кислые инсулиновые препараты с повышенной стабильностью

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция, содержащая Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-человеческий инсулин, по меньшей мере одно химическое вещество, выбранное из многоатомных спиртов и их сложных и простых эфиров, по меньшей мере один консервант и воду, причем фармацевтическая композиция имеет значение рН в кислой области (рН 1-6,8).

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где по меньшей мере одно химическое вещество выбрано из Tween^® 20 и Tween^®80.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, где по меньшей мере одно химическое вещество включает глицерин и Tween^®20.

4. Фармацевтическая композиция по п.3, где по меньшей мере один консервант выбран из фенолов.

5. Фармацевтическая композиция по п.4, где по меньшей мере один консервант представляет собой м-крезол.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, дополнительно включающая цинк.

7. Фармацевтическая композиция по п.1, дополнительно включающая по меньшей мере одно изотонизирующее средство, отличное от указанного по меньшей мере одного химического вещества.

8. Фармацевтическая композиция по п.1, где по меньшей мере одно химическое вещество выбрано из полисорбата и полоксамеров.

9. Фармацевтическая композиция по п.3, где Tween^®20 присутствует в эффективном количестве, позволяющем избежать мутности.

10. Фармацевтическая композиция по п.6 со значением рН в кислой области рН 3,5-6,8.

11. Фармацевтическая композиция по п.10 со значением рН в кислой области рН 3,5-4,5.

12. Фармацевтическая композиция по п.1, где по меньшей мере один консервант выбран из фенола, крезола, хлоркрезола, бензилового спирта и парабенов.

13. Фармацевтическая композиция по п.7, где по меньшей мере одно изотонизирующее средство выбрано из маннита, сорбита, лактозы, декстрозы, трегалозы, хлорида натрия и глицерина.

14. Фармацевтическая композиция по п.1, дополнительно содержащая буфер.

15. Фармацевтическая композиция по п.14, где буфер выбран из ТРИС, фосфата, цитрата, ацетата, глицилглицина, кислот, щелочей и их солей.

16. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-человеческий инсулин находится в концентрации 60-6000 нмоль/мл.

17. Фармацевтическая композиция по п.16, в которой Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-человеческий инсулин находится в концентрации 240-3000 нмоль/мл.

18. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой по меньшей мере одно химическое вещество находится в концентрации 5-200 мкг/мл.

19. Фармацевтическая композиция по п.18, в которой по меньшей мере одно химическое вещество находится в концентрации 5-120 мкг/мл.

20. Фармацевтическая композиция по п.19, в которой по меньшей мере одно химическое вещество находится в концентрации 20-75 мкг/мл.

21. Фармацевтическая композиция по по п.13, в которой по меньшей мере одно изотонизирующее средство выбрано из глицерина и маннита и в которой указанное по меньшей мере одно изотонизирующее средство находится в концентрации 100-250 ммоль.

22. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой NaCl находится в концентрации вплоть до 150 ммоль.

23. Фармацевтическая композиция по п.14, в которой указанный буфер вещество находится в концентрации 5-250 ммоль.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид, выбранный из группы, состоящей из инсулина, метаболита инсулина, аналога инсулина, производного инсулина или их комбинаций; поверхностно-активное вещество или комбинации нескольких поверхностно-активных веществ; необязательно консервант или комбинации нескольких консервантов; и необязательно изотонизирующее средство, буфер или другие вспомогательные вещества или их комбинации, причем фармацевтическая композиция имеет значение рН в кислой области.

Эти композиции можно использовать для лечения диабета и они особенно пригодны для препаратов, в случае которых необходима высокая стабильность по отношению к термической и/или физико-механической нагрузке. Изобретение относится также к парентеральным препаратам, которые содержат такие композиции и могут применяться при диабете, а также к способам получения препаратов и повышению стабильности инсулиновых препаратов.

Во всем мире от сахарного диабета страдают примерно 120 миллионов людей. Среди них примерно 12 миллионов страдают диабетом типа I, для которых замена отсутствующей эндокринной секреции инсулина представляет собой единственную возможную в настоящее время терапию. Пораженным болезнью людям показаны продолжающиеся всю жизнь, как правило, несколько раз в сутки, инъекции инсулина. В противоположность диабету типа I, при диабете типа II, в принципе, нет недостатка в инсулине, однако, во множестве случаев, прежде всего в прогрессирующей стадии, предусматривается лечение инсулином, в случае необходимости, в комбинации с оральным антидиабетическим средством, как самой благоприятной формой терапии. В случае здоровых людей высвобождение инсулина поджелудочной железой связано с концентрацией глюкозы в крови. Повышенные уровни глюкозы в крови, которые возникают после приема пищи, быстро компенсируются соответствующим увеличением секреции инсулина. В состоянии натощак уровень инсулина в плазме снижается до базального значения, которого достаточно для обеспечения непрерывного снабжения глюкозой чувствительных к инсулину органов и тканей и для поддержания низкого продуцирования глюкозы печенью в течение ночи. Путем замены присущей организму секреции инсулина за счет экзогенного, чаще всего подкожного, введения инсулина, как правило, не достигают близкого к описанному выше качеству физиологической регуляции уровня глюкозы в крови. Часто имеют место отклонения уровня глюкозы в крови в сторону уменьшения или увеличения, которые в самых тяжелых формах могут быть угрожающими жизни. Наряду с этим, однако, повышенные уровни глюкозы в крови в течение ряда лет при отсутствии первоначальных симптомов представляют собой значительную опасность для здоровья. Широкомасштабное исследование DCCT в США ("The Diabetes Control and Complications Trial Research Group", N. Engl. J. Med., 329, 977-986 (1993)) отчетливо показало, что хронически повышенные уровни глюкозы в крови в значительной степени ответственны за развитие диабетических поздних повреждений. Диабетическими поздними повреждениями являются микро- и макроваскулярные повреждения, которые проявляются, смотря по обстоятельствам, в виде ретинопатии, невропатии или нейропатии и приводят к потере зрения, почечной недостаточности, а также к потере конечностей и, сверх того, связаны с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний. Из этого можно сделать вывод, что целью улучшенной терапии диабета в первую очередь должно быть поддерживание содержания глюкозы в крови по возможности в узких пределах физиологической области. Согласно программе более интенсивной инсулиновой терапии это должно достигаться за счет осуществляемых многократно в сутки инъекций быстро и медленно действующих инсулиновых препаратов. Быстродействующие композиции вводят до момента приема пищи, чтобы компенсировать возникающее после приема пищи повышение уровня глюкозы в крови. Медленно действующие базальные инсулины должны обеспечивать, особенно в течение ночи, основное снабжение инсулином, не приводя к гипогликемии.

Инсулин представляет собой полипептид из 51 аминокислоты, которые распределяются на 2 аминокислотные цепи: цепь А из 21 аминокислоты и цепь В из 30 аминокислот. Цепи связаны между собой двумя дисульфидными мостиками. Инсулиновые препараты уже многие годы используют для лечения диабета. При этом применяют не только встречающиеся в природе инсулины, но и с недавних пор также производные и аналоги инсулина.

Аналоги инсулина представляют собой аналоги встречающихся в природе инсулинов, а именно человеческого инсулина или животных инсулинов, которые отличаются заменой по меньшей мере одного естественно имеющегося аминокислотного остатка другими аминокислотами и/или добавлением/удалением по меньшей мере одного аминокислотного остатка из соответствующего, в остальном такого же, встречающегося в природе инсулина. При этом речь может идти также об аминокислотах, которые не встречаются в природе.

Производные инсулина представляют собой производные встречающегося в природе инсулина или аналога инсулина, которые получают путем химической модификации. Химическая модификация может состоять, например, в присоединении одной или нескольких определенных химических групп к одной или нескольким аминокислотам. Как правило, производные инсулина и аналоги инсулина по сравнению с человеческим инсулином обладают несколько измененным действием.

Аналоги инсулина с ускоренным действием описываются в Европейских патентах EP 0214826, EP 0375437 и EP 0678522. Патент EP 0124826 относится, в частности, к замещениям в положениях В27 и В28. В патенте EP 0678522 описываются аналоги инсулина, которые в положении В29 содержат различные аминокислоты, предпочтительно пролин, но не глутаминовую кислоту.

Европейский патент EP 0375437 относится к аналогам инсулина с лизином или аргинином в положении В28, которые необязательно могут быть дополнительно модифицированы в положениях В3 и/или А21.

В Европейском патенте EP 0419504 раскрываются аналоги инсулина, которые защищены от химических модификаций, согласно которому изменены аспарагин в положении В3 и по меньшей мере одна другая аминокислота в положениях А5, А15, А18 или А21.

Как правило, производные и аналоги инсулина по сравнению с человеческим инсулином обладают несколько измененным действием.

В Международной заявке WO-92/00321 описываются аналоги инсулина, в которых по меньшей мере одна аминокислота в положениях В1-В6 заменена лизином или аргинином. Такого рода инсулины, согласно заявке WO-92/00321, обладают пролонгированным действием. Пролонгированное действие проявляют также описанные в заявке на EP-А-0368187 аналоги инсулина.

Имеющиеся в продаже инсулиновые препараты с встречающимися в природе инсулинами различаются происхождением инсулина (например, инсулин крупного рогатого скота, свиньи, человеческий инсулин), а также составом, за счет чего можно влиять на профиль действия (наступление и продолжительность действия). Путем комбинации различных инсулиновых препаратов можно достигать самых различных профилей действия и устанавливать по возможности физиологические значения уровня сахара в крови. Технология рекомбинантной ДНК в настоящее время позволяет получать такие модифицированные инсулины. К ним относят инсулин Гларгин (Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-человеческий инсулин) с удлиненной продолжительностью действия. Инсулин Гларгин инъецируют в виде кислого прозрачного раствора и благодаря его свойствам в отношении растворения в физиологической области рН подкожной ткани он осаждается в виде стабильного гексамерного ассоциата. Инсулин Гларгин вводят путем инъекции один раз в сутки, и по сравнению с другими медленно действующими инсулинами он отличается своим низким сывороточным профилем и связанным с этим уменьшением опасности появления ночных гипогликемий (Schubert-Zsilavecz и др., 2, 125-130 (2001)).

Специфический препарат инсулина Гларгина, который приводит к пролонгированному действию по сравнению с описанными ранее препаратами отличается образованием прозрачного раствора с кислым значением рН. Именно при кислом значении рН инсулины, однако, проявляют пониженную стабильность и повышенную склонность к агрегации при термической и физико-механической нагрузке, которая может стать заметной в виде помутнений и выпадений осадков (образование частиц) (Brange и др., J. Ph. Sci., 86, 517-525 (1997)).

Склонности к агрегации могут дополнительно способствовать гидрофобные поверхности, которые находятся в контакте с раствором (Sluzky и др., Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 9377-9381 (1991)). В качестве гидрофобных поверхностей можно рассматривать стеклянные сосуды для препаратов, закупоривающий материал крышек или поверхность раздела раствор - находящийся сверху воздух. Наряду с этим могут действовать мельчайшие капли силиконового масла в качестве дополнительных гидрофобных зародышей агрегации при отборе суточной дозы инсулина с помощью стандартных силиконизированных инсулиновых шприцов и процесс может ускоряться.

В Международной заявке WO-01/43762 описываются водные парентеральные фармацевтические препараты, содержащие полипептид и глицерин, в случае которых должна достигаться стабилизация препарата за счет очистки от дестабилизирующих компонентов глицерина. В Международной заявке WO-00/23098 описываются инсулиновые препараты, стабилизированные полисорбатом 20 или полоксамером 188, для легочного применения, но не описывается стабилизация в кислом растворе против зародышей агрегации.

В Международной заявке РСТ/ЕР02/02625 (неопубликованная) описываются не содержащие цинка и обедненные цинком инсулиновые препараты с повышенной за счет добавки поверхностно-активных веществ стабильностью при комнатной температуре и температуре тела и механической нагрузке, но не описывается стабилизация кислых инсулиновых препаратов против гидрофобных зародышей агрегации.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является получение препаратов на основе растворимых в кислотах инсулинов с поверхностно-активными веществами, которые отличаются высокой долговременной стабильностью по отношению к нагрузкам за счет температуры или физико-механического стресса и претерпевают высокую нагрузку, обусловленную гидрофобными зародышами агрегации.

В настоящее время неожиданно обнаружено, что добавка поверхностно-активных веществ сильно повышает стабильность кислых инсулиновых препаратов и тем самым возможно даже получать препараты, которые в течение нескольких месяцев при температурной нагрузке гарантируют превосходную стабильность по отношению к гидрофобным зародышам агрегации.

Фармацевтические препараты содержат 60-6000 нмоль/мл, предпочтительно 240-3000 нмоль/мл, инсулина, метаболита инсулина, аналога инсулина или производного инсулина.

В качестве поверхностно-активных веществ могут найти применение, среди прочих, неионогенные поверхностно-активные вещества. В особенности предпочтительны фармацевтически используемые поверхностно-активные вещества, как, например, неполные и полные эфиры жирных кислот и простые эфиры многоатомных спиртов, как глицерина, сорбита и других (Span^® , Tween^®, в особенности Tween ^®20 и Tween^®80, Myrj ^®, Brij^®), Cremophor ^® или полоксамеры. Поверхностно-активные вещества в фармацевтической композиции находятся в концентрации 5-200 мкг/мл, предпочтительно 5-120 мкг/мл и особенно предпочтительно 20-75 мкг/мл.

Композиция, далее, может содержать консерванты (как, например, фенол, крезол, парабен), изотонизирующие средства (как, например, маннит, сорбит, лактоза, декстроза, трегалоза, хлорид натрия, глицерин), буферные вещества, соли, кислоты и щелочи, а также другие вспомогательные вещества. Эти вещества могут находиться в виде индивидуальных соединений или также в виде смесей.

Глицерин, декстроза, лактоза, сорбит и маннит в фармацевтическом препарате обычно находятся в концентрации 100-250 ммоль, NaCl в концентрации вплоть до 150 ммоль. Буферные вещества, как, например, фосфатный, ацетатный, цитратный, аргининовый, глицилглициновый или ТРИС (то есть 2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол) буферы, а также соответствующие соли, находятся в концентрации 5-250 ммоль, предпочтительно 10-100 ммоль. Другими вспомогательными веществами могут быть, в частности, соли или аргинин.

Объектом изобретения поэтому является фармацевтическая композиция, содержащая полипептид, выбранный из группы, состоящей из инсулина, аналога инсулина, производного инсулина, активного метаболита инсулина или их комбинаций; поверхностно-активное вещество или комбинации нескольких поверхностно-активных веществ; необязательно консервант или комбинации нескольких консервантов; и необязательно изотонизирующее средство, буферные вещества и/или другие вспомогательные вещества или их комбинации, причем фармацевтическая композиция представляет собой прозрачный раствор со значением рН в кислой области (рН 1-6,8), предпочтительно рН 3,5-6,8, наиболее предпочтительно от 3,5 до 4,5.

Предпочтительной является такая фармацевтическая композиция, в которой поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из неполных и полных эфиров жирных кислот и простых эфиров многоатомных спиртов, как глицерина и сорбита, полиолов, причем неполные и полные эфиры жирных кислот и простые эфиры глицерина и сорбита выбраны из группы, состоящей из Span ^®, Tween^®, Myrj ^®, Brij^®, Cremophor ^®, и полиолы выбраны из группы, состоящей из полипропиленгликолей, полиэтиленгликолей, полоксамеров, плюроникса, тетроникса; консервант выбран из группы, состоящей из фенола, крезола, парабена; изотонизирующее средство выбрано из группы, состоящей из маннита, сорбита, хлорида натрия, глицерина; вспомогательные вещества выбраны из группы, состоящей из буферных веществ, кислот, щелочей; аналог инсулина выбран из группы, состоящей из Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-человеческого инсулина, Lys(B3)-Glu(B29)-человеческого инсулина, Lys ^B28Pro^B29-человеческого инсулина, В28 Asp-человеческого инсулина; человеческого инсулина, в котором пролин в положении B28 заменен на Asp, Lys, Leu, Val или Ala и где в положении В29 Lys может быть заменен на Pro; AlaB26-человеческого инсулина, Des(B28-B30)-человеческого инсулина, Des(B27)-человеческого инсулина или Des(B30)-человеческого инсулина; производное инсулина выбрано из группы, состоящей из В29-N-миристоил-des(B30)-человеческого инсулина, В29-N-пальмитоил-des(B30)-человеческого инсулина, B29-N-миристоил-человеческого инсулина, B29-N-пальмитоил-человеческого инсулина, В28-N-миристоил-Lys ^B28Pro^B29-человеческого инсулина, В28-N-пальмитоил-Lys^B28Pro ^B29-человеческого инсулина, В30-N-миристоил-Thr ^B29Lys^B30-человеческого инсулина, В30-N-пальмитоил-Thr^B29Lys ^B30-человеческого инсулина, B29-N-(N-пальмитоил- -глутамил)-des(B30)-человеческого инсулина, В29-N-(N-литохолил- -глутамил)-des(B30)-человеческого инсулина, В29-N-( -карбоксигептадеканоил)-des(B30)-человеческого инсулина и В29-N-( -карбоксигептадеканоил)-человеческого инсулина.

Другим объектом изобретения является описанная выше фармацевтическая композиция, в которой инсулин, аналог инсулина, активный метаболит инсулина и/или производное инсулина находится в концентрации 60-6000 нмоль/мл, предпочтительно в концентрации 240-3000 нмоль/мл (это соответствует примерно концентрации 1,4-35 мг/мл или 40-500 единиц/мл); поверхностно-активное вещество находится в концентрации 5-200 мкг/мл, предпочтительно 5-120 мкг/мл и особенно предпочтительно 20-75 мкг/мл.

Следующим объектом изобретения является указанная выше фармацевтическая композиция, в которой глицерин и/или маннит находится в концентрации 100-250 ммоль, и/или NaCl находится предпочтительно в концентрации вплоть до 150 ммоль.

Дальнейшим объектом изобретения является указанная выше фармацевтическая композиция, в которой буферное вещество находится в концентрации 5-250 ммоль.

Другим объектом изобретения является фармацевтический инсулиновый препарат, который содержит другие добавки, как, например, соли, которые замедляют высвобождение инсулина. В него также включаются смеси из таких замедленно действующих инсулинов с вышеописанными композициями.

Еще одним объектом изобретения является способ получения фармацевтических композиций.

Также другим объектом изобретения является применение композиций для лечения сахарного диабета.

Следующим объектом изобретения является применение или добавление поверхностно-активных веществ в качестве стабилизатора во время процесса получения инсулина, аналогов инсулина или производных инсулина или содержащих их препаратов.

Ниже изобретение поясняется с помощью нескольких примеров, которые ни в коем случае не должны ограничивать объем охраны изобретения.

Примеры

Следующие примеры должны подробнее пояснять сущность изобретения, не ограничивая его объема охраны.

Сравнительные исследования

Получают различные препараты с аналогом инсулина Гларгином (Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-человеческий инсулин). Для этого инсулин Гларгин суспендируют в одной части воды для целей инъекции, растворяют при рН 3-4, добавляют другие компоненты, устанавливают значение рН, равным 4,0±0,2, с помощью соляной кислоты/NaOH и дополняют до конечного объема. Концентрация инсулина Гларгина в каждом из нижеописанных опытов составляет 3,6378 мг/мл (соответствует 100 единиц/мл). Второй препарат получают аналогичным образом, однако, добавляют еще определенное количество поверхностно-активного вещества. Растворы разливают в стеклянные сосуды емкостью 10 мл (пузырьки) и закатывают. Эти сосуды теперь помещают в стрессовые условия, имитирующие условия использования или физико-механические стрессовые условия.

1. Тест на использование. Сосуды сортируют в коробках с уплотняемыми крышками и во время исследования в течение 28 дней выдерживают при температуре +25°С и контролируемой влажности окружающего пространства в отсутствие света. Для моделирования взятия раствора пациентом один раз в сутки отбирают примерно 5 МЕ раствора с помощью обычного шприца для инсулина и выбрасывают. В начале и в конце рабочей недели эту операцию осуществляют двукратно, чтобы регулировать отбор в конце недели. Перед каждым отбором осуществляют визуальную оценку раствора в сосудах на помутнение и/или образование частиц.

2. Тест на встряхивание. Сосуды, находящиеся в коробках с уплотняемыми крышками, устанавливают на лабораторном встряхивателе с инкубатором и термостатом и встряхивают при температуре 25°С со скоростью 90 движений/мин параллельно горизонтальному движению в течение 10 дней. Спустя определенные количества времени определяют величину мутности проб с помощью лабораторного фотометра для определения мутности (нефелометра) в формальдазиновых нефелометрических единицах (Formaldazine Nephelometric Unit = FNU). Величина мутности соответствует интенсивности рассеянного излучения падающего света на суспендированные частицы в пробе.

Пример 1

Стабилизация в период использования инсулина Гларгина с помощью полисорбата 20 (Tween ^®20).

a) Раствор стерильно фильтруют через комбинацию фильтров 0,2 мкм и 0,1 мкм. Затем им наполняют инъекционные бутылочки емкостью 10 мл и закатывают крышками с вложенным уплотняющим диском.

b) Аналогично готовят сравнительный раствор, однако, в воде для целей инъекций суспендируют сначала пригодное количество поверхностно-активного вещества (10-30 ч/млн. полисорбата 20).

Образцы выдерживают при температуре +5°С, 25°С и 37°С в течение установленного периода времени. Затем в каждом случае 10 образцов подвергают тесту на использование. Результаты представлены в нижеследующих таблицах (Таблицы 1-7).

Таблица 1
Выдерживание в течение 3 месяцев при температуре 5°С
	Число пузырьков с образованием частиц спустя
Тестируемый образец	7 дней	14 дней	21 день	28 дней
инсулин Гларгин	7	10	10	10
инсулин Гларгин + 0,010 мг/мл полисорбата 20	0	0	0	0
инсулин Гларгин + 0,015 мг/мл полисорбата 20	0	0	0	0
инсулин Гларгин + 0,020 мг/мл полисорбата 20	0	0	0	1
инсулин Гларгин + 0,030 мг/мл полисорбата 20	0	0	0	0
Таблица 2
Выдерживание в течение 6 месяцев при температуре 5°С
	Число пузырьков с образованием частиц спустя
Тестируемый образец	7 дней	14 дней	21 день	28 дней
инсулин Гларгин	1	10	10	10
инсулин Гларгин + 0,010 мг/мл полисорбата 20	0	0	0	1
инсулин Гларгин + 0,015 мг/мл полисорбата 20	0	0	0	0
инсулин Гларгин + 0,020 мг/мл полисорбата 20	0	0	0	1
инсулин Гларгин + 0,030 мг/мл полисорбата 20	0	0	1	0

Таблица 3
Выдерживание в течение 3 месяцев при температуре 25°С
	Число пузырьков с образованием частиц спустя
Тестируемый образец	7 дней		14 дней	21 день	28 дней
инсулин Гларгин	9		10	10	10
инсулин Гларгин + 0,010 мг/мл полисорбата 20	2		2	2	2
инсулин Гларгин + 0,015 мг/мл полисорбата 20	0		0	0	1
инсулин Гларгин + 0,020 мг/мл полисорбата 20	0		0	0	0
инсулин Гларгин + 0,030 мг/мл полисорбата 20	0		0	0	0
Таблица 4
Выдерживание в течение 6 месяцев при температуре 25°С
	Число пузырьков с образованием частиц спустя
Тестируемый образец	7 дней		14 дней	21 день	28 дней
инсулин Гларгин	10		10	10	10
инсулин Гларгин + 0,010 мг/мл полисорбата 20	0		0	0	1
инсулин Гларгин + 0,015 мг/мл полисорбата 20	0		0	1	0
инсулин Гларгин + 0,020 мг/мл полисорбата 20	0		0	0	0
инсулин Гларгин + 0,030 мг/мл полисорбата 20	0		0	0	0
Таблица 5
Выдерживание в течение 1 месяца при температуре 37°С
	Число пузырьков с образованием частиц спустя
Тестируемый образец	7 дней		14 дней	21 день	28 дней
инсулин Гларгин	0		10	10	10
инсулин Гларгин + 0,010 мг/мл полисорбата 20	0		3	3	5
инсулин Гларгин + 0,015 мг/мл полисорбата 20	0		0	0	0
инсулин Гларгин + 0,020 мг/мл полисорбата 20	0		0	0	0
инсулин Гларгин + 0,030 мг/мл полисорбата 20	0		0	0	0
Таблица 6
Выдерживание в течение 3 месяцев при температуре 37°С
	Число пузырьков с образованием частиц спустя
Тестируемый образец	7 дней		14 дней	21 день	28 дней
инсулин Гларгин	5		9	10	10
инсулин Гларгин + 0,010 мг/мл полисорбата 20	1		1	1	1
инсулин Гларгин + 0,015 мг/мл полисорбата 20	0		0	0	0
инсулин Гларгин + 0,020 мг/мл полисорбата 20	0		0	0	0
инсулин Гларгин + 0,030 мг/мл полисорбата 20	0		0	0	0
Таблица 7
Выдерживание в течение 6 месяцев при температуре 37°С
	Число пузырьков с образованием частиц спустя
Тестируемый образец	7 дней	14 дней		21 день	28 дней
инсулин Гларгин	10	10		10	10
инсулин Гларгин + 0,010 мг/мл полисорбата 20	0	0		0	0
инсулин Гларгин + 0,015 мг/мл полисорбата 20	0	0		1	0
инсулин Гларгин + 0,020 мг/мл полисорбата 20	0	0		0	0
инсулин Гларгин + 0,030 мг/мл полисорбата 20	1	1		1	1

Без добавки полисорбата 20 в растворе уже спустя 7 дней при использовании может начаться образование частиц. За счет добавки полисорбата 20 образование частиц во время периода использования отчетливо подавляется.

Стабилизирующее действие полисорбата 20 сохраняется также при выдерживании при повышенных температурах в течение периода времени 3 месяца. Уменьшение стабилизирующего действия за счет возможного гидролиза полисорбата в кислой среде раствора по сравнению с данными, полученными после 1 месяца выдерживания, нельзя установить.

Пример 2

Стабилизация инсулина Гларгина с помощью полисорбата 20 при физико-механической стрессовой нагрузке.

а) Раствор стерильно фильтруют через комбинацию фильтров 0,2 мкм и 0,1 мкм. Затем им наполняют инъекционные бутылочки емкостью 10 мл и закрывают крышками для закатки с вложенным уплотняющим диском.

b) Аналогичным образом готовят сравнительный раствор, однако, в воде для целей инъекций суспендируют сначала пригодное количество поверхностно-активного вещества (0,010-0,030 ч/млн. полисорбата 20).

Образцы выдерживают при температуре +5°С, 25°С и 37°С в течение установленного периода времени. Затем в каждом случае 5 образцов подвергают тесту на встряхивание. Результаты представлены в нижеследующих таблицах (табл.8-10), предел 15 FNU соответствует помутнениям, которые видимы в дневном свете.

Таблица 8
Выдерживание в течение 1 месяца при температуре 5°С
		Число пузырьков > 15FNU
Тестируемый образец		0 дней		0,5 дня		1 день		2 дня		3 дня		4 дня		6 дней		8 дней		10 дней
инсулин Гларгин		0		0		0		2		3		3		4		4		4
инсулин Гларгин + 0,010 мг/мл полисорбата 20		0		0		0		0		0		1		3		4		5
инсулин Гларгин + 0,015 мг/мл полисорбата 20		0		0		0		0		0		0		0		0		0
инсулин Гларгин + 0,020 мг/мл полисорбата 20		0		0		0		0		0		0		0		0		0
инсулин Гларгин + 0,030 мг/мл полисорбата 20		0		0		0		0		0		0		0		0		0
Таблица 9
Выдерживание в течение 1 месяца при температуре 25°С
	Число пузырьков > 15FNU
Тестируемый образец	0 дней		0,5 дня		1 день		2 дня		3 дня		4 дня		6 дней		8 дней		10 дней
инсулин Гларгин	0		0		0		1		1		1		1		2		3
инсулин Гларгин + 0,010 мг/мл полисорбата 20	0		0		0		0		0		0		1		2		3
инсулин Гларгин + 0,015 мг/мл полисорбата 20	0		0		0		0		0		0		0		0		0
инсулин Гларгин + 0,020 мг/мл полисорбата 20	0		0		0		0		0		0		0		0		0
инсулин Гларгин + 0,030 мг/мл полисорбата 20	0		0		0		0		0		0		0		0		0
Таблица 10
Выдерживание в течение 1 месяца при температуре 37°С
	Число пузырьков > 15FNU
Тестируемый образец	0 дней		0,5 дня		1 день		2 дня		3 дня		4 дня		6 дней		8 дней		10 дней
инсулин Гларгин	0		0		0		2		5		5		5		5		5
инсулин Гларгин + 0,010 мг/мл полисорбата 20	0		0		0		0		0		0		0		0		0
инсулин Гларгин + 0,015 мг/мл полисорбата 20	0		0		0		0		0		0		0		0		0
инсулин Гларгин + 0,020 мг/мл полисорбата 20	0		0		0		0		0		0		0		0		0
инсулин Гларгин + 0,030 мг/мл полисорбата 20	0		0		0		0		0		0		0		0		0

Без добавки полисорбата 20 в растворе уже после 2 дней сильной физико-механической нагрузки может появляться видимое помутнение. За счет добавки полисорбата 20 образование мути во время физико-механического стресса можно отчетливо замедлять.

Стабилизирующее действие полисорбата 20 сохраняется также при выдерживании при повышенных температурах. Уменьшение стабилизирующего действия за счет возможного гидролиза полисорбата в кислой среде раствора нельзя установить.

Пример 3

Сравнение стабилизации в период использования инсулина Гларгина с помощью полисорбата 20 (Tween^®20) и с помощью полисорбата 80 (Tween^® 80).

В каждом случае открывают 10 пузырьков с 5 мл раствора для инъекции инсулина Гларгина и осуществляют: а) добавку 0,001 мг/мл полисорбата 20; b) добавку 0,01 мг/мл полисорбата 20; с) добавку 0,001 мг/мл полисорбата 80; d) добавку 0,01 мг/мл полисорбата 80, в форме концентрированного исходного раствора. Образцы затем подвергают тесту на использование. Результаты представлены в нижеследующей таблице 11.

Таблица 11
	Пузырьки с образованием частиц спустя
Тестируемый образец	7 дней	14 дней	21 день	28 дней
инсулин Гларгин + 0,001 мг/мл полисорбата 20	нет	да	да, частицы образуются усиленно	да, частицы образуются усиленно
инсулин Гларгин + 0,010 мг/мл полисорбата 20	нет	нет	нет	нет
инсулин Гларгин + 0,001 мг/мл полисорбата 80	нет	да	да, частицы образуются усиленно	да, частицы образуются усиленно
инсулин Гларгин + 0,010 мг/мл полисорбата 80	нет	нет	нет	нет

Добавка полисорбата 20 или добавка полисорбата 80 в концентрации 0,01 мг/мл равным образом способны стабилизировать раствор против образования частиц во время периода использования.