способ прогнозирования обострений лепрозных невропатий у больных лепрой

Формула изобретения

Способ прогнозирования обострений лепрозных невропатий у больных лепрой, состоящий в определении антител к антигену периферических нервов в сыворотке крови больных лепрой, отличающийся тем, что по наличию антител к церамиду в сыворотке крови и повышению их уровня от 0,26 единиц оптической плотности и выше прогнозируют обострения лепрозных невропатий у больных лепрой.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к лепрологии, и может быть, в частности, использовано для прогнозирования обострений лепрозных невропатий и невропатий нелепрозной этиологии.

Из практики медицины известно о прогнозировании обострений лепрозных невропатий, основанных на субъективных данных - жалобы больного на резкую боль в области нервного ствола; объективных данных - отек окружающих тканей, резкая болезненность периферических нервов при пальпации, утолщение нервных стволов, нарастание чувствительных, двигательных, трофических расстройств [Аламдаров И.Н., Вербина Н.К., Белопасов В.В. Клиника и лечение лепрозных невритов. Метод. рекомендации. - Астрахань, 1974. - 10 с.]. Недостатком известного способа прогнозирования является недостаточная точность способа, связанная с субъективной оценкой признаков обострения лепрозных невропатий, а также поздней диагностикой обострения лепрозных невропатий при ярко выраженных клинических проявлениях, что не дает возможность получить конкретный технический результат - повышение точности способа.

Известен также способ прогнозирования обострений лепрозных невропатий у больных лепрой, основанный на электромиографическом исследовании периферических нервов и мышц. При обострении лепрозных невропатий более часто наблюдается II тип электромиограммы как при активном сокращении, так и при синергии. В период покоя на электромиограмме наблюдалось появление потенциалов фасцикуляций с более высоким вольтажом [Белопасов В.В. О значении изменений нервной и сосудистой систем в патогенезе некоторых лепрозных дистрофий: Дис. ... канд. мед. наук. - Астрахань, 1973. - 215 с.]. Недостатком указанного способа прогнозирования лепрозных невропатий является трудоемкость электромиографического метода и малодоступность оборудования (высокая стоимость) для практических лечебных учреждений. Кроме того, указанные изменения на электромиограмме регистрируются при наличии выраженных клинических признаков обострений лепрозных невропатий, что свидетельствует о недостаточной точности способа и не дает возможность получить конкретный технический результат - повышение точности способа.

Наиболее близким способом к предлагаемому является способ RU 2171689 С1, 10.08.2001, заключающийся в определении уровня оптической плотности антител. Сходство данного способа с предлагаемым заключается в том, что оба они относятся к области медицины, а именно к лепрологии, и основаны на определении антител к антигену периферических нервов в сыворотке крови больных лепрой.

Недостатком способа является:

- недостаточная точность способа из-за отсутствия данных по связи уровней антител к церамиду с течением лепрозных невропатий, степенью поражения периферических нервов и активностью лепрозных невропатий;

- невозможность прогнозировать обострения лепрозных невропатий.

Таким образом, перечисленные недостатки не позволяют получить конкретный технический результат - повышение точности способа.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - повышение точности способа. Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.

Решение поставленной задачи предлагаемым способом состоит в том, что по наличию антител к церамиду в сыворотке крови больных лепрой и по повышению их уровня за 5-10 месяцев до появления клинических признаков обострений лепрозных невропатий от 0,26 единиц оптической плотности и выше прогнозируют обострения лепрозных невропатий у больных лепрой.

Повышение точности предлагаемого способа дает возможность ослабить активность процесса или даже предотвратить его, снизив инвалидизирующие последствия для больного при комплексном лечении лепрозных невропатий, назначенном раньше обнаруженных клинических признаков обострений лепрозных невропатий при выявлении повышенных уровней антител к церамиду в сыворотке крови больных лепрой.

Лепра до сих пор является причиной тяжелого поражения периферической нервной системы, приводящего к развитию инвалидизирующих расстройств. Свыше четверти всех зарегистрированных больных лепрой в мире являются инвалидами, у половины вновь выявленных больных лепрой уже имеются клинические проявления невропатий [ВОЗ, 1997, 2000]. Принимая во внимание распространенность и наносимый болезнью социально-экономический ущерб, ВОЗ включила лепру в социальную программу по борьбе с тропическими болезнями.

Морфологические изменения в нерве при лепре приводят к нарушению тканевого метаболизма, обуславливая выход в кровь антигенов периферической нервной ткани (нейромаркеров) с последующей антительной реакцией на них. Обострения лепрозных невропатий возникают и в процессе противолепрозного лечения, как правило, усиливая инвалидизацию больного. Поэтому важным является установление связи между активностью процесса в периферических нервах и обнаружением в сыворотке крови больных лепрой антител к нейромаркерам, выяснение их диагностической и прогностической роли при обострении лепрозных невропатий. Комплексное лечение обострений лепрозных невропатий, назначенное раньше обнаруженных клинических признаков обострения, может ослабить активность процесса или даже предотвратить его, снизив инвалидизирующие последствия для больного.

Предлагаемый способ осуществляли следующим образом.

У больного лепрой производили забор крови из вены (1-2 мл) в пробирку, которую помещали в термостат (+37°) на 1 час, затем в холодильник (+4°) на ночь. Утром пробирку центрифугировали (3 тыс. оборотов × 15 мин), отсасывали сыворотку в пробирки Эппендорф и помещали в морозильную камеру (-20°) до использования.

Антитела к церамиду в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом (ИФА). Постановку реакции осуществляли в несколько этапов. Церамиды (фирма Sigma) разводили в абсолютном спирте и в концентрации 4 мкг/мл адсорбировали в лунки поливинилхлоридного планшета (фирма Dynatech). В каждую лунку вносили по 50 мкл антигена и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре (+20°). На следующий день планшет трижды промывали забуферным физиологическим раствором (рН 7.3) без твина (ЗФР) с помощью автоматического вошера (ПП-2428, «Дубна», Москва). Затем в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл блокирующего раствора (0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина на фосфатно-солевом буфере рН 7,4 - ФСБ), инкубировали в течение 60 мин при +37° в термостате с последующим промыванием планшеты ЗФР (3 раза). Затем в лунки вносили по 50 мкл исследуемых образцов сывороток крови, в разведении 1:200, инкубировали планшет в течение 60 мин при +37° с последующим его промыванием ЗФР (3 раза). В отмытые лунки вносили по 50 мкл антител против иммуноглобулинов человека класса М, меченных пероксидазой (фирма Vector-Best, Новосибирск), в рабочем разведении 1:500. Планшеты инкубировали в течение 60 мин при +37° с последующим его промыванием ЗФР (5 раз). Для проявления реакции в лунки добавляли по 50 мкл субстратно-буферной смеси, содержащей 0,12% перекиси водорода и 0,04% ортофенилендиамина на цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0), и оставляли при +20° в течение 20 мин. Реакцию останавливали, внося в каждую лунку по 50 мкл серной кислоты в концентрации 0,5 моль/л.

Учет реакций проводили измерением поглощения в лунках на фотометре иммуноферментном планшетном (ЭФОС 9305, фирма «Сапфир», Москва), при длине волны 490 нм. В качестве отрицательного контроля использовали пул сывороток крови от 30 доноров, а положительного контроля - сыворотку крови больного с лепрозной невропатией с высоким уровнем антител к церамиду. Уровни антител оценивали в единицах оптической плотности (ОП). За положительный принимали результат, в 2 и более раз превосходящий показатель ОП в лунках с пулом доноров.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в ФГУ «НИИ по изучению лепры Росздрава» в течение 4 лет на 133 больных лепрой, из которых 57 больных были с обострениями лепрозных невропатий.

Изложенная сущность изобретения поясняется таблицей и примерами.

Таблица 1
	Частота выявления антител к церамиду абс./%	Колебания уровней антител к церамиду (единицы оптической плотности)
Больные с обострениями лепрозных невропатий n=57	44/77,2%	0,26-1,6
Больные без обострений лепрозных невропатий n=6З	25/39,7%	0,01-0,18
Доноры n=30	2/6,6%	0,01-0,12

В таблице 1 показано, что у больных с обострениями лепрозных невропатий антитела к церамиду выявляются в 1,9 раза чаще, чем у больных без обострения лепрозных невропатий. Больные с обострениями лепрозных невропатий имеют повышенные уровни антител к церамиду, в то время как у больных без обострения лепрозных невропатий уровни антител к церамиду соответствуют донорским показателям.

Пример 1

Больная Б., 1937 года рождения (история болезни 2498). Диагноз: недифференцированный тип лепры в стадии регресса. Хроническая специфическая полиневропатия с чувствительными, амиотрофическими, двигательными нарушениями. Находилась под наблюдением в течение 4 лет, с 1999 по 2002 год.

Неврологический статус: локтевые и малоберцовые нервы утолщены с двух сторон, безболезненны при пальпации. Атрофия I межкостного промежутка кистей, hypothenar, межкостных мышц кистей, больше справа, большеберцовой мышцы слева. Выраженное снижение чувствительности до плечевых суставов и ягодичных и паховых складок с просветлением на ладонных поверхностях кистей рук и подошвенных поверхностях стоп. Мутиляций, трофических язв нет.

В июне 2001 г. больная стала предъявлять жалобы на периодические боли в ногах стреляющего характера. Объективно: клинические признаки обострения специфической невропатии малоберцового нерва с обеих сторон: утолщены малоберцовые нервы, болезненны при пальпации у наружной лодыжки с двух сторон. Было назначено специфическое лечение: кортикостериоды (преднизолон per os), десенсибилизирующие, мочегонные, болеутоляющие средства, витамины группы В, витамин Е, фонофорез с гидрокортизоном на область локтевых и малоберцовых нервов. Комплексное лечение привело к исчезновению признаков обострения. За время наблюдения у больной многократно проводился забор крови (время забора указано в таблице и графике) и сыворотки крови исследовались на присутствие антител к церамиду с помощью иммуноферментного метода. Постановку реакции осуществляли в несколько этапов. Церамиды (фирма Sigma) разводили в абсолютном спирте и в концентрации 4 мкг/мл адсорбировали в лунки поливинилхлоридного планшета (фирма Dynatech). В каждую лунку вносили по 50 мкл антигена и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре (+20°). На следующий день планшет трижды промывали забуферным физиологическим раствором (рН 7.3) без твина (ЗФР) с помощью автоматического вошера (ПП-2428, «Дубна», Москва). Затем в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл блокирующего раствора (0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина на фосфатно-солевом буфере рН 7,4 - ФСБ), инкубировали в течение 60 мин при +37° в термостате с последующим промыванием планшеты ЗФР (3 раза). Затем в лунки вносили по 50 мкл исследуемых образцов сывороток крови, в разведении 1:200, инкубировали планшет в течение 60 мин при +37° с последующим его промыванием ЗФР (3 раза). В отмытые лунки вносили по 50 мкл антител против иммуноглобулинов человека класса М, меченных пероксидазой (фирма Vector-Best, Новосибирск), в рабочем разведении 1:500. Планшеты инкубировали в течение 60 мин при +37° с последующим его промыванием ЗФР (5 раз). Для проявления реакции в лунки добавляли по 50 мкл субстратно-буферной смеси, содержащей 0,12% перекиси водорода и 0,04% ортофенилендиамина на цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0), и оставляли при +20° в течение 20 мин. Реакцию останавливали, внося в каждую лунку по 50 мкл серной кислоты в концентрации 0,5 моль/л.

Учет реакции проводили измерением поглощения в лунках на фотометре иммуноферментном планшетном (ЭФОС 9305, фирма «Сапфир», Москва), при длине волны 490 нм. В качестве отрицательного контроля использовали пул сывороток крови от 30 доноров, а положительного контроля - сыворотку крови больного с лепрозной невропатией с высоким уровнем антител к церамиду. Уровни антител оценивали в единицах оптической плотности (ОП). За положительный принимали результат, в 2 и более раз превосходящий показатель ОП в лунках с пулом доноров.

Динамика серологических показателей представлена в таблице 2 и на фиг.1.

Таблица 2
Дата (месяц, год) забора крови	Уровни антител к церамиду (показатели оптической плотности)	Клинические проявления обострения лепрозной невропатии
IV-1999	0,15	Отсутствуют
XI-2000	0,10	Отсутствуют
I-2001	0,26	Отсутствуют
III-2001	0,30	Отсутствуют
VI-2001	0,50	Имеются
IX-2001	0,55	Имеются
XII-2001	0,35	Имеются
III-2002	0,32	Имеются
VI-2002	0,20	Отсутствуют
IX-2002	0,10	Отсутствуют
XII-2002	0,03	Отсутствуют

Как видно из таблицы 2 и на фиг.1, уровень антител к церамиду у больной Б. начал повышаться (0,26 - I/2001 г.; 0,30 - III/2001 г.) за 5 месяцев до клинических признаков обострения лепрозной невропатии (0,50 - VI/2001 г.). Уровни антител были повышены (0,55 - IX/2001 г.; 0,35 - XII/2001 г.; 0,32 - III/2002 г.) в течение 8 месяцев, а затем после проведенного лечения снизились до нормальных показателей (0,20 - VI/2002 г.; 0,10 -IX/2002 г.; 0,03 - XII/2002 г.).

Таким образом, по наличию антител к церамиду в сыворотке крови больной и повышению их за 5 месяцев до появления клинических признаков обострения лепрозной невропатии от уровня 0,26 единиц оптической плотности и выше прогнозировали обострение лепрозной невропатии.

Пример 2

Больной Е., 1931 года рождения (история болезни 3850). Диагноз: лепроматозный тип лепры, активная стадия. Хроническая специфическая полиневропатия с чувствительными нарушениями, в стадии обострения. Находился под наблюдением в течение 4 лет с 1998 по 2002 год.

Больной Е. поступил с жалобами на боли в верхних конечностях. При неврологическом осмотре выявлены признаки обострения лепрозной невропатии: утолщены локтевые нервы с двух сторон, болезненны при пальпации, гипестезия на инфильтратах. Было назначено специфическое лечение: кортикостериоды, десенсибилизирующие, мочегонные, болеутоляющие средства, витамины группы В, витамин Е, фонофорез с гидрокортизоном. Комплексное лечение привело к исчезновению признаков обострения. Клинические признаки обострения лепрозных невропатий постепенно исчезли к IV/1999 г. В июне 2000 года вновь появились жалобы на ломоту, стреляющие боли в верхних и нижних конечностях, слабость в кистях рук и стопах. При осмотре выявлены клинические признаки обострения лепрозной невропатии: локтевые и малоберцовые нервы утолщены, болезненны при пальпации. К IX/2001 году признаки обострения лепрозных невропатий исчезли под действием соответствующего лечения.

За время наблюдения у больного многократно проводился забор крови (время забора указано в таблице и на фиг.2) и сыворотки крови исследовались на присутствие антител к церамиду с помощью иммуноферментного метода, описанного в примере 1.

Динамика серологических показателей представлена в таблице 3 и на фиг.2.

Таблица 3
Дата (месяц, год) забора крови	Уровни антител к церамиду (показатели оптической плотности)	Клинические проявления обострения лепрозной невропатии
IV/1998	0,68	Имеются
VIII/1998	0,65	Имеются
XI/1998	1,05	Имеются
I/1999	0,35	Имеются
IV/1999	0,15	Отсутствуют
IX/1999	0,08	Отсутствуют
XI/1999	0,53	Отсутствуют
III/2000	0,70	Отсутствуют
VI/2000	0,85	Имеются
Х/2000	1,15	Имеются
XII/2000	1,54	Имеются
III/2001	0,90	Имеются
VII/2001	0,50	Имеются
XI/2001	0,21	Отсутствуют
I/2002	0,18	Отсутствуют
III/2002	0,09	Отсутствуют

Из данных, представленных в таблице 3 и на фиг.2, видно, что больной Е. дважды за период наблюдения перенес обострения лепрозных невропатий. Высокие показатели уровня антител к церамиду в 0,68 - IV/1998 г. и 0,65 - VIII/1998 г., 1,05 - XI/1998 г., 0,35 - I/1999 г. соответствовали клиническим признакам обострения лепрозной невропатии. Ремиссия наблюдалась с IV/1999 г. по IX/1999 г. Затем вновь отмечено повышение уровней антител к церамиду 0,53 - XI/1999 г. и 0,70 - III/2000 г., а клинические признаки появились лишь в VI/2000 г. при показателе оптической плотности - 0,85, то есть за 8 месяцев до клинически диагностируемого обострения лепрозной невропатии. После проведенного лечения уровни антител к церамиду снизились до показателей донорского фона (0,09).

Таким образом, по наличию антител к церамиду в сыворотке крови больного и повышению их за 8 месяцев до появления клинических признаков обострения лепрозной невропатии с уровня 0,53 единиц оптической плотности и выше прогнозировали обострение лепрозной невропатии.

Пример 3

Больной М., 1936 года рождения (история болезни 3118). Диагноз: недифференцированный тип лепры в стадии регресса. Хроническая специфическая полиневропатия с выраженными двигательными, чувствительными, амиотрофическими нарушениями, резидуальная стадия. Больной находился под наблюдением в течение 4 лет с 1999 по 2002 год.

Неврологический статус: утолщены локтевые и ушные нервы с двух сторон, безболезненны при пальпации. Степпаж с двух сторон. Атрофия мышц кистей. Мутиляции на уровне основных фаланг II-V пальцев кистей рук справа и на уровне концевых фаланг слева. Сгибательная контрактура пальцев левой кисти и I пальца правой кисти. Анестезия до плечевых суставов и ягодичных и паховых складок. Трофические язвы подошвенной поверхности стоп с двух сторон.

С IX/2000 г. больной стал предъявлять жалобы на боли стреляющего характера в верхних и нижних конечностях. При осмотре выявлены клинические признаки обострения лепрозной невропатии: периферические нервные стволы утолщены, болезненны при пальпации.

За время наблюдения у больного многократно проводился забор крови (время забора указано в таблице и на фиг.3) и сыворотки крови исследовались на присутствие антител к церамиду с помощью иммуноферментного метода, описанного в примере 1.

Динамика серологических показателей представлена в таблице 4 и на фиг.3.

Таблица 4
Дата (месяц, год) забора крови	Уровни антител к церамиду (показатели оптической плотности)	Клинические проявления обострения лепрозной невропатии
I-1999	0,05	Отсутствуют
V-1999	0,04	Отсутствуют
VII-1999	0,10	Отсутствуют
XI-1999	0,72	Отсутствуют
IV-2000	0,60	Отсутствуют
IX-2000	0,70	Имеются
XII-2000	0,63	Имеются
III-2001	0,40	Имеются
VI-2001	0,50	Имеются
XII-2001	0,20	Отсутствуют
VI-2002	0,05	Отсутствуют

Как видно из таблицы 4 и на фиг.3, уровень антител к церамиду у больного М. начал повышаться 0,72 - XI/1999 г. за 10 месяцев до клинических признаков обострения лепрозной невропатии (0,70 - IX/2000 г.). Уровни антител были повышены 0,63 - XII/2000 г.; 0,40 - III/2001 г.; 0,50 - VI/2001 г. в течение 9 месяцев, а затем после проведенного лечения снизились до нормальных показателей 0,20 - XII/2001 г.; 0,05 - VI/2002 г.

Таким образом, по наличию антител к церамиду в сыворотке крови исследуемого больного и повышению их за 10 месяцев до появления клинических признаков обострения лепрозной невропатии от уровня 0,72 единиц оптической плотности и выше прогнозировали обострение лепрозной невропатии у данного больного лепрой.

Пример 4

Больной В., 1943 года рождения (история болезни 2263). Диагноз: лепроматозный тип лепры в стадии регресса. Хроническая специфическая полиневропатия с чувствительными, двигательными, трофическими нарушениями. Находился под наблюдением в течение 3 лет с 1999 по 2002 год.

Неврологический статус: локтевые и малоберцовые нервы утолщены, при пальпации безболезненны. Анестезия до локтевых и коленных суставов. Атрофии межкостных мышц кистей рук и стоп ног, тенара, гипотенара с двух сторон. Незначительная сгибательная контрактура пальцев кистей рук с двух сторон. Трофические язвы подошвенной поверхности стоп с двух сторон.

За время наблюдения зарегистрированы клинические признаки обострения лепрозной невропатии. В мае 2001 г. больной стал предъявлять жалобы на периодические умеренные боли в верхних конечностях ломящего характера. Объективно: локтевые нервы утолщены с двух сторон, болезненны при пальпации в области локтевых ямок. Было назначено специфическое лечение: кортикостериоды, десенсибилизирующие, мочегонные, болеутоляющие средства, витамины группы В, витамин Е, фонофорез с гидрокортизоном. Комплексное лечение привело к исчезновению признаков обострения. Клинические признаки обострения лепрозных невропатий постепенно исчезли в марте 2002 г.

За время наблюдения у больного многократно проводился забор крови (время забора указано в таблице и на фиг.4) и сыворотки крови исследовались на присутствие антител к церамиду с помощью иммуноферментного метода, описанного в примере 1.

Динамика серологических показателей представлена в таблице 5 и на фиг.4.

Таблица 5
Дата (месяц, год) забора крови	Уровни антител к церамиду (показатели оптической плотности)	Клинические проявления обострения лепрозной невропатии
Х/1999	0,09	отсутствуют
I/2000	0,05	отсутствуют
IV/2000	0,12	отсутствуют
VI/2000	0,10	отсутствуют
I/2001	0,15	отсутствуют
V/2001	0,04	имеются
IX/2001	0,03	имеются
XII/2001	0,05	имеются
III/2002	0,07	отсутствуют
IX/2002	0,03	отсутствуют

Как видно из таблицы 5 и на фиг.4, у больного в мае 2001 г. зарегистрированы клинические признаки обострения лепрозной невропатии, а уровень антител к церамиду у больного не повышался за все время наблюдения (уровень антител колебался от 0,03 до 0,15), то есть эти показатели соответствовали показателям донорского пула.

Таким образом, антитела к церамиду оставались низкими и за 4, и за 11 месяцев до клинических признаков обострения лепрозной невропатии, что наблюдалось только у 9,2% обследованных больных.

Предложенным способом достигается положительный результат, заключающийся в повышении точности способа, ослаблении активности процесса или даже предотвращении его, снизив инвалидизирующие последствия для больного при комплексном лечении лепрозных невропатий, назначенном раньше обнаруженных клинических признаков обострений лепрозных невропатий.

Предложенный способ устанавливает связь уровня антител к церамиду с активностью лепрозных невропатий. Предложенный способ объективно оценивает по сравнению с известными способами состояние обострения лепрозных невропатий у 90,8% больных при отсутствии клинических признаков обострения лепрозных невропатий - по уровню антител к церамиду.

Предложенный способ экономически выгоден, не сложен в постановке, оборудование (планшеты, ридер) отечественного производства и доступно для клинических лабораторий.

Предложенный способ может быть рекомендован в практику противолепрозных учреждений и неврологических клиник при диагностике и лечении невропатий нелепрозной этиологии.