстрате. Уровни молочной и уксусной кислот были сопоставимы и находились в диапазоне 1.6-5.5 мг/мл и 1.4-5.1 мг/мл, соответственно, а отношение количества кислот молочная/уксусная варьировало в пределах от 0.9 до 2.8.

Полученные данные позволяют дать достоверную оценку силосуемости козлятника и клевера, и несилосуемости люцерны. И динамика рН (Табл.3), и накопление молочной и уксусной кислот, и преобладание диетически наиболее ценной молочной кислоты над уксусной (Табл.4) характеризуют силосуемость козлятника и клевера. Напротив, все параметры силосования: низкий уровень сахаров в соке, низкие количества образующих кислот и смещение рН в щелочную область, свидетельствуют о несилосуемости люцерны.

Все местные штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus sp. RS1 - Lactobacillus sp. RS7, а также коллекционный штамм L.plantarum BS 933 проявили высокую активность сбраживания соков. При этом штаммы Lactobacillus sp. RS3 и L.plantarum BS 933 более эффективны при сбраживании козлятника и клевера. Об этом свидетельствуют скорость и абсолютный уровень снижения рН, накопления кислот и соотношения молочной и уксусной кислот.

Пример 2. В Табл.5 приведена характеристика динамики численности испытуемых штаммов молочнокислых бактерий (отобранных по предлагаемому способу) в процессе сбраживания сока козлятника и клевера. Молочнокислые бактерии учитывали на селективной среде Рогозы [6] следующего состава (г/л): пептон - 10; дрожжевой экстракт - 10; мясной экстракт - 10; гидролизат казеина - 5; глюкоза - 20; CH₃COONa - 13; СН₃COONH₄ - 2; цитрат натрия - 2,8; КН₂PO₄ - 6; MgSO₄ - 1,5; MnSO ₄ - 0,4; FeSO₄ - 0,15, агар - агар - 20; твин ⁸⁰ - 1 мл. рН среды доводили до рН 5,5 ледяной уксусной кислотой. Культивировали при 37°С в стационарных условиях.

При сбраживании сока козлятника максимальное количество молочнокислых бактерий отмечено через 3 сут в случае штаммов Lactobacillus sp. RS4, Lactobacillus sp. RS5, Lactobacillus sp. RS6, Lactobacillus sp. RS7 (128-131·10 ⁶ КОЕ/мл) и через 10 сут - в случае Lactobacillus sp. RS1, Lactobacillus sp. RS5, Lactobacillus sp. RS6, L.plantarum BS 933 (180-191·10⁶ KOE/мл).

В варианте с клеверным соком наибольшая концентрация молочнокислых бактерий (до 156·10⁶ КОЕ/мл) отмечена через 3 сут в случае штамма Lactobacillus sp. RS3. Динамика численности Lactobacillus sp. RS1, Lactobacillus sp. RS3 и L.plantarum BS 933 иная - максимум приходился на 10 сут.

Таким образом, динамика численности молочнокислых бактерий согласуется с количеством (Табл.5) и составом продуктов брожения (Табл.4), и тем самым повышается достоверность оценки силосуемости растений.

Кроме того, в опытах отмечено повышение в сброженных соках несинтезируемых животным организмом витаминов А и Е (Табл.6). Известно [8], что наличие витамина А оказывает иммуностимулирующее действие на животных. Витамин Е участвует в регуляции репродуктивной функции.

Витамины А и Е определяли методом омыления проб щелочью, экстракции и отделения неомыляемой части липидов. Разделение витаминов А и Е и их количественное определение проводили с помощью ВЭЖХ (Perkin Elmer,USA) с обращено-фазной колонкой (4.6×83 мм, РЕ Reduced-Activity 3 m С18) детекторами длин волн (канал А-324 нм, канал В-294 нм) - диодно-матричным и флуориметрическим. Элюцию проводили системой растворителей метанол-вода (98:2). Скорость растворителя 1 мл/мин, температура 25°С. Время удерживания ретинола (витамина А) 2.5 мин, токоферола (витамина Е) 5.9 мин [9].

Приведенные примеры показывают, что использование предлагаемого изобретения способствует получению полноценного корма для животных, например - дойного рогатого скота, обеспечивающего животных сбалансированным питанием, в том числе - содержащим несинтезируемые в организме витамины А и Е. Кроме того, с кормом, приготовленным с использованием предлагаемого способа диагностики силосуемости, кишечная микрофлора животных обогащается весьма полезными формами лактобацилл, что способствует укреплению здоровья животных и повышению их продуктивности.

Использованная литература

1. McDonald P., Henderson N., Heron S. The biochemistry of silage. 2nd ed. Marlow, UK: Chalcombe Publications, 1991. - 249 р.

2. Победнов Ю.А., Вайсбах Ф., Палов Г. Эффективность препаратов молочнокислых бактерий при силосовании трав // Аграрная наука. - 1997. - №4. - С.35-38.

3. Патент Р.Ф. RU 2173060 С2. Бюллетень №25, 10.09.2001. Победнов Ю.А., Вайсбах Ф., Палов Г., Гетьман О.А. Способ определения эффективности препаратов молочнокислых бактерий при силосовании провяленных трав.

4. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Е.З. Практикум по микробиологии - 5. перераб., доп.изд. - М.: Дрофа, 2004. - 256 c.

5. Методы бактериологии / Под ред. Ф.Герхарда. - М.: Мир, т.1. - 254 с.

6. Rogosa М., Mitchell J.A., Wiesman R.F. A selective medium for isolation and enumeration of oral and fecal lactobacilli // J. Appl. Bacteriol. 1951. V.62. P.132-133.

7. Ohmomo S., Tanaka O., Kitamoto H. Analysis of organic acids in silage by high-performance liquid chromatography // Bull. Natl. Grassl. Res. Inst. - 1993. - V.48. - P.51-56.

8. Уотсон С.Дж., Нэш М.Дж. Приготовление и использование сена и силоса - М.: Колос, 1964. - С.191-420.

9. Скурихин В.Н., Шабаев С. В. Методы анализа витаминов А, Е, D и каротина в кормах, биологических объектах и продуктах животноводства - М.: Химия, 1996. - 96 с.

Таблица 1. Культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства изолятов молочнокислых бактерий
Свойства	Штаммы
	RS1	RS2	RS3	RS4	RS5	RS6	RS7
морфологические:
форма клеток	палочки	палочки	палочки	палочки	палочки	палочки	палочки
грам-принадлежность	Гр+	Гр+	Гр+	Гр+	Гр+	Гр+	Гр+
кислотоустойчивость	+	+	+	+	+	+	+
спорообразование	-	-	-	-	-	-	-
подвижность	-	-	-	-	-	-	-
культуральные:
форма колоний	мелкие, выпуклые	мелкие, плоские	мелкие выпуклые	мелкие выпуклые	мелкие выпуклые	мелкие выпуклые	мелкие выпуклые
цвет колоний	бесцветные	бесцветные	белые матовые	белые матовые	белые матовые	бесцветные	бесцветные
рост на жидких средах	придонный	придонный	придонный	придонный	придонный	равномерный рост по всей толще среды	придонный

Свойства	RS1	RS2		RS3	RS4	RS5	RS6	RS7
биохимические:
каталаза	-		-	-	-	-	-	-
гем-синтезирующая способность (бензидиновая реакция)	-		-	-	-	-	-	-
восстановление NO- 3	-		-	-	-	-	-	-
газообразование из глюкозы	-		-	-	-	-	-	-
продукция лактата, мг/мл	15.1		11.1	18.3	14.4	12.4	11.1	12.9
продукция ацетата, мг/мл	0.8		1.2	3.0	1.6	1.4	0.9	1.3
сбраживание углеводов:
сорбит	-		-	-	-	-	-	-
глюкоза	+		+	+	+	+	+	+
Свойства	RS1		RS2	RS3	RS4	RS5	RS6	RS7
фруктоза	+		+	+	+	+	+	+
рамноза	-		-	-	-	-	-	-
ксилоза	-		-	-	-	-	-	-
галактоза	+		+	+	+	+	+	+
арабиноза	-		-	-	-	-	-	-
мальтоза	+		+	+	+	+	+	+
сахароза	+		+	+	+	+	+	+
рафиноза	±		-	-	-	-	-	-
+, наличие активности; -, отсутствие активности

Таблица 2. Количественный состав сахаров растительных соков, г/кг
Углеводы			Козлятник восточный				Клевер луговой				Люцерна посевная
Глюкоза			14.9				22.5				3.7
Фруктоза			9.4				11.9				0.8
Мальтоза			1.0				1.0				0.3
Всего:			25.3				35.4				4.8
Таблица 3. рН в начале и в конце процесса сбраживания соков бобовых трав
Время, сут	Штаммы молочнокислых бактерий
	Lactobacillus sp. RS1	Lactobacillus sp. RS2		Lactobacillus sp. RS3		Lactobacillus sp. RS4		Lactobacillus sp. RS5		Lactobacillus sp. RS6		Lactobacillus sp. RS7		L.plantarum BS 933
	Козлятник восточный
0	6.2	6.2		6.2	6.2				6.2	6.2		6.2	6.2
45	4.04	4.16		4.2	4.14				4.15	4.03		4.07	4.09
	Клевер луговой
0	6.15	6.15		6.15	6.15				6.15	6.15		6.15	6.15
45	4.08	3.94		3.93	3.95				3.96	3.9		4.09	3.89
	Люцерна посевная
0	6.12	6.12		6.12	6.12				6.12	6.12		6.12	6.12
45	8.15	8.58		8.64	8.42				8.6	8.37		8.34	8.65

Таблица 4. Концентрация органических кислот по завершении сбраживания сока
Кислоты, мг/мл	Штаммы молочнокислых бактерий
	Lactobacillus sp. RS1	Lactobacillus sp. RS2	Lactobacillus sp. RS3	Lactobacillus sp. RS4	Lactobacillus sp. RS5	Lactobacillus sp. RS6	Lactobacillus sp. RS7	L.plantarum BS 933
	Козлятник восточный
молочная	9	9.5	16.4	13.5	12	11.6	12.7	17.2
уксусная	1.2	0.7	2.2	1.1	1.5	1.5	1.6	3.4
Клевер луговой
молочная	15.1	11.1	18.3	14.4	12.4	11.1	12.9	17.5
уксусная	0.8	1.2	3	1.6	1.4	0.9	1.3	2
Люцерна посевная
молочная	1.6	4.1	3.4	3.8	4	4.4	5.5	1.6
уксусная	1.6	1.9	2.6	2.9	4.3	1.6	2.8	1.4

Таблица 5. Динамика численности молочнокислых бактерий в процессе ферментации соков бобовых трав, инокулированных индивидуальными штаммами лактобацилл
Время, сут	Штаммы молочнокислых бактерий, млн*КОЕ/мл
	Lactobacillus sp. RS1	Lactobacillus sp. RS2	Lactobacillus sp. RS3	Lactobacillus sp. RS4	Lactobacillus sp. RS5	Lactobacillus sp. RS6	Lactobacillus sp. RS7	L.plantarum BS 933
	Козлятник восточный
0	1.1	1	1.1	1.1	1.1	1	1	1
3	76	81.1	96.8	131	130	128	130	97
10	191	153	165	174	198	180	163	180
20	44	76.7	86	81	73.2	75	38	76
30	12.4	13.8	37.6	38	21	34	18.5	28.5
45	4	4.8	5.2	3.7	4.1	5.1	1.1	4.3
Клевер луговой
0	1.1	1	1.1	1.1	1.1	1.1	1	1
13	126	120	156	104	112	108	116	148
10	195	165	240	190	188	165	186	225
20	72	68	108	93	113	108	100	86.8
30	35	23.2	47	33.5	41.6	46	36	38.5
45	2	3.1	4.8	4.5	6.9	2.5	0.5	4.6
КОЕ - колониеобразующие единицы

Таблица 6. Количественное содержание витаминов А и Е в исходных и сброженных растительных соках
Штаммы молочнокислые бактерии	Витамин А		Витамин Е
	растительный сок	после ферментации	растительный сок	после ферментации
козлятник восточный
Lactobacillus sp. RS3	0.47 ME	2.27 ME	0.16 мкг/мл	1.28 мкг/мл
Lactobacillus sp. RS4	0.47 ME	0.51 ME	0.16 мкг/мл	0.22 мкг/мл
Lactobacillus sp. RS6	0.47 ME	0.79 ME	0.16 мкг/мл	0.14 мкг/мл
клевер луговой
Lactobacillus sp. RS3	0.32 ME	1.28 ME	0.03 мкг/мл	0.8 мкг/мл
Lactobacillus sp. RS4	0.32 ME	1.19 ME	0.03 мкг/мл	5.6 мкг/мл
Lactobacillus sp. RS6	0.32 ME	1.77 ME	0.03 мкг/мл	9.2 мкг/мл
ME - международные единицы (1 МЕ витамина А соответствует 0.344 мкг кристаллического ретинил ацетата)