штамм бактерий serratia marcescens, продуцирующий липолитические ферменты, для получения препарата для очистки сточных вод от жиров

Формула изобретения

Штамм бактерий Serratia marcescens KM ИБ УНЦ РАН ИБ 2-2 - продуцент липазы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается штамма бактерий - продуцента фермента липазы.

Липазы катализируют гидролиз триацилглицеридов с образованием жирных кислот и глицерина. Пищевые предприятия загрязняют окружающую среду стоками, содержащими высокие концентрации растительных и животных жиров. Поиск новых штаммов микроорганизмов - продуцентов липазы, проявляющих активность по деструкции жиров растительного и животного происхождения, является актуальной задачей.

Основными продуцентами липаз являются штаммы грибов Rhizopus [1, 2], Fusarium [3], некоторые дрожжи (Jarrowia) [4]. Известен, например, штамм грибов Fusarium oxysporum - продуцент липазы [3]. Данный штамм выращивают при температуре 30°С в течение 150-200 часов на питательной среде, содержащей, г/л:

MgSO4·7H 2O	0,5
КН2PO4	1,0
NaNO3	3,0
Пептон	30,0
Дрожжевой экстракт	1,0
Оливковое масло	10,0

Через 150 часов культивирования достигается максимальное накопление в культуральной жидкости специфической липазной активности - 150 ед.акт./мг биомассы (по сухому весу). Недостатком известного штамма является длительность культивирования (6-7 суток), сложность питательной среды и трудоемкость процедуры получения культуральной жидкости (освобождение от грибного мицелия).

Использование бактерий-продуцентов липаз обладает по сравнению с грибами преимуществом, заключающимся в ускорении процесса культивирования. Это может сделать более выгодным технологический процесс получения липазы. Известен, например, штамм Serratia marcescens 345 [5], который выращивают при температуре 30°С на питательной среде (рН 7,0), содержащей, г/л:

Отвар соевой муки	50,0
Мочевина	0,1
MgSO4·7H 2O	0,1
KH2PO4	0,2

Через 24 часа в культуральной жидкости накапливается максимальное количество липазы со специфической активностью 95 ед.акт./мг биомассы (по сухому весу). Недостатком данного штамма является низкая специфическая активность продуцируемого фермента.

Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом является штамм Serratia marcescens В-10 L-1 [6], который выращивают при температуре 28-30°С на питательной среде (рН 7,0), содержащей, г/л:

MgSO4·7H 2O	0,25
КН2PO4	3,0
Na2HPO 4·2H2O	7,0
NH4Cl	1,0
CaCl2·2H 2O	0,02
NaCl	0,5
Отвар соевой муки	50,0

Максимальное накопление липазы характеризуется величиной, составляющей 800 ед.акт./мг биомассы (по сухому весу).

Недостатком данного штамма является сравнительно низкая специфическая активность продуцируемого фермента.

Технической задачей изобретения является получение нового бактериального штамма, обеспечивающего более высокий выход липазы, проявляющей активность по деструкции твердых жиров животного и растительного происхождения.

Поставленная задача достигается предлагаемым штаммом Serratia marcescens ИБ 2-2, выделенным из образца сточных вод, отобранного в аэротенке биологических очистных сооружений пермского мясокомбината. Штамм поддерживается в коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН. Штамм Serratia marcescens ИБ 2-2 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки палочковидные, прямые, размером 0,5-0,8×1,0-3,0 мкм, подвижные, одиночные, парные или в цепочках, спор не образуют. Грамотрицательные.

Морфологию колонии определяли после 4-5 суток роста при 28°С. На мясопептонном агаре (МПА) - круглые с ровными краями, гладкие, слегка выпуклые, непрозрачные, блестящие, кремовые, мягкой консистенции колонии, диаметр 3-5 мм.

Физиологические и биохимические признаки. Штамм является факультативным анаэробом, обладает и дыхательным и бродильным типами метаболизма, не требователен к факторам роста. Оптимальная температура роста 28-30°С, растут при 5°С и 40°С. Разжижает желатин, пептонизирует и свертывает молоко, гидролизует лецитин. Способен расти на среде Симмонса с цитратом, реакция Фогеса-Проскауэра положительная. Проба с метиловым красным положительная. Дает отрицательный оксидазный, положительный каталазный тесты. Ферментирует с образованием кислоты глюкозу, ксилозу, арабинозу, сахарозу, маннозу, галактозу, фруктозу, лактозу, мальтозу, крахмал, сорбитол, ацетат. Растет на МПА с 8% NaCl.

Штамм хранится на косяках МПА в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильно-высушенном состоянии.

Штамм идентифицирован по определителю Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. Анализ штамма путем секвенирования двух фрагментов гена 16S РНК и последующее сравнение этих фрагментов со всеми известными последовательностями, депонированными во Всемирной базе генов (GenBank), подтвердили достоверность идентификации.

Для культивирования штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 с целью получения липазы применяют питательную среду следующего состава, г/л: соевая мука - 5; дрожжевой экстракт - 60; К ₂НРО₄ - 5,0; (NH₄ )₂SO₄ - 1,0.

Количество накапливаемой биомассы штамма ИБ 2-2 определяют путем подсчета числа жизнеспособных клеток в культуральной жидкости. Для этого методом посева определяют титр бактерий в 1 мл культуральной жидкости и пересчитывают его в мг биомассы (по сухому весу), исходя из того, что 10⁹ клеток бактерий весит 0,28 мг [6].

Активность липазы определяют следующим образом. К реакционной смеси, содержащей 4,5 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН 8,0) и 5 мл 40%-ной эмульсии оливкового масла в 2%-ном поливиниловом спирте приливают 0,5 мл супернатанта культуральной жидкости. Тест-пробу инкубируют в течение 30 мин при температуре 37°С, после чего добавляют 10 мл смеси этанол: ацетон (1:1). Степень расщепления оливкового масла определяют, оттитровывая продукты гидролиза раствором гидроокиси натрия (0,05 М NaOH), в присутствии 1%-ного тимолфталеина, до возникновения голубой окраски. Контрольную пробу обрабатывают аналогично тест-пробе, но липазу вносят непосредственно перед титрованием. Специфическую активность липазы выражают в микромолях олеиновой кислоты, освобождающейся за 1 час при гидролизе субстрата 1 мл культуральной жидкости, в пересчете на количество биомассы, содержащейся в 1 мл культуральной жидкости. Расчет специфической липазной активности (ЛА), в ед. акт./мг биомассы (по сухому весу), производят по формуле:

ЛА=(V-V_k) ·K/t·V _E·C,

где V - количество 0,05 М NaOH, израсходованного на титрование тест-пробы, мл;

V_k - количество 0,05 М NaOH, израсходованного на титрование контрольной пробы, мл;

К - количество олеиновой кислоты, оттитровываемое 1 мл 0,05 М NaOH (К=50), мкмоль;

t - время реакции, час;

V_E - объем культуральной жидкости, добавляемой к реакционной смеси, мл;

С - концентрация биомассы (по сухому весу), мг/мл.

Результаты определения липолитической активности культуральной жидкости, полученной при культивировании штамма Serratia marcescens ИБ 2-2, приведены в таблице. Эти данные свидетельствуют о высокой активности липазы, продуцируемой предлагаемым штаммом микроорганизмов. Так, максимальная специфическая активность фермента штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 составляет 1018 мкМ олеиновой кислоты/ мг биомассы, что в 1,27 раза превышает величину максимальной специфической активности (800 ед. акт./мг биомассы) штамма по прототипу.

Способность липолитических ферментов, продуцируемых штаммом Serratia marcescens ИБ 2-2, к деструкции твердых жиров растительного и животного происхождения определяли следующим образом.

Пример 1. Утилизацию кулинарного жира проводят путем периодического выращивания штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 в колбах на качалке (200 об/мин), объем среды 100 мл. Состав питательной среды: соевая мука - 5; дрожжевой экстракт - 60; К₂HPO₄ - 5,0; (NH₄)₂SO ₄ - 1,0; рН среды 7,0, температура выращивания 28°С. Время выращивания 40 час. Исходное содержание кулинарного жира составляет 1 мас.%. Оценку роста бактерий проводили микроскопированием на твердой (агаризованной) питательной среде. Степень деструкции твердых жиров определяли весовым методом с использованием процесса экстракции. По окончании процесса ферментации штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 титр бактерий в культуральной жидкости составил 3,0·10⁹ КОЕ/мл, а деструкция кулинарного жира - 100%.

Пример 2. Аналогично примеру 1 утилизацию свиного жира проводят путем периодического выращивания штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 в колбах на качалке при параметрах процесса и составе питательной среды, приведенным в примере 1. Время выращивания 40 часов. Исходное содержание свиного жира составляет 1 мас.%. По окончании процесса ферментации штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 титр бактерий в культуральной жидкости составил 4,0·10⁹ КОЕ/мл, а деструкция свиного жира - 100%.

Пример 3. Аналогично примеру 1 утилизацию говяжьего жира проводят путем периодического выращивания штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 в колбах на качалке при параметрах процесса и составе питательной среды, приведенном в примере 1. Время выращивания 51 час. Исходное содержание говяжьего жира составляет 1 мас.%. По окончании процесса ферментации штамма Serratia marcescens ИБ 2-2 титр бактерий в культуральной жидкости составил 3,0·10⁹ КОЕ/мл, а деструкция говяжьего жира - 100%.

Результаты экспериментов, приведенные в примерах 1-3, свидетельствуют о высокой эффективности процесса биодеструкции твердых жиров животного и растительного происхождения под действием липолитических ферментов, продуцируемых штаммом Serratia marcescens ИБ 2-2.

Результаты экспериментов, приведенные в примерах 1-3, свидетельствуют о высокой эффективности процесса биодеструкции твердых жиров животного и растительного происхождения под действием липолитических ферментов, продуцируемых штаммом Serratia marcescens ИБ 2-2.

Таким образом, получен штамм Serratia marcescens ИБ 2-2, обладающий высокой липолитической активностью, который может быть использован в качестве основы биопрепарата для биологической очистки сточных вод или канализационных систем от жиров.

Список литературы

1. А.с. СССР 1581742 А1, опубл. 30.07.90.

2. А.с. СССР 1726513 А1, опубл. 15.04.92.

3. Р.Rapp. Production, regulation and some properties of lipase activity from Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum // Enzyme and Microbial Technology. - 1995. - V.17. - P.832-838.

4. А.с. СССР 1454852 А1, опубл. 30.01.89.

5. Башкатова Н.А., Северина Л.О. Влияние условий культивирования на биосинтез липазы у Serratia marcescens // Микробиология. - 1979. - Т.68, вып.5. - С.826.

6. Патент RU 2148645 С1, опубл. 10.05.2000.

Липолитическая активность штамма Serratia marcescens ИБ 2-2
Время культивирования, ч	Липолитическая активность, мкМ олеиновой кислоты/мг биомассы (по сухому весу)
	Штамм Serratia marcescens ИБ 2-2	Штамм Serratia marcescens В-10 L-1 (по прототипу)
5	0	91
10	53	800
15	188	300
20	393	160
25	446	42
30	1018	31
35	439	30
40	188	30
50	30	30