способ и набор для иммуноферментного определения iga1 и iga2 на основе поликлональных антител к iga

Формула изобретения

1. Способ иммуноферментного определения содержания IgA1 и IgA2 на основе поликлональных антител к IgA, характеризующийся тем, что в образце, содержащем IgA, определяют суммарное содержание IgA с помощью иммуноферментного метода, использующего в качестве связывающих антител на микропанели поликлональные антитела к IgA и те же антитела в конъюгате с пероксидазой для обнаружения связавшегося IgA, до и после обработки этого образца специфической IgA1-протеазой; при этом до обработки ферментом определяется суммарное содержание IgA1 и IgA2, а после обработки ферментом определяется исключительно IgA2, а IgA1 после расщепления IgA1-протеазой не определяется.

2. Набор для иммуноферментного определения содержания IgA1 и IgA2 на основе поликлональных антител к IgA, характеризующийся тем, что он содержит микропанель с сорбированными поликлональными антителами к IgA, конъюгат тех же антител с пероксидазой, стандартный образец с известным содержанием IgA, IgA1-протеазу и субстратный буфер.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения содержания иммуноглобулинов в препаратах, сыворотке крови и других биологических жидкостях.

Изобретение может быть использовано в медицине для определения распределения подклассов в препаратах IgA, в точной диагностике при миеломной болезни и изменения соотношения подклассов IgA при различных заболеваниях. Определение концентрации сывороточного IgA2 может использоваться для обнаружения патологии слизистой ткани. Изменение в соотношении IgA1/IgA2 связано со специфическими заболеваниями и условиями, например, анафилактическими трансфузионными реакциями, хроническим алкоголизмом, первичной нефропатией.

Для определения подклассов IgA1 и IgA2 известно использование иммуноферментного и других методов на основе специфических моноклональных антител к этим белкам [1-3]. Недостатками этих методов является трудность получения специфических антител к IgA1 и IgA2 из-за высокой гомологии этих белков, а отсюда и дороговизна соответствующих антител и моноклональных антител к этим белкам.

Для того чтобы отличить IgA1 и IgA2, применяют также специфические IgA1-протеазы, продуцируемые рядом патогенных микроорганизмов и способные расщеплять на два фрагмента исключительно IgA1, не затрагивая молекулы IgA2, но использование специфических протеаз для создания методов количественного определения IgA1 и IgA2 не известно.

Задачей заявленного изобретения является разработка на основе использования специфической IgA1-протеазы и иммуноферментного метода способа и набора для определения содержания IgA1 и IgA2 без применения специфических анти-IgA1 и анти-IgA2 антител.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ предусматривает определение суммарного содержания IgA с помощью иммуноферментного метода на основе поликлональных антител к IgA, использованных в качестве связывающих антител на микропанели и тех же антител в конъюгате с пероксидазой для обнаружения связавшегося IgA, в образце до и после обработки специфической IgA1-протеазой. При этом до обработки ферментом определяется суммарное содержание IgA1 и IgA2, а после обработки ферментом определяется исключительно IgA2, а IgA1 после расщепления IgA1-протеазой не определяется.

Набор содержит микропанель с сорбированными поликлональными антителами к IgA, конъюгат тех же антител с пероксидазой, стандартный образец с известным содержанием IgA, IgA1-протеазу и субстратный буфер.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для определения IgA1 и IgA2, обладающих хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования специфических моноклональных антител.

Пример 1. Определение содержания IgA1 и IgA2 в образцах сывороток. Для каждой сыворотки готовят 2 образца: оба содержат 40 мкл сыворотки, разбавленной в 10 раз фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl (ФБС). К одному образцу добавляют 10 мкл того же буфера, ко второму 10 мкл раствора IgA1-протеазы из Neisseria meningitides. После инкубации образцов в течение 18 ч при 37°С реакцию останавливают внесением 1 мл ФБС и замораживанием при -20°С. Раствор 5-20 мкг/мл козьих IgG антител против IgA человека в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, вносят по 120 мкл в каждую лунку микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С.Три раза отмывают микропанель фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl (ФБС) и 0,05% твин-20, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. Затем во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора ФБС и в них раститровывают для определения IgA образцы сывороток после инкубации со специфической IgA1-протеазой и без нее. После инкубации в термостате при 37°С в течение 1 ч на качалке, трехкратной отмывки ФБС с 0,05% твином-20 и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против IgA в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трехкратной отмывки ФБС с твином и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (250 мкл 0,02 М раствора тетраметилбензидина в 10 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 20 мкл 3% перекиси водорода). После 5-15 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 75 мкл 7% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Концентрацию IgA рассчитывают сравнением полученных результатов с калибровочной кривой для контрольного образца с известным содержанием IgA. В образцах без фермента определяют общее содержание IgA в сыворотках. В образцах после инкубации с ферментом - содержание IgA2, а содержание IgA1 рассчитывают по разнице этих величин.

Результаты определения приведены в таблице 1.

Пример 2. Набор для определения содержания IgA1 и IgA2. Набор содержит микропанель с сорбированными поликлональными антителами к IgA, конъюгат тех же антител с пероксидазой, стандартный образец с известным содержанием IgA, IgA1-протеазу и субстратный буфер. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

По литературным данным [4] концентрация общего IgA у мужчин составляет 1,49-2,68 мг/мл, у женщин - 1,24-2,17 мг/мл; отношение IgA1/IgA2 для мужчин 4,44±1,81, для женщин 4,81±1,85. Полученные данные, приведенные в таблице 1, соответствуют литературным. Для нормальных сывороток соотношение соответствует норме, а для миеломных нарушено в зависимости от того, миелома какого подкласса IgA наблюдается.

Таблица 1
Определение содержания IgA1 и IgA2 в сыворотках крови (звездочкой помечены больные миеломой).
№ сыворотки	IgA, Mr/Mn	IgA1, мг/мл	IgA2, мг/мл	IgA1, %	IgA2, %	IgA1/IgA2
1*	1,04	0,20	0,85	19	81	0,23
2*	0,89	0,39	0,50	44	56	0,79
3	1,08	0,89	0,19	82	18	4,68
4*	2,76	2,70	0,06	98	2	46,22
5*	0,36	0,31	0,05	87	13	6,81
6	0,96	0,75	0,22	78	22	3,48
7*	3,36	0,47	2,89	14	86	0,16
8*	1,00	0,59	0,41	59	41	1,44
9*	0,16	0,07	0,09	42	58	0,74
10*	5,88	0,73	5,15	12	88	0,14
11*	1,11	0,65	0,46	52	48	1,44
12*	0,17	0,00	0,17	0,00	100	0,00

ЛИТЕРАТУРА

1. Van den Wall Bake A.W., Daha M.R., Van der Ark A., Hiemstra P.S., Radi L. Van Es L.A. // Clin. Exp. Immunol. 1988. V.74. P.115-120.

2. Depelchin S., Dehennin J.P., Bottaro A., Carbonara A., Vaerman J.P., Sibille Y. // Int. J.Clin. Lab. Res. 1994. V.24. P.154-161.

3. Mestecky J., Hamilton R.G., Magnusson C.G., Jefferis R., Vaerman J.P., Goodall M. et al. // J.Immunol. Methods. 1996. V.193. P.103-148.

4. Berth M., Delanghe J., Langlois M., De Buyzere M. //Clinical Chemistry. 1999. V.45. P.309-310.