медицинские протезы, имеющие улучшенную биологическую совместимость

Формула изобретения

1. Медицинский протез, содержащий металлический материал (А), выбираемый из группы, состоящей из титана или его сплава, циркония или его сплава, тантала или его сплава, гафния или его сплава, ниобия или его сплава и хромованадиевого сплава, отличающийся тем, что поверхностные части металлического материала (А) содержат слой соответствующего гидроксидного материала (В), выбираемого из гидроксида титана, гидроксида циркония, гидроксида тантала, гидроксида гафния, гидроксида ниобия и гидроксида хрома и/или ванадия соответственно.

2. Протез по п.1, в котором металлическим материалом (А) является титан или его сплав, предпочтительно, титан.

3. Протез по п.1 или 2, в котором указанные поверхностные части содержат слой гидроксидного материала (В), приспособленный для нахождения в контакте с костью или другими тканями, когда протез располагается в организме млекопитающего.

4. Протез по п.1, выполненный с возможностью замещения анатомии или восстановления функции организма, такой как тазобедренный сустав; головка бедренной кости; вертлужная впадина; локоть, включая стержни, клинья, суставные вставки; колено, включая бедренные и большеберцовые компоненты, стержень, клинья, суставные вставки или компоненты надколенника; плечи, включая стержень и головку; запястье; лодыжки; кисть; пальцы рук; пальцы ног; позвоночник; позвоночные диски; искусственные суставы; внутричелюстные зубные имплантаты; имплантаты для пластики слуховых косточек; имплантаты среднего уха, включая наковальню, молоточек, стремечко, наковальню-стремечко, молоточек-наковальню, молоточек-наковальню-стремечко; кохлеарные имплантаты; ортопедические фиксационные устройства, такие как гвозди, винты, скрепки и пластины; сердечные клапаны; водители ритма; катетеры; сосуды; имплантаты, заполняющие пространство; имплантаты удержания слухового аппарата; имплантаты для наружной фиксации; внутриматочные устройства (ВМУ); и биоэлектронные устройства, такие как интракохлеарные или интракраниальные электронные устройства.

5. Протез по п.1, являющийся стерильным.

6. Протез по п.1, в котором слой гидроксидного материала (В) содержит одно или более биомолекулярное вещество (С), связанное с ним, при этом биомолекулярное вещество означает любую биологически активную молекулу.

7. Протез по п.6, в котором биомолекулярное вещество (С) выбрано из группы веществ, состоящей из естественных или рекомбинантных биоадгезивов; естественных или рекомбинантных факторов прикрепления клетки; естественных, рекомбинантных или синтетических биополимеров; естественных или рекомбинантных белков крови; естественных или рекомбинантных ферментов; естественных или рекомбинантных белков внеклеточного матрикса; естественных или синтетических биомолекул внеклеточного матрикса; естественных или рекомбинантных факторов роста и гормонов; естественных, рекомбинантных или синтетических пептидных гормонов; естественных, рекомбинантных или синтетических деоксирибонуклеиновых кислот; естественных, рекомбинантных или синтетических рибонуклеиновых кислот; естественных или рекомбинантных рецепторов; ингибиторов ферментов; лекарственных препаратов; биологически активных анионов и катионов; витаминов, аденозинмонофосфата (АМФ), аденозиндифосфата (АДФ) или аденозинтрифосфата (АТФ); маркерных биомолекул; аминокислот; жирных кислот; нуклеотидов (оснований РНК и ДНК) и сахаров.

8. Протез по п.6 или 7, в котором биомолекулярное вещество (С) присутствует на поверхности гидроксидного материала (В), присутствует в качестве соединения включения и/или захвачено в гидроксидном материале.

9. Протез по п.6, в котором слой гидроксидного материала (В) содержит одно или более биомолекулярное вещество или вещества (С) в количестве от 1 пикограмма на мм² до 1 мг на мм ², предпочтительно, от 0,1 нанограмма до 100 микрограмм на мм².

10. Протез по п.6 или 7, в котором биомолекулярное вещество является амфолитом.

11. Протез по п.6 или 7, в котором биомолекулярное вещество имеет изоэлектрическую точку ниже 7,0.

12. Протез по п.6 или 7, в котором биомолекулярное вещество проявляет суммарный отрицательный заряд при растворении в растворе соли, имеющем ионную силу в интервале от 0,01 до 10М, температуру в интервале от 0 до 1000°С и рН выше 7,0.

13. Способ получения медицинского протеза, как определено в п.1, заключающийся в том, что подвергают поверхностные части металлического материала (А) обработке электролизом при рН выше 7,0 для образования слоя гидроксидного материала (В), необязательно с последующей стерилизационной обработкой.

14. Способ по п.13, в котором указанную электролитическую обработку проводят при рН выше 7,0 в присутствии одного или более биомолекулярных веществ (С).

15. Способ по п.14, в котором биомолекулярное вещество является амфолитом.

16. Способ по п.14, в котором биомолекулярное вещество имеет изоэлектрическую точку ниже 7,0.

17. Способ по п.14, в котором электролитическую обработку проводят в присутствии электролита, содержащего биомолекулярное вещество с суммарным отрицательным зарядом.

18. Способ по п.13 или 14, в котором указанную электролитическую обработку проводят в присутствии электролита, имеющего ионную силу в интервале от 0,01 до 10М.

19. Способ по п.13 или 14, в котором указанную электролитическую обработку проводят при температуре от 0 до 100°С.

20. Способ по п.13 или 14, в котором электролит содержит биомолекулы в концентрации от 1 пикограмма/мл до 50 мг/мл.

21. Способ по п.13 или 14, в котором электролитическую обработку проводят при напряжении от 0,1 до 1000 В.

22. Способ по п.13 или 14, в котором электролитическую обработку проводят при напряжении ниже 10 В.

23. Способ по п.13 или 14, в котором электролитическую обработку проводят при плотности тока от 0,1 мА/см² до 1 А/ см ².

24. Способ по п.13 или 14, в котором электролитическую обработку проводят в течение от 0,5 до 24 ч.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к медицинским протезам, имеющим улучшенную биологическую совместимость.

Предпосылки изобретения

Было предложено улучшить биологическую совместимость металлических протезов, таких как титановые протезы, путем модификации их металлических поверхностей, например путем плазменного облучения, протравливания или электролиза.

Анодное окисление описано для создания толстого оксидного слоя (т.е. толще, чем естественный оксидный слой) на поверхности имплантата. Например, WO 00/72777 описывает процесс электролитического окисления, где имплантат погружают в кислотный электролит и имплантат (анод) приводят в контакт с источником электрической энергии, связанным с противоэлектродом (катодом), погруженным в такой же кислотный электролит.

Также было предложено улучшить биологическую совместимость протезов и имплантатов путем связывания или включения в состав различных активных биомолекул на поверхности протеза, например на металлической поверхности титанового протеза. Имплантаты, полученные таким образом, имеют улучшенное соответствие, проявляют повышенную сцепляемость с тканью и повышенную тканевую совместимость, имеют биологически активную поверхность для повышенного роста, дифференцировки и созревания клеток, проявляют сниженную иммунореактивность, проявляют антимикробную активность, проявляют способность к повышенной биоминерализации, приводят к улучшенному заживлению ран и/или костей, приводят к улучшенной плотности костей, имеют сниженное «время нагрузки» и вызывают меньшее воспаление.

Такое связывание обычно проводят с использованием, например, химических реагентов, имеющих две реакционноспособные функциональные группы, такие как формалин или глутаровый альдегид, но реакционноспособная природа таких агентов приводит к тому, что биомолекулы становятся биологически неактивными и/или с повышенной иммунореактивностью, которая является нежелательной.

Сущность изобретения

К настоящему времени было обнаружено, что металлические протезы, имеющие оболочку из соответствующего гидроксида металла на его металлических частях, проявляют полезные структурные свойства и свойства биологической совместимости, что является возможным получить такие устройства путем электролиза.

Следовательно, в первом аспекте изобретение относится к медицинскому протезу, содержащему металлический материал (А), выбираемый из группы, состоящей из титана или его сплава, циркония или его сплава, тантала или его сплава, гафния или его сплава, ниобия или его сплава и хромованадиевого сплава, в котором поверхностные части металлического материала (А) покрыты слоем соответствующего гидроксидного материала (В), выбираемого из гидроксида титана, гидроксида циркония, гидроксида тантала, гидроксида гафния, гидроксида ниобия и гидроксида хрома и/или ванадия соответственно.

Во втором аспекте изобретение относится к способу получения такого медицинского протеза, указанный способ включает в себя подвергание поверхностных частей металлического материала (А) обработке электролизом при условиях, которые способствуют образованию гидроксида металла с формированием слоя гидроксидного материала (В).

Кроме того, было обнаружено, что является возможным сцепление, связывание, захват и/или включение в состав В или со слоем гидроксида широкого множества биомолекул во время неорганического процесса образования такого слоя гидроксида на металлах путем электролиза. Прежде этого наблюдения предполагали, что очень сложно связать и стабилизировать немодифицированные, биоактивные биомолекулы на металле, особенно для использования в качестве биоактивных поверхностей на металле для использования в качестве имплантатов в организме позвоночного in vivo.

Следовательно, предпочтительный вариант воплощения изобретения относится к металлическому протезу, включающему в себя металлический материал (А), выбираемый из группы, состоящей из титана или его сплава, циркония или его сплава, тантала или его сплава, гафния или его сплава, ниобия или его сплава и хромованадиевого сплава, где поверхностные части металлического материала (А) покрыты слоем соответствующего гидроксидного материала (В), выбираемого из гидроксида титана, гидроксида циркония, гидроксида тантала, гидроксида гафния, гидроксида ниобия и гидроксида хрома и/или ванадия соответственно, указанный слой гидроксидного материала (В) включает одно или более биомолекулярных веществ (С), связанных с ним.

Кроме того, изобретение относится к способу получения медицинского протеза в соответствии с вышеуказанным предпочтительным вариантом воплощения изобретения, указанный способ включает в себя подвергание поверхностных частей металлического материала (А) обработке электролизом с образованием слоя гидроксидного материала (В), указанную обработку электролизом проводят в присутствии одного или более биомолекулярного вещества (С) в условиях, которые делают биомолекулу отрицательно заряженной.

Подробное описание изобретения

В данном контексте термин «медицинский протез» включает в свои рамки любое устройство, предназначенное для имплантации в тело позвоночного животного, в частности млекопитающего, такого как человек.

На медицинские протезы в данном описании также ссылаются как на (медицинские) имплантаты.

Неограничивающие примеры таких устройств представляют собой медицинские устройства, которые замещают анатомию и/или восстанавливают функцию тела, такие как тазобедренный сустав; головка бедренной кости; вертлужная впадина; локоть, включая стержни, клинья, суставные вставки; колено, включая бедренные и большеберцовые компоненты, стержни, клинья, суставные вставки или компоненты надколенника; плечи, включая стержень и головку; запястье; лодыжки; кисть; пальцы рук; пальцы ног; позвоночник; позвоночные диски; искусственные суставы; внутричелюстные зубные имплантаты; имплантаты для пластики слуховых косточек; имплантаты среднего уха, включая наковальню, молоточек, стремечко, наковальню-стремечко, молоточек-наковальню, молоточек-наковальню-стремечко; кохлеарные имплантаты; ортопедические фиксирующие устройства, такие как гвозди, винты, скрепки и пластины; сердечные клапаны; водители ритма; катетеры; сосуды; имплантаты для заполнения пространства; имплантаты для удержания слухового аппарата; имплантаты для наружной фиксации; а также внутриматочные устройства (ВМУ (IUD)); и биоэлектронные устройства, такие как интракохлеарные или интракраниальные электронные устройства.

Как правило, медицинский имплантат состоит из одной или нескольких имплантируемых частей. Например, внутричелюстной зубной имплантат обычно содержит зубное крепление, соединенное с вторичными частями имплантата, такими как опорный и/или замещенный зуб. Однако любое устройство, такое как зубное крепление, предназначенное для имплантации, может само по себе относится к имплантату, даже если к нему должны быть подсоединены другие части.

Используемый в данном описании термин «поверхностные части» относится к, по меньшей мере, одному определенному участку поверхности имплантата. Следовательно, поверхностные части могут включать в себя цельную область поверхности имплантата или ее части.

Примером поверхностных частей имплантата, предназначенного для имплантации в костную ткань, является поверхность зубного крепления, которая предназначена для имплантации в челюстную кость и находится в контакте с костной тканью.

Другим примером поверхностных частей имплантата, предназначенных для имплантации в костную ткань, является поверхность имплантата тазобедренного сустава, которая предназначена для имплантации в шейку бедренной кости пациента.

Используемый в данном описании признак «для имплантации в костную ткань» относится к имплантатам, предназначенным для, по меньшей мере, частичной имплантации в костную ткань, таким как зубные имплантаты, ортопедические имплантаты и подобные. На имплантат для имплантации в костную ткань также можно ссылаться как на имплантат костной ткани.

В данном контексте термин «биомолекула» предназначен для обозначения и включает в свое значение очень широкое множество биологически активных молекул в широчайшем смысле слова, являются ли они естественными биомолекулами (т.е. молекулами естественного происхождения, полученными из натуральных источников), синтетическими биомолекулами (т.е. молекулами естественного происхождения, полученными синтетически, а также молекулами неестественного происхождения или формами молекул, полученными синтетически) или рекомбинантными биомолекулами (т.е. полученными посредством использования рекомбинантных методик).

Неограничивающий список главных групп и видов биомолекул, которые рассматриваются как подходящие для включения в слой гидроксида металла (стабильным и/или физиологически обратимым образом) в соответствии с изобретением дан ниже.

Экстрагированные биомолекулы

Биоадгезивы:

Фибрин; фиброин; ножной белок Mytilus edulis (mefp1 «адгезивный белок двустворчатого моллюска»); другие адгезивные белки двустворчатых моллюсков; белки и пептиды с участками, богатыми глицином; белки и пептиды с полиаланиновыми участками; и шелка.

Факторы прикрепления клетки:

Факторы прикрепления клетки представляют собой биомолекулы, которые опосредуют прикрепление и распределение клеток на биологических поверхностях или других клетках и тканях. Данная группа молекул, как правило, включает в себя молекулы, участвующие во взаимодействии клетка-матрикс и клетка-клетка во время развития позвоночных, неогенеза, регенерации и заживления. Типичными биомолекулами этого класса являются молекулы на наружной поверхности клетки, как CD класс рецепторов на белых кровяных клетках, иммуноглобулины и гемагглютинирующие белки и молекулы/лиганды внеклеточного матрикса, которые прикрепляются к таким клеточным молекулам. Типичными примерами факторов прикрепления клеток с возможностью использования в качестве биоактивной оболочки на имплантатах, покрытых оболочкой гидроксида металла, являются анкирины; кадгерины (кальцийзависимые молекулы адгезии); коннексины; дерматансульфат; энтактин; фибрин; фибронектин; гликолипиды; гликофорин; гликопротеины; гепарансульфат; гепаринсульфат; гиалуроновая кислота; иммуноглобулины; кетарансульфат; интегрины; ламинины; N-CAM (кальцийнезависимые адгезивные молекулы); протеогликаны; спектрин; винкулин; витронектин.

Биополимеры:

Биополимеры представляют собой любую биологически полученную молекулу, которая, помещенная в подходящие условия, может быть собрана в полимерные макромолекулярные структуры. Такие молекулы составляют важные части внеклеточного матрикса, где они принимают участие в обеспечении эластичности, прочности, жесткости, целостности ткани и др. Некоторыми важными биополимерами с возможностью использования в качестве биоактивной оболочки на имплантатах, покрытых оболочкой гидроксида металла, являются альгинаты; амелогенины; целлюлоза; хитозан; коллаген; желатины; олигосахариды; пектин.

Белки крови:

Данный класс белков, как правило, включает любой растворенный или связанный белок, который в норме присутствует в цельной крови. Такие белки могут принимать участие в широком спектре биологических процессов, таких как воспаление, возвращение клеток, свертывание крови, передача сигнала клеткой, защита, иммунные реакции, метаболизм и др. Типичными примерами с возможностью использования в качестве биоактивной оболочки на имплантатах, покрытых оболочкой гидроксида металла, являются альбумин; альбумен; цитокины; фактор IX; фактор V; фактор VII; фактор VIII; фактор X; фактор XI; фактор XII; фактор XIII; гемоглобины (с или без железа); иммуноглобулины (антитела); фибрин; факторы роста тромбоцитов (PDGF); плазминоген; тромбоспондин; трансферрин.

Ферменты:

Ферментами являются любой белок или пептид, который обладает специфическим каталитическим эффектом на один или более биологический субстрат, которые могут быть фактически любыми от простых сахаров до комплексных макромолекул, как ДНК. Ферменты являются потенциально применимыми для инициирования биологических ответов в тканях путем деградации матриксных молекул, или они могут быть использованы для активации или высвобождения других биоактивных соединений в оболочке имплантата. Некоторыми важными примерами с возможностью использования в качестве биоактивной оболочки на имплантатах, покрытых оболочкой гидроксида металла, являются абзимы (антитела с ферментной способностью); аденилатциклаза; щелочная фосфатаза; карбоксилазы; коллагеназы; циклооксигеназа; гидролаза; изомеразы; лигазы; лиазы; металломатриксные протеазы (MMP); нуклеазы; оксиредуктазы; пептидазы; пептидная гидролаза, пептидилтрансфераза; фосфолипаза; протеазы; сахараза-изомальтаза; TIMP; трансферазы.

Белки внеклеточного матрикса и биомолекулы:

Специализированные клетки, например фибробласты и остеобласты, производят внеклеточный матрикс. Такой матрикс участвует в нескольких важных процессах. Матрикс является критичным для, помимо всего прочего, заживления ран, гомеостаза тканей, развития и заживления, прочности тканей и целостности тканей. Также матрикс отвечает за внеклеточную окружающую среду, как рН, ионная сила, осмолярность и др. Кроме того, молекулы внеклеточного матрикса являются решающими для индуцирования и регуляции образования биоминералов (кость, хрящ, зубы). Важные внеклеточные белки и биомолекулы с возможностью использования в качестве биоактивной оболочки на имплантатах, покрытых оболочкой гидроксида металла, включают амелобластин; амелин; амелогенины; коллагены (I-XII); дентин-сиалопротеин (DSP); дентин-сиалофофопротеин (DSPP); эластины; энамелин; фибрины; фибронектины; кератины (1-20); ламинины; тафтелин; углеводы; хондроитинсульфат; гепарансульфат; гепаринсульфат; гиалуроновую кислоту; липиды и жирные кислоты; липополисахариды.

Факторы роста и гормоны:

Факторы роста и гормоны являются молекулами, которые связываются со структурами поверхности клетки (рецепторами) и вызывают сигнал в клетке-мишени к началу специфического биологического процесса. Примерами таких процессов являются рост, программируемая клеточная смерть, высвобождение других молекул (например, молекул внеклеточного матрикса или сахара), дифференцировка и созревание клетки, регуляция скорости метаболизма и др. Типичными примерами таких биомолекул с возможностью использования в качестве биоактивной оболочки на имплантатах, покрытых оболочкой гидроксида металла, являются активины (Act); амфирегулин (AR); ангиопоэтины (Ang 1-4); Apo3 (слабый индуктор апоптоза, также известный как TWEAK, DR3, WSL-1, TRAMP или LARD); бетацеллюлин (BTC); основной фактор роста фибробластов (bFGF, FGF-b); кислый фактор роста фибробластов (aFGF, FGF-a); лиганд 4-1ВВ; мозговой нейротрофический фактор (BDNF); болокин молочной железы и почки (BRAK); костные морфогенетические белки (BMP); хемоаттрактант В-лимфоцитов/привлекающий В клетки хемокин 1 (BLC/BCA-1); CD27L (лиганд CD27); CD30L (лиганд CD30); CD40L (лиганд CD40); лиганд, индуцирующий пролиферацию (APRIL); кардиотрофин-1 (СТ-1); реснитчатый нейротрофический фактор (CNTF); фактор роста соединительной ткани (CTGF); цитокины; 6-цистеин хемокин (6Ckine); эпидермальные факторы роста (EGF); эотаксин (Eot); белок эпителиальных клеток, активирующий нейтрофилы 78 (ENA-78); эритропоэтин (Epo); факторы роста фибробластов (FGF 3-19); фракталкин; глиальные нейротрофические факторы (GDNF); лиганд глюкокортикоид-индуцированного рецептора ФНО (GITRL); фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов (G-CSF); фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF); хемотактические белки гранулоцитов (GCP); гормон роста (GH); I-309; связанный с ростом онкоген (GRO); ингибины (Inh); интерферон-индуцируемый альфа-хемоаттрактант Т-клеток (I-TAC); лиганд Fas (FasL); герегулины (HRG); гепаринсвязывающий фактор роста, подобный эпидермальному фактору роста (HB-EGF); fms-подобный лиганд тирозинкиназы 3 (Flt-3L); хемокины гемофильтрата СС (HCC-1-4); фактор роста гепатоцитов (HGF); инсулин; инсулино-подобные факторы роста (IGF 1 и 2); интерферон-гамма индуцируемый белок 10 (IP-10); интерлейкины (IL 1-18); интерферон-гамма (IFN-gamma); фактор роста кератиноцитов (KGF); фактор роста кератиноцитов-2 (FGF-10); лептин (OB); фактор, ингибирующий лейкемию (LIF); лимфотоксин бета (LT-B); лимфотактин (LTN); фактор, стимулирующий колонии макрофагов (M-CSF); макрофагальный хемокин (MDC); белок, стимулирующий макрофаги (MSP); воспалительные белки макрофагов (MIP); мидкин (MK); хемоаттрактантные белки моноцитов (MCP-1-4); монокин, индуцируемый IFN-gamma (MIG); MSX 1; MSX 2; мюллерова ингибирующая субстанция (MIS); фактор ингибирующий миелоидные предшественники 1 (MPIF-1); фактор роста нервов (NGF); нейротрофины (NT); пептид, активирующий нейтрофилы 2 (NAP-2); онкостатин М (OSM); остеокальцин; ОР-1; остеопонтин; лиганд OX40; тромбоцитарные факторы роста (PDGF aa, ab и bb); тромбоцитарный фактор 4 (PF4); плейотропин (PTN); легочный и регулируемый активацией хемокин (PARC); регулируемый при активации, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками (RANTES); фактор чувствительных и двигательных нейронов (SMDF); член подсемейства небольших индуцибельных цитокинов 26 (SCYA26); фактор стволовых клеток (SCF); фактор стромальных клеток 1 (SDF-1); тимусный и регулируемый активацией хемокин (TARC); тимус-экспрессируемый хемокин (TECK); ФНО и ApoLсвязанный экспрессируемый лейкоцитами лиганд-1 (TALL-1); ФНОсвязанный лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL); ФНОсвязанный цитокин, индуцированный активацией (TRANCE); лимфотоксин, индуцирующий экспрессию и конкурирующий с гликопротеином D HSV для рецептора Т-лимфоцитов HVEM (LIGHT); плацентарный фактор роста (PlGF); тромбопоэтин (Tpo); трансформирующие факторы роста (TGF альфа, TGF бета 1, TGF бета 2); факторы некроза опухолей (TNF альфа и бета); сосудистые эндотелиальные факторы роста (VEGF-A,B,C и D); кальцитонины; и стероидные соединения, такие как естественные половые гормоны, такие как эстроген, прогестерон, тестостерон, а также их аналоги. Следовательно, могут быть предложены определенные имплантаты, такие как ВМУ (внутриматочные устройства) включающие, например, эстрогены или прогестерон или их аналоги.

Нуклеиновые кислоты (ДНК):

ДНК кодирует гены белков и пептидов. Также ДНК содержит широкое множество последовательностей, которые регулируют экспрессию содержащихся генов. Существует несколько типов ДНК, в зависимости от источника, функции, происхождения и структуры. Типичными примерами молекул, основанных на ДНК, которые могут использоваться как биоактивные оболочки замедленного высвобождения на имплантатах (местная генная терапия) являются А-ДНК; В-ДНК; искусственные хромосомы, несущие ДНК млекопитающих (YAC); хромосомная ДНК; космиды, несущие ДНК млекопитающих; ДНК; двунитевая ДНК (dsDNA); геномная ДНК; гемиметилированная ДНК; линейная ДНК; кДНК млекопитающих (комплиментарная ДНК; ДНК-копия РНК); ДНК млекопитающих; метилированная ДНК; митохондриальная ДНК; ДНК млекопитающих, несущая фаги; фагемиды, несущие ДНК млекопитающих; плазмиды, несущие ДНК млекопитающих; пластиды, несущие ДНК млекопитающих; рекомбинантная ДНК; рестрикционные фрагменты ДНК млекопитающих; ретропозоны, несущие ДНК млекопитающих; однонитевая ДНК (ssDNA); транспозоны, несущие ДНК млекопитающих; Т-ДНК; вирусы, несущие ДНК млекопитающих; Z-ДНК.

Нуклеиновые кислоты (РНК):

РНК представляет собой транскрипцию информации, кодируемой ДНК. (Иногда (у некоторых вирусов) РНК является главной единицей, кодирующей информацию). Несмотря на то, что она является промежуточным продуктом экспрессии генов, было показано, что РНК имеет несколько биологических функций. Рибозимы являются простыми молекулами РНК с каталитическим действием. Такая РНК может катализировать расщепление и сшивание ДНК и РНК, гидролизовать пептиды и является основой для трансляции РНК в пептиды (рибосома является рибозимом). Типичными примерами молекул РНК с возможностью использования в качестве биоактивной оболочки на имплантатах, покрытых оболочкой гидроксида металла, являются ацетилированная транспортная РНК (активированная тРНК, насыщенная тРНК); кольцевая РНК; линейная РНК; гетерогенная ядерная РНК млекопитающих (hnRNA); информационная РНК млекопитающих (иРНК); РНК млекопитающих; рибосомальная РНК млекопитающих (рРНК); транспортная РНК млекопитающих (тРНК); иРНК; полиаденилированная РНК; рибосомальная РНК (рРНК); рекомбинантная РНК; ретропозоны, несущие РНК млекопитающих; рибозимы; транспортная РНК (тРНК); вирусы, несущие РНК млекопитающих; короткая ингибиторная РНК (siRNA).

Рецепторы:

Рецепторы представляют собой биомолекулы поверхности клеток, которые связывают сигналы (например, гормональные лиганды и факторы роста) и передают сигнал через клеточную мембрану и во внутренний аппарат клетки. Различные рецепторы являются неодинаково «связанными», производя различные внутриклеточные ответы даже на тот же самый лиганд. Это делает возможным для клеток реагировать различно на внешние сигналы путем варьирования характера рецепторов на их поверхности. Рецепторы, как правило, связывают свой лиганд обратимым образом, что делает их подходящими в качестве носителей факторов роста, которые необходимо высвободить в ткани. Следовательно, путем покрытия имплантатов оболочкой с рецепторами факторов роста и затем нагрузки этих рецепторов их основными лигандами, можно достичь биоактивной поверхности, которая может использоваться для регулируемого высвобождения факторов роста в окружающие ткани после имплантации. Примеры подходящих рецепторов с возможностью использования в качестве биоактивной оболочки на имплантатах, покрытых гидроксидом металла, включают CD класс рецепторов CD; рецепторы EGF; рецепторы FGF; рецептор фибронектина (VLA-5); рецептор фактора роста; белки, связывающие IGF (IGFBP 1-4); интегрины (включая VLA 1-4); рецептор ламинина; рецепторы PDGF; рецепторы трансформирующего фактора роста альфа и бета; рецепторы BMP; Fas; рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста (Flt-1); рецептор витронектина.

Синтетические биомолекулы

Синтетические биомолекулы представляют собой молекулы, которые основаны на (имитируют) естественных биомолекулах. При синтезе таких молекул может быть внесено широкое множество химических и структурных модификаций, которые могут стабилизировать молекулу или сделать ее более биоактивной или специфичной. Следовательно, если молекула является слишком нестабильной и неспецифичной для использования из экстрактов, является возможным спроектировать их и синтезировать для использования в качестве оболочек для покрытия поверхности имплантата. Кроме того, многие биомолекулы так мало распространены, что экстрагирование в промышленных масштабах является невозможным. Такие редкие биомолекулы необходимо получать синтетически, например путем рекомбинантных технологий или путем (био-) химии. Ниже перечислены некоторые классы синтетических молекул, которые могут быть потенциально применимыми для покрытия оболочкой имплантатов.

Синтетическая ДНК:

А-ДНК; антисенс ДНК; В-ДНК; комплиментарная ДНК (кДНК); химически модифицированная ДНК; химически стабилизированная ДНК; ДНК; аналоги ДНК; олигомеры ДНК; полимеры ДНК; гибриды ДНК-РНК; двунитевая ДНК (dsDNA); гемиметилированная ДНК; метилированная ДНК; однонитевая ДНК (ssDNA); рекомбинантная ДНК; тройная ДНК; Т-ДНК; Z-ДНК.

Синтетическая РНК:

Антисенс РНК; химически модифицированная РНК; химически стабилизированная РНК; гетерогенная ядерная РНК (hnRNA); информационная РНК (иРНК); рибозимы; РНК; аналоги РНК; гибриды РНК-ДНК; олигомеры РНК; полимеры РНК; рибосомальная РНК (рРНК); транспортная РНК (тРНК); короткая ингибиторная РНК (siRNA).

Синтетические биополимеры:

Катионные и анионные липосомы; ацетат целлюлозы; гиалуроновая кислота; полимолочная кислота; полигликольальгинат; полигликолевая кислота; полипролины; полисахариды.

Синтетические пептиды:

Декапептиды, включающие ДОПА и/или диДОПА; пептиды с последовательностью «Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys»; пептиды, где Pro замещен гидроксипролином; пептиды, где один или более Pro замещен ДОПА; пептиды, где один или более Pro замещен диДОПА; пептиды, где один или более Tyr замещен ДОПА; пептидные гормоны; пептидные последовательности, основанные на вышеуказанных перечисленных экстрагированных белках; пептиды, включающие элемент RGD (Arg Gly Asp).

Рекомбинантные белки:

Все, полученные рекомбинантно, пептиды и белки.

Синтетические ингибиторы ферментов:

Синтетические ингибиторы ферментов варьируются от простых молекул как определенные ионы металлов, которые блокируют ферментативную активность путем непосредственного связывания с ферментом, до синтетических молекул, которые имитируют естественный субстрат фермента и таким образом конкурируют с главным субстратом. Оболочка имплантата, включающая ингибиторы ферментов, может помочь стабилизировать и нейтрализовать распад других биомолекул, присутствующих в оболочке, таким образом достигается большее время реакции и/или более высокая концентрация биоактивного соединения. Примерами ингибиторов ферментов являются пепстатин; полипролины; D-сахара; D-аминокаиды; цианид; фторфосфаты диизопропила (DFP); ионы металла; N-тозил-1-фенилаланинхлорметилкетон (TPCK); физостигмин; паратион; пенициллин.

Витамины (синтетические или экстрагированные) для включения в гидроксид:

Биотин; кальциферол (витамин Д, жизненно важный для минерализации костей); цитрин; фолиевая кислота; ниацин; никотинамид; никотинамид аденин динуклеотид (NAD, NAD+); никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADP, NADPH); ретиноевая кислота (витамин А); рибофлавин; витамин В; витамин С (жизненно важный для синтеза коллагена); витамин Е; витамин К.

Другие биоактивные молекулы для включения в гидроксидные оболочки:

Аденозиндифосфат (АДФ); аденозинмонофосфат (АМФ);аденозинтрифосфат (АТФ); аминокислоты; циклический АМФ (цАМФ); 3,4-дигидроксифенилаланин (ДОФА); 5'-ди(дигидроксифенил-L-аланин) (диДОФА); диДОФА хинон; ДОФА-подобные о-дифенолы; жирные кислоты; глюкоза; гидроксипролин; нуклеозиды; нуклеотиды (РНК и ДНК основания); простагландин; сахара; сфингозин 1-фосфат; рапамицин; синтетические половые гормоны, такие как аналоги эстрогена, прогестерона или тестостерона, например тамоксифен; регуляторы рецепторов эстрогена (SERM), такие как ралоксифен; бис-фосфанаты, такие как алендронат; ризендронат и этидронат; статины, такие как церивастатин, ловастатин, симвастатин, правастатин, флувастатин, аторвастатин и 3,5-дигидрокси-7-[3-(4-фторфенил)-1-(метилэтил)-1Н-индол-2-ил]гепт-6-эноат.

Лекарственные средства для включения в гидроксидные оболочки:

Лекарственные средства, включенные в гидроксидный слой, могут быть использованы для местного воздействия, такого как улучшение местной устойчивости против вторгающихся микробов, местная регуляция боли, местное ингибирование синтеза простагландинов; местная регуляция воспаления, местная индукция биоминерализации и местная стимуляция роста ткани. Примеры лекарственных средств, подходящих для включения в слои гидроксида металла, включают антибиотики; ингибиторы циклооксигеназы; гормоны; ингибиторы воспаления; НПВП (NSAID) (нестероидные противовоспалительные агенты); анестезирующие средства; ингибиторы синтеза простагландина; стероиды; тетрациклин (также как биоминерализирующий агент).

Биологически активные ионы для включения в гидроксидные оболочки:

Ионы являются важными во множестве биологических механизмов. При включении биологически активных ионов в слои гидроксидов металлов на имплантатах является возможным местно стимулировать биологические процессы как функционирование ферментов, блокада ферментов, клеточный захват биомолекул, возвращение на место специфических клеток, биоминерализация, апоптоз, клеточная секреция биомолекул, клеточный метаболизм и клеточная защита. Примеры биоактивных ионов для включения в гидроксиды металлов включают кальций; хром; медь; фторид; золото; йодид; железо; калий; магний; марганец; селен; сера; олово; серебро; натрий; цинк; нитрат; нитрит; фосфат; хлорид; сульфат; карбонат; карбоксил; оксид.

Маркерные биомолекулы:

Биологические маркеры представляют собой молекулы, которые производят обнаружимый сигнал, например, путем излучения света, ферментной активности, радиоактивности, специфического окрашивания, магнитных свойств, интенсивности рентгеновского излучения, специфической структуры, антигенности и др., который может быть обнаружен специфическими приборами или исследованиями или путем микроскопии или методом построения изображения, как рентгеновский или ядерный магнитный резонанс. Маркеры используют для мониторинга биологических процессов при исследовании и разработке новых биомедицинских методов лечения. На имплантатах такие маркеры, как правило, используют для мониторинга процессов, таких как биологическая совместимость, формирование ткани, неогенез ткани, биоминерализация, воспаление, инфекция, регенерация, заживление, гомеостаз ткани, разрушение ткани, круговорот ткани, высвобождение биомолекул из поверхности имплантата, биоактивность высвобождаемых биомолекул, поглощение и экспрессия нуклеиновых кислот, высвобождаемых из поверхности имплантата, для обеспечения «контрольной проверки», эффекта, эффективности и безопасности до клинических исследований.

Маркерные биомолекулы, подходящие для включения в гидроксидные оболочки, включают кальцеин; ализаран красный; тетрациклины; флуоресцины; фура; люциферазу; щелочную фосфатазу; меченные радиоактивным изотопом аминокислоты (например, меченые ³²P, ³³P, ³H, ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ⁵¹ Cr, ⁴⁵Ca); меченные радиоактивным изотопом нуклеотиды (например, меченые ³²P, ³³P, ³H, ³⁵ S, ¹⁴C); меченные радиоактивным изотопом пептиды и белки; меченные радиоактивным изотопом ДНК и РНК; иммунозолотые комплексы (частицы золота с прикрепленными антителами); иммуносеребряные комплексы; иммуномагнетиттовые комплексы; зеленый флуоресцентный белок (GFP); красный флуоресцентный белок (Е5); биотинилированные белки и пептиды; биотинилированные нуклеиновые кислоты; биотинилированные антитела; биотинилированные связующие атомы углерода; гены-репортеры (любые гены, которые генерируют сигнал при экспрессии); йодид пропидия; диамидиновый желтый.

Устройство в соответствии с изобретением может применяться в нескольких целях. Примеры таких целей включают применение для индукции формирования местных твердых тканей (например, костной ткани) в месте имплантации; регуляции микробного роста и/или инвазии в месте имплантации или системно; уменьшения воспаления в месте имплантации или системно; стимуляции заживления, регенерации или образования связок; индукции формирования хряща; образования ядра, регуляции и/или формирования шаблона биоминерализации; улучшения связывания имплантата и тканей; улучшения интеграции имплантатов в кость; улучшения прилипания ткани к имплантату; препятствования прилипанию ткани (полупостоянное или временное) к имплантату; улучшения контакта между тканями или тканями и имплантатами, улучшения закрытия тканью (хирургической) раны; индукции апоптоза (клеточной смерти) нежелательных клеток (например, раковых клеток); индуцирования дифференцировки и/или созревания специфических клеток, увеличения прочности тканевого тонуса; улучшения заживления ран; ускорения заживления ран; моделирования образования тканей; направления образования тканей; местной генной терапии; стимуляции роста нервов; улучшения васкуляризации в тканях, смежных с имплантатом; стимуляции местного синтеза внеклеточного матрикса; ингибирования местного распада внеклеточного матрикса; индуцирования местного высвобождения факторов роста; увеличения местного метаболизма тканей; улучшения функции ткани или части тела; уменьшения местной боли и дискомфорта. Цель зависит от типа имплантата, а также природы и/или концентрации любой биомолекулы, присутствующей в гидроксидном слое на имплантате.

Когда металлический материал (А) представляет собой сплав титана, циркония, тантала, гафния или ниобия, это может быть сплав между одним или более этими металлическими элементами; или может быть сплав, включающий один или более других металлов, таких как алюминий, ванадий, хром, кобальт, магний, железо, золото, серебро, медь, ртуть, олово или цинк; или оба.

Является предпочтительным, чтобы металлический материал (А) являлся титаном или его сплавом, например сплавом с цирконием, танталом, гафнием, ниобием, алюминием, ванадием, хромом, кобальтом, магнием, железом, золотом, серебром, медью, ртутью, оловом или цинком. В особенно предпочтительном варианте воплощения изобретения металлическим материалом (А) является титан.

Соответствующим гидроксидным материалом (В) является предпочтительно гидроксид титана.

Как определено выше, протезы, имеющие покрытие из соответствующего гидроксида металла на металлических частях, проявляют полезные структурные свойства и свойства биологической совместимости. Например, похоже, что гидроксидный слой является более реакционноспособным in vivo, чем соответствующий оксид, который, видимо, является более стабильным. Следовательно, без связи с какой-либо особенной теорией, предполагают, что слой гидроксида металла в большей степени, чем слой оксида металла, способствует взаимодействию с эндогенным фосфатом кальция из-за увеличенной in vivo реакционной способности и таким образом улучшает интеграцию в кость по сравнению с имплантатом, покрытым более инертным оксидом.

Предпочтительно, слой гидроксидного материала содержит одно или более биомолекулярное вещество, связанное с ним. Подходящие биомолекулы перечислены выше. В данном контексте необходимо отметить, что гидроксидный слой может быть создан для получения регулируемого высвобождения in vivo биомолекул(ы), связанной с ним.

Биомолекулярное вещество(а) может присутствовать на поверхности гидроксидного материала, присутствовать в качестве соединения включения и/или заключенным в гидроксидный материал.

Предпочтительными биомолекулами для использования в настоящем изобретении являются биомолекулы, среди таковых, перечисленных выше, имеющие ИТ (или изоэлектрическую точку) ниже 7,0 (т.е. имеющие суммарный отрицательный заряд при рН выше 7,0). Специалисту должно быть понятно, что свойство наличия ИТ ниже 7,0 не ограничено какой-либо определенной группой или подгруппой биомолекул среди таковых, которые перечислены выше, а может быть обнаружено у всех типов биомолекул в соответствии с их происхождением, а также их функцией в организме, из которого они происходят.

Кроме того, биомолекулы должны быть предпочтительно стабильны при рН выше 7,0, более предпочтительно выше рН 8,0, в особенности выше рН 9,0. В данном контексте термин «стабильный» предназначен для обозначения того, что рассматриваемая биомолекула не распадается или разлагается (например, РНК распадается при рН выше 9,0) или иным образом функционально необратимо разрушается в указанном диапазоне рН.

Предпочтительными группами биомолекул для использования в настоящем изобретении являются:

- биомолекулы, стимулирующие заживление костей, такие как TGF, BMP, амелогенин и амелобластин;

- биомолекулы, стимулирующие заживление ран, такие как VEGF, PDGF, HGF, KGF и FGF;

- биомолекулы, стимулирующие депонирование минералов, такие как амелобластин, поли-пролины и коллагены;

- биомолекулы, стимулирующие прилипание клеток, такие как внеклеточный матрикс, молекулы CD, интегрины и RGD-пептиды;

- биомолекулы, стимулирующие прилипание кости, такие как внеклеточный матрикс, молекулы CD, интегрины и RGD-пептиды;

- биомолекулы, стимулирующие пролиферацию клеток, такие как факторы роста;

- биомолекулы, стимулирующие пролиферацию остеобластических клеток, такие как BMP, TGF, IL-6, остеокальцин, остеопротегрин, BSP и цитокины;

- биомолекулы, стимулирующие дифференцировку клеток, такие как амелогенин и факторы роста;

- биомолекулы, стимулирующие дифференцировку остеобластических клеток, такие как амелогенин и факторы роста.

Количество биомолекулярного вещества (С), присутствующего на или в гидроксидном слое (В) частей протеза, устройства, покрытого гидроксидом, может варьироваться в широких пределах, например, в зависимости от химических и биологических характеристик рассматриваемого биомолекулярного вещества или веществ. Следовательно, биомолекулярное вещество (С), связанное с гидроксидным материалом (В), может присутствовать в количестве, колеблющемся от такого небольшого, как от 1 пикограмм на 1 мм² до такого высокого, как 1 мг на 1 мм² поверхности имплантата, покрытой гидроксидом. Однако предполагают, что наиболее применимые оболочки с биомолекулами колеблются от 0,1 нанограмм до 100 микрограмм на 1 мм².

Медицинские протезы в соответствии с изобретением как включающие одно или более биомолекулярное(ые) вещество(а) (С), а также без таких биомолекулярных веществ предпочтительно являются стерильными.

Как указано выше, способ по изобретению для получения устройств, покрытых гидроксидной оболочкой, включает в себя подвергание поверхностных частей металлического материала (А) обработке электролизом при рН выше 7,0 для образования гидроксидного слоя (В). Условия электролиза могут варьироваться для получения гидроксидных слоев различной шероховатости, порозности и толщины. При значениях рН ниже 7,0 слой оксида металла образуется вместо слоя гидроксида металла.

Соответственно, может применяться любой уровень рН выше 7,0, такой как в пределах уровня от рН 7,1 до рН 14,0, но предпочтительным уровнем рН для получения гидроксидного слоя, включающего одну или более биомолекул, является таковой в пределах от рН 7,1 до 12,0, в частности в диапазоне рН от 7,1 до 11,0, такого как рН от 7,1 до 10,0, например рН от 7,1 до 9,0.

Очень высокий уровень рН (обычно выше рН 12,0), как правило, способствует получению шероховатой (разъеденной) подлежащей металлической поверхности, тогда как условия низкого уровня рН (как правило, рН 7,1-10,0) сохраняют естественную конфигурацию поверхности, т.е. например, гладкую подлежащую металлическую поверхность.

Используемый в данном описании термин «гидроксидный слой» обозначает слой, включающий преимущественно гидроксид по сравнению с соответствующим оксидом.

Условия высокого напряжения (как правило, между 10 В и 150 В) способствуют образованию более пористого гидроксидного слоя, чем условия низкого напряжения (как правило, ниже 10 В).

Временной аспект является наиболее важным для толщины гидроксидного слоя; чем больше время электролиза, тем толще становится слой. Однако напряжение, температура и рН также влияют на толщину гидроксидного слоя. Гидроксидный слой становится толще, если применяется более высокое напряжение. Более высокая температура и/или более высокий уровень рН также увеличивают толщину гидроксидного слоя.

Толщина гидроксидного слоя может находиться в пределах от 1 нм до 50 нм, предпочтительно равная или более 0,5 мкм, более предпочтительно равная или более 1 мкм, такая как в диапазоне от 1 до 20 мкм, в частности в диапазоне от 4 до 15 мкм.

Как, кроме того, указано выше, способ по изобретению для получения устройств, покрытых гидроксидной оболочкой, имеющей одно или более биомолекулярное вещество (С), связанное с гидроксидным слоем, включает в себя подвергание поверхностных частей металлического материала (А) обработке электролизом для образования гидроксидного слоя (В), указанную обработку проводят в присутствии одного или более биомолекулярных веществ (С), как обсуждалось выше. Было обнаружено, что важно, чтобы условия в электролите (рН, ионная сила и др.) были такими, чтобы биомолекула имела отрицательный суммарный заряд. Таким образом, является полезным, чтобы биомолекулы были амфолитами, т.е. они являлись слабыми кислотами или основаниями, которые меняют свой суммарный заряд в соответствии с ионной силой и рН раствора, в котором они растворены. Следовательно, главной задачей для включения их в гидроксидный слой является стабильность при условиях, необходимых для получения биогидроксида, т.е. окружающая среда, которая поставляет достаточно ионов ОН^- для получения гидроксида и в то же время поддерживает суммарный заряд рассматриваемой биомолекулы отрицательным. Это главным образом обозначает, что электролит должен иметь низкую концентрацию соли и, следовательно, ионную силу; сравнительно низкую температуру, хотя бы предпочтительно ниже любой температуры денатурации биомолекулярной субстанции; и рН выше 7,0.

Следовательно, электролитом может быть раствор любой соли, предпочтительно водный, например раствор хлорида натрия, сульфата натрия, фосфата кальция, хлорида кальция, фосфатный буферный раствор (PBS), физиологический раствор, раствор соли, имитирующий физиологические условия, бикарбонаты, карбонаты и др., в котором растворена желаемая биомолекула. Ионная сила соли, как правило, составляет 1 М, но концентрации могут быть установлены до таких низких как 0,01 М и до таких высоких как 10 М в соответствии с химическими свойствами и концентрацией биомолекул(ы).

Температура электролита, содержащего биомолекулу, может варьироваться от замораживания (0°С) до такой высокой, как температура кипения электролита, как правило, около 100°С. Однако, при получении устройства по изобретению, включающего в себя биомолекулярное вещество(а) (С) в гидроксидном слое, применение температур в верхней части такого диапазона четко зависит от способности биомолекулярных веществ(а) (С) присутствовать, выдерживая такие температуры без повреждения. Если биомолекула может ее выдерживать, оптимальная температура для образования гидроксида составляет от около окружающей (20°С) до 80°С. Однако, если рассматриваемая биомолекула является нестабильной при высоких температурах, электролит может быть охлажден до температуры, такой как 0°С, если рН и концентрация соли устанавливается соответственно и время реакции увеличивается.

рН электролита, как правило, устанавливают до желаемого уровня рН посредством сильного основания, например NaOH, KOH, и др., хотя должно быть принято во внимание, что рН выше 12 способствует образованию неровной, протравленной поверхности имплантата титана, тогда как рН ниже 10 преимущественно сохраняет исходный рельеф поверхности. Если получают устройство, включающее биомолекулярное вещество(а), рН устанавливают в соответствии с желаемым соотношением гидроксид/биомолекула. Высокий уровень рН способствует образованию поверхности имплантата с высоким соотношением гидроксид/биомолекула (= больше гидроксида металла), тогда как уровень рН ближе к нейтральному, но не ниже ИТ рассматриваемой биомолекулы, способствует образованию поверхности с низким соотношением гидроксид/биомолекула (= относительно больше биомолекул). Соответственно, любой уровень рН выше 7, такой как в рамках диапазона от рН 7,1 до рН 14,0, может быть использован, но предпочтительный уровень рН находится в диапазоне от рН 7,1 до 12,0, в частности в рамках диапазона рН от 7,1 до 11,0, таком как рН от 7,1 до 10,0, например рН от 7,1 до 9,0 в зависимости от химических характеристик и концентрации биомолекул(ы), используемого электролита и предпочтительного соотношения гидроксид/биомолекула. Для более высоких соотношений гидроксид/биомолекула(ы) (= больше гидроксида) уровень рН должен быть установлен более основным, и для более низких соотношений гидроксид/биомолекула(ы) (= более биомолекул) уровень рН должен быть установлен ближе, но выше, чем ИТ биомолекулы. Единственным требованием является то, чтобы ионы гидроксида (ОН^-) и отрицательно заряженные биомолекулы (биомолекула^- отрицательный заряд) присутствовали в электролите.

Концентрация биомолекул(ы) (одной или любой комбинации двух или более) в электролите может варьироваться в широком диапазоне, в зависимости от типа биологической активности, типа молекулы, химических и биологических характеристик, токсичности, эффективности, типа действия, высвобождается ли она или нет из гидроксидного слоя, стабильности in vivo, стабильности в электролите, доступности, оптимального уровня рН и др. Следовательно, концентрация биомолекул(ы) в электролите может находиться в диапазоне от 1 пг до 50 мг на миллилитр. Предпочтительный диапазон составляет от 10 пг до 1 мг на миллилитр, но оптимальная концентрация биомолекулы всегда должна быть окончательно определена в предварительных экспериментах с каждой биомолекулой или смесью биомолекул. Также промежуток времени, в течение которого проводят электролиз, может варьироваться, но главным образом влияет на толщину гидроксидного слоя и, следовательно, концентрацию биомолекул в гидроксидном слое.

Электролизная ячейка для применения в способах по изобретению может иметь любой обычный дизайн, но, как правило, является двухкамерной ячейкой без какого-либо электропроводного соединения между камерами, кроме такового для электролита. Чтобы сделать металлический имплантат модифицированным гидроксидом, его помещают в анодную (т.е. положительно заряженный электрод) камеру, тогда как катод (отрицательно заряженный электрод), как правило, сделанный из платины, помещают в отдельную камеру. Электролиты в каждой камере соединены посредством пористого стекла или фарфорового фильтра, позволяющего току проходить беспрепятственно, но без какого-либо обмена электролитами между двумя камерами. Это важно при получении устройств, включающих биомолекулярные вещества(о), так как продукты катодной реакции потенциально могут создавать помехи образованию биомолекулярно-гидроксидного слоя или разрушать или модифицировать биомолекулу в анодном электролите. Разделение двух камер также позволяет использовать меньший объем анодного электролита и таким образом более эффективно использовать биомолекулы, а также возможность использовать двухэлектролитную систему, которая позволяет оптимизировать электролитический процесс, например один электролит, оптимальный для биомолекул на анодной стороне и электролит на катодной стороне, который оптимизирован для эффективности электролиза как такового (электропроводность, избежание токсических продуктов или даже получение полезных побочных продуктов/оболочек).

Как указано выше, температура в анодной ячейке (Т _ан) должна быть настолько высокой, насколько возможно с оптимумом для получения гидроксида при 80°С.

Электролитический процесс сам по себе также продуцирует тепло, которое может ставить две проблемы; компоненты электролита испаряются, так что объем уменьшается, и ионная сила и концентрация биомолекул повышаются выше предпочтительного диапазона, и увеличение температуры может вызывать осаждение, коагуляцию, денатурацию, деградацию или деструкцию присутствующих биомолекул(ы). Следовательно, анодный отдел электролитической ячейки является предпочтительно снабженным охлаждающей крышкой для конденсации испаренного электролита и кожухом радиатора для регуляции температуры для стабилизации температур и объемов во время электролиза.

Путем установления тока, заряда и композиции электролита также может быть возможным обеспечить подходящее окружение для отрицательного заряда большинства биомолекул. Если нет, установка электролиза импульсного поля, когда полярность электродов меняется в регулируемых циклах во время получения биогидроксидного слоя, может являться одним путем для исключения проблемы положительного суммарного заряда.

Источником энергии, как правило, является так называемый электрический насос, т.е. устройство, поставляющее постоянный ток, даже если сопротивление в цепи меняется. Хотя могут использоваться напряжения от 0,1 до 1000 В, напряжение, как правило, составляет ниже 10 В. Плотность тока в течение электролиза, как правило, находится в диапазоне от 0,1 мА до 1 А на квадратный сантиметр (см² ) образца имплантата. Предпочтительная плотность тока составляет 1 мА/см², хотя настройки в электролите, рН и температуре для увеличения совместимости биомолекулы могут диктовать большие или меньшие отклонения от этого значения.

Продолжительность процесса зависит от нескольких параметров, таких как желаемая толщина биогидроксидного слоя, композиция и характеристики электролита, характеристики биомолекулы, температура и рН, желаемое соотношение гидроксида/биомолекулы, размер образца имплантата, объем анодного электролита, концентрация биомолекулы и др. Следовательно, продолжительность процесса может составлять от 0,5 часов до нескольких дней. Однако оптимальный временной промежуток обычно составляет от 8 до 24 часов.

Для мониторинга биогидроксидного процесса, как правило, каломельный эталонный электрод может быть помещен в анодную камеру. Когда процесс образования гидроксидного слоя на аноде является оптимальным, наблюдают разницу около 1 В между каломельным электродом и титановым анодом. Если ток сильно отличается от этого значения, процесс может быть запущен в субоптимальных условиях, должны быть рассмотрены изменения в установках. Более того, датчик температуры и датчик рН, как правило, могут быть помещены в анодную камеру для мониторинга, что процесс проходит в рамках желаемых пределов рН и температуры. Перемешивающее устройство, такое как магнитная мешалка, также может применяться в анодной ячейке для непрерывного перемешивания электролита и поддержания однородной температуры и во избежание различий в локальной ионной силе, рН и концентрациях биомолекул.

После стадии электролиза металлический имплантат, теперь покрытый оболочкой биомолекулы/гидроксида, немедленно удаляют из электролита и обрабатывают в соответствии с требованиями рассматриваемых биомолекул(ы). Как правило, стерильному образцу имплантата позволяют высохнуть на воздухе и затем упаковывают в стерильный, герметичный пластиковый пакет, в котором он хранится для использования при имплантации. Однако некоторые биомолекулы могут быть чувствительными к высушиванию и, следовательно, может быть желательным система влажного хранения, например, подобная консервации или хранению в жидкости, как физиологический раствор или просто электролит из способа производства. Хотя электролиз может проходить в асептических или даже стерильных условиях, при необходимости этого можно избежать путем включения стадии стерилизации перед использованием, с применением обычных методов, таких как ионизирующее излучение, нагревание, автоклавирование или газ этиленоксида и др. Выбор способа зависит от специфических характеристик и свойств биомолекул(ы), присутствующей в слое гидроксида металла.

Обычно стерилизацию медицинских устройств проводят путем автоклавирования, обычно при 120°С. Автоклавирование медицинского протеза по изобретению не влияет на композицию или структуру гидроксидного слоя.

Перед обработкой электролизом имплантат должен быть тщательно очищен. Это может, как правило, заключаться в предварительной механической обработке имплантата электрополировкой или пескоструйной очисткой для модифицирования структуры поверхности при необходимости и последующем тщательном очищении с использованием горячей каустической соды с последующей обезжиривающей стадией, например, в концентрированном трихлорэтилене, этаноле или метаноле, перед обработкой в травильном растворе, например фтористоводородной кислоте, для удаления оксидов и загрязнений на поверхности. После травления образец имплантата тщательно промывают в горячей, дважды дистиллированной, ион-обменной воде.

Для получения стерильных устройств, включающих одно или более биомолекулярное вещество(а) (С), а также без таких субстанций, способ получения устройств может проводиться в стерильных условиях, или модифицированный имплантат может в качестве альтернативы быть стерилизован после завершения способа. Последующая обработка после стерилизации может проводиться посредством любого из методов, хорошо известных для целей стерилизации в области медицинских устройств и имплантатов. Такие методы, как правило, включают в себя автоклавирование, нагревание, воздействие УФ или ионизирующего излучения или химическую стерилизацию этиленоксидом или подобными химическими препаратами. Предпочтительный способ зависит, помимо прочего, от присутствия типа и количества биомолекулярного вещества, а также нормативных правил для медицинских устройств. При работе в частности с устройствами или имплантатами, включающими в себя одно или более биомолекулярное вещество(а) (С), является предпочтительным проводить их получение в стерильных условиях для как можно меньшего повреждения биомолекулярных веществ.

В специальном варианте воплощения изобретения получают металлическое устройство или имплантат с двухслойной или двухзонной оболочкой, в котором устройство или имплантат сначала подвергают первой обработке электролизом, как описано выше для образования первого гидроксидного слоя или зоны без какого-либо биомолекулярного вещества (С), с последующей вторичной обработкой электролизом в присутствии одного или более биомолекулярного веществ(а) (С), как описано выше для отложения второго гидроксидного слоя или зоны на поверхности первого слоя, причем указанный второй слой имеет биомолекулярное вещество(а) (С), связанное с ним.

Другой вариант воплощения изобретения относится к медицинскому протезу, такому как внутричелюстной зубной имплантат, содержащему первую гидроксидную зону, предназначенную для приведения в контакт с мягкой тканью, и вторую гидроксидную зону, предназначенную для приведения в контакт с твердой тканью, в котором указанная первая зона содержит одну или более биомолекул, влияющих на мягкую ткань, а указанная вторая доза содержит одну или более биомолекул, влияющих на твердую ткань.

Например, первая зона может содержать биомолекулы, стимулирующие заживление ран, такие как VEGF, PDGF, HGF, KGF и FGF, и вторая зона может содержать биомолекулы, стимулирующие отложение минералов, такие как амелобластин, полипролины и коллагены или биомолекулы, стимулирующие скрепление кости, такие как внеклеточный матрикс, молекулы CD, интегрины и RGD-пептиды. Однако другие комбинации биомолекул также могут быть использованы.

Необходимо отметить, что могут использоваться более чем две зоны, а именно три или четыре зоны.

Следующий вариант воплощения изобретения относится к медицинскому протезу, такому как внутричелюстной зубной имплантат, содержащему первый гидроксидный слой, имеющий одну или более биомолекул, связанные с ним, и второй гидроксидный слой на поверхности первого слоя, указанный второй слой имеет одну или более биомолекул, связанных с ним, отличающихся от биомолекул(ы), связанных с первым слоем. Биомолекула(ы), связанная со вторым слоем in vivo, высвобождается до биомолекул(ы), связанной с первым слоем. Биомолекула(ы) первого и второго слоев соответственно может быть выбрана таким образом, чтобы высвобождение было оптимизированным в отношении биологических процессов после имплантации. Необходимо отметить, что могут применяться более чем два слоя, а именно три или четыре слоя.

Далее изобретение проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами, среди которых примеры 1, 2, 3, 5, 7 и 10 описывают проведенные эксперименты, а примеры 4, 6, 8, 9 и 11 иллюстрируют рассматриваемые рабочие примеры.

Пример 1: Получение и характеристики слоя гидроксида титана.

После тщательного очищения образцы титана класса 2 электрополированные монетообразные титановые имплантаты с площадью поверхности 0,35 см², анодно поляризованные в растворе, состоящем из 0,5 М NaCl и 1 М NaOH. Это было сделано при повышенной температуре для получения подходящей скорости реакции между титаном и гидроксидом с образованием гидроксида титана.

Температуру 80°С выбирали в качестве температуры реакции.

Пример 2: Тестирование титановых имплантатов, имеющих биологическую совместимость, улучшенную электролитическим включением гидроксида в поверхность.

Восемь монетообразных имплантатов с диаметром 6,25 мм присоединяли к титановому электроду и погружали в стерильный электролит, включающий 0,5 М NaCl, доведенный до рН 8,0 с использованием 1,0 М NaOH. Электрод присоединяли к положительному выходу источника питания и применяли электрический ток 10 В при 100 мА в соответствии с настройкой в примере 1. Электролитическому процессу, способствующему образованию тонкого слоя гидроксида титана на поверхности имплантата, позволяли продолжаться в течение восьми часов при 70°С. Восемь дополнительных имплантатов, которые сопутствующе присутствовали в электролите, но не были прикреплены к электроду, также были включены в качестве контроля.

После электролиза имплантаты очищали в стерильной воде и впоследствии помещали в стерильные стеклянные контейнеры, где им позволяли высохнуть на воздухе.

Имплантаты с поверхностями из гидроксида титана (n=8) и контрольные (n=8) помещали в калиброванные кортикальные костные дефекты в большеберцовой кости кроликов (Новозеландские белые). Небольшие центральные фенестрации в костный мозг под каждым имплантатом делали для предоставления возможности миграции остеогенных клеток на поверхности имплантатов. Все используемые способы соответствовали стандартизованной и утвержденной модели, установленной для исследования прикрепления кости к поверхностям титанового имплантата (Ronold, H.J. and Ellingsen, J.E.: The use of a coin shaped implant for direct in situ measurement of attachment strength for osseointegrating biomaterial surfaces, Biomaterials 23, 2201-2209 (2002)). Каждый кролик получил четыре имплантата, по два в каждую большеберцовую кость. Расположения тестируемых и контрольных имплантатов рандомизировали, и хирург не был посвящен.

Через шесть недель после имплантации кроликов умерщвляли и удаляли большеберцовые кости с прикрепленными имплантатами.

Непосредственно после удаления большеберцовую кость фиксировали в специально созданном зажимном приспособлении, и имплантаты отделяли с использованием откалиброванной методики выделения с измерением силы связывания между имплантатом и костью. Силу, необходимую для отделения имплантатов, записывали в Ньютонах (Н).

Результаты (таблица I) демонстрируют, что титановые имплантаты, которые имеют поверхность, модифицированную электролитическим включением ионов гидроксида, были достоверно (р<0,01) более сильно прикреплены к кортикальному слою кости, чем контрольные имплантаты через шесть недель заживления. Данный результат является клинически важным, так как раннее прикрепление кости является знаком сниженного времени заживления кости. Это важно для успешного клинического исхода методики «ранней нагрузки» в лечении ортопедическими и внутричелюстными зубными имплантатами.

Таблица I Прикрепление имплантата, оцененное по силе удаления, необходимой для отделения имплантатов от кости, измеряемой в Ньютонах (Н)
Имплантаты	Контроль (n=8) [Н]	Гидроксидированные (n=8) [Н]
1	9,9	39,6
2	11,6	29,0
3	7,3	44,8
4	15,1	11,6
5	13,6	26,4
6	11,2	6,2
7	1,7	6,9
8	2,4	17,7
Средние значения	9,1	22,8

Пример 3: Получение поверхностного слоя имплантата из гидроксида титана, включающего в себя белок внеклеточного матрикса.

Использовали технологию из примера 1 для получения слоя гидроксида титана, включающего молекулу внеклеточного матрикса амелогенин на электрополированных титановых имплантатах с площадью поверхности 0,35 см ², подвергаемой воздействию электролита. Электролитом в обеих камерах был 1 М NaCl в стерильной воде, рН доводили до рН 8,5 с использованием NaOH, и исходная концентрация амелогенина составила 0,1 мг/мл. Для электролиза использовали напряжение 10 В при плотности заряда 1 мА/см². Т _ан была установлена на 70°С. Электролизу позволяли проходить в течение 18 часов, после чего титановые имплантаты удаляли из электролизной ячейки, промывали в стерильной воде и позволяли высохнуть на воздухе в сушильной печи.

После высушивания титановые образцы промывали три раза в 1 мл физиологического раствора при рН 6,5. После промывания белки, оставшиеся на титановых поверхностях, растворяли путем кипячения титанового образца в 0,1 мл 2×ДСН буфера для образца (0,4 г ДСН, 1,0 г 2-меркаптоэтанола в 10 мл 0,125 М Tris/HCl, рН 6,8) в течение 5 минут. Количество амелогенина, растворенного в растворе ДСН из промываемых титановых поверхностей, затем анализировали стандартной фотометрией, измеряя поглощение света при 280 и 310 нм против чистого 2×ДСН буфера для образца, и сравнивали результаты со стандартным рядом разведений амелогенина в 2×ДСН буфера для образцов. Эксперимент повторяли дважды в группе из 16 имплантатов, оба раза с 5 отрицательными внутренними контролями в форме таких же титановых имплантатов, которые присутствовали в реакционной камере в течение всего процесса, но не прикреплялись к аноду.

Такой эксперимент ясно демонстрирует, что достаточное количество амелогенина было включено в гидроксидный слой в течение электролитического процесса. Белки амелогенина не только присутствовали в виде простой оболочки, так как не было признаков белков в промывающих растворах. Только с комбинацией сильного детергента (ДСН), восстановителя (меркаптоэтанол) и высокой температуры (100°С) стало возможным экстрагировать амелогенины из поверхностного слоя гидроксида титана. Количество экстрагированного белка было рассчитано в диапазоне от 32 до 94 мкг/см² со средним значением 67 мкг амелогенина на 1 см² при сравнении со стандартом амелогенина. Одинаковые контрольные имплантаты, которые присутствовали в той же самой электролитической ячейке, что и экспериментальные имплантаты, но которые не были соединены с анодом, не показали белков амелогенина, прикрепленных к титановой поверхности.

Пример 4: Получение поверхностного слоя имплантата из гидроксида титана, включающего в себя синтетический пептид на основе фактора роста.

Технология из примера 3 может быть использована для получения слоя гидроксида титана, содержащего синтетический пептид фактора роста фибробластов 4 во всю длину (37 аминокислот) (FGF-4) на монетообразных электрополированных титановых имплантатах с общей площадью поверхности 0,6 см², подвергаемой воздействию электролита. Электролиты, рН, напряжение, плотность тока и время электролиза соответственно могут быть как в примере 3. Исходная концентрация FGF-4 может соответственно быть 0,1 мг/мл, и температура анодной камеры может соответственно быть 50°С.

После промывания в физиологическом растворе и буфере 2×ДСН-РАСЕ, осаждения, центрифугирования, ре-разведения в ДСН-PAGE, кипячения и электрофореза белок в геле может быть перенесен в серебряный окрашивающий раствор, и присутствующие синтетические пептиды FGF-4 в полную длину визуализируются как отдельная полоса в геле. Одинаковые контрольные имплантаты присутствовали в той же самой электролитической ячейке, что и экспериментальные имплантаты, но не были соединены с анодом, могли быть использованы в качестве контроля.

Пример 5: Получение поверхностного слоя имплантата из гидроксида титана, включающего нуклеиновую кислоту.

Технологию из примера 3 использовали для получения слоя гидроксида титана, включающего нуклеиновые кислоты в форме меченной радиоактивной меткой общей человеческой плацентарной ДНК на электрополированных титановых имплантатах с общей площадью поверхности 0,35 см², подвергаемой воздействию электролита. Электролитом в обеих камерах был 1М NaCl в стерильной воде. рН доводили до рН 8 с использованием NaOH. Исходная концентрация ДНК в электролите составила 10 мкг/мл. Для электролиза использовали напряжение 10 В при плотности тока 1 мА/см² и Т_ан 65°С. Электролизу позволяли протекать в течение 16 или 24 часов, после чего титановые образцы удаляли из электролизной ячейки, промывали три раза в обильном количестве буфера Трис-ЭДТА (ТЭ-буфер; 10 мМ Трис-Cl и 1 мМ ЭДТА в стерильной воде, рН 7,6) и затем позволяли высохнуть на воздухе в течение ночи в сушильной печи.

ДНК метили радиоактивной меткой с использованием набора Stratagene Prime-It ^® II Random Primer Labelling kit для получения образцов с высоко специфичной активностью и [ -³²P]dATP (Amersham). После метки ДНК измеряли специфическую радиоактивность образца ДНК в сцинтиляционном счетчике Packard Tricarb^®, которая составила 3,0×10⁸ распадов в минуту на микрограмм меченой ДНК (р/мин/мкг).

После высушивания титановые образцы с прикрепленными экспериментальными нуклеиновыми кислотами помещали на фосфорный экран (Fujii^® ) на 15 минут. Затем образцы удаляли, и фосфорный экран сканировали в машине для получения фосфорных изображений BioRad ^®, измеряя количество распадов, появляющихся на поверхности каждого имплантата с использованием 100 мкм решетки (12265 точек на имплантат). Эксперимент повторяли дважды в группе из 16 имплантатов, оба раза с 5 отрицательными внутренними контролями в форме таких же титановых имплантатов, которые присутствовали в реакционной камере в течение всего процесса, но не были прикреплены к аноду. Для первой группы время реакции составило 24 часа, для второй оно составило 16 часов. Общее количество р/мин на имплантат было рассчитано и преобразовано в мкг ДНК на квадратный сантиметр (мкг ДНК/см²).

Данный эксперимент ясно демонстрирует, что значительное количество ДНК было включено в гидроксидный слой в течение электролитического процесса. ДНК присутствовала не только как простая оболочка, так как ДНК не растворялась и не вымывалась из тестируемых имплантатов при промывке ТЭ. Количество ДНК, присутствующей на имплантатах, колебалось от 0,15 до 0,55 мкг/см² со средним значением 0,38 мкг ДНК на см², когда время реакции составляло 24 часа. Когда время реакции уменьшали до 16 часов, соответствующие значения варьировались от 0,10 до 0,32 мкг/см ² со средним 0,28 мкг ДНК на см². Такие цифры расположены в применимом диапазоне для генной терапии и вакцин ДНК и других применений молекулярных лекарственных средств. Такие же контрольные имплантаты, которые присутствовали в той же электролитической ячейке, что и экспериментальные имплантаты, но не были соединены с анодом, показали только очень небольшие количества (пикограммы) ДНК, прикрепленной к поверхности.

Пример 6: Получение биоминералиндуцирующего поверхностного слоя имплантата из гидроксида титана.

Может быть использована технология из примера 3 для получения слоя гидроксида титана, включающего в себя синтетический полипролиновый пептид, который обладает способностью действовать как биологический инициатор минералообразования в насыщенных растворах фосфата кальция. Биомолекула может быть включена в гидроксидный слой поверхностей электрополированных монетообразных титановых имплантатов с общей площадью, подвергаемой воздействию электролита 0,35 см². Электролитом в обеих камерах может соответственно быть 1 М NaCl в стерильной воде с рН, доведенным до рН 10 посредством NaOH, и исходная концентрация синтетического полипролина может соответственно быть 0,1 мг/мл. Для электролиза могут быть использованы напряжение 10 В при плотности тока 1 мА/см² и температура анодной камеры 40°С. Электролизу, соответственно, может быть позволено протекать в течение 18 часов, после чего титановые имплантаты удаляют из электролитической ячейки, промывают в стерильной воде и позволяют высохнуть на воздухе в сушильной печи.

После высушивания титановые имплантаты и контроль с прикрепленным экспериментальным инициатором минералообразования помещают в 5 мл насыщенного раствора фосфата кальция. После инкубации в течение 4 часов при комнатной температуре имплантаты удаляют из минерального раствора, промывают в стерильной воде и высушивают воздухом в сушильной печи. После высыхания имплантаты могут быть непосредственно подвергнуты исследованию электронной микроскопией для оценки количества минеральных фокусов, присутствующих на модифицированных поверхностях. Такие же контрольные имплантаты, присутствующие в той же самой электролитической ячейке, что и экспериментальные имплантаты, но не присоединенные к аноду, могут быть использованы в качестве контрольных.

Пример 7; Получение поверхностного титанового биогидроксидного слоя имплантатов, индуцирующего минералообразование.

Восемь монетообразных имплантатов с диаметром 6,25 мм прикрепляли к титановому электроду и погружали в стерильный электролит, содержащий 0,5 М NaCl, доведенный до рН 8,0 с использованием 1,0 М NaOH, и синтетический полипролиновый пептид (ИТ=5,85), о котором считают, что он стимулирует ядрообразование минеральных кристаллов, в окончательной концентрации 0,01 мг/мл. Электрод прикрепляли к положительному выходу источника питания, и применяли электрический ток 10 В при 100 мА при температуре ячейки 40°С в течение восьми часов в соответствии с настройкой в примере 1. Электролитический процесс способствовал образованию тонкого слоя гидроксида титана с синтетическим пептидом, включенным в поверхности имплантата. Восемь других имплантатов, которые сопутствующе присутствовали в электролите, но не были прикреплены к электроду, также были включены в качестве контрольных.

После электролиза имплантаты промывали в стерильной воде и затем помещали в стерильные стеклянные контейнеры, где им позволяли высохнуть на воздухе.

После высушивания стерильные титановые имплантаты, модифицированные пептидом/гидроксидом, и контрольные погружали в 50 мл насыщенного раствора фосфата кальция при 50°С. Затем раствору позволяли остыть до комнатной температуры в течение 48 часов. Имплантаты удаляли из минерального раствора, быстро промывали в стерильной воде и высушивали воздухом в сушильной печи. При высыхании имплантаты анализировали непосредственно сканирующей электронной микроскопией (СЭМ) для качественной и количественной оценки количества и природы фокусов минерального отложения, присутствующих на их поверхностях. Число образующихся минеральных единиц (оме (mfu)) на поверхности непосредственно соответствовало числу участков образования минеральных ядер, присутствующих на поверхности в течение экспериментов.

Результаты (таблица II) демонстрируют, что титановые имплантаты, которые имели поверхности, модифицированные электролитическим включением молекул синтетических полипролиновых пептидов и ионов гидроксида, имели достоверно (р<0,01) увеличенное количество фокусов минерального отложения. Депонированные минеральные вещества имели высокое содержание кальция и фосфора, показывающее, что все отложения являлись фосфатом кальция. Существует сильное указание на то, что электролитическое включение ионов гидроксида, комбинированных с биомолекулами, может выражено влиять на отложение костных минеральных веществ на имплантированных титановых поверхностях in vivo. Поверхности металлических имплантатов, которые имеют способность индуцировать и способствовать образованию ядер и отложению костных минеральных веществ (фосфат кальция) на их поверхностях, видимо, клинически действуют лучше, чем другие имплантаты. Считают, что повышенная скорость отложения костных минеральных веществ на поверхности имплантата ускоряет интеграцию в кость имплантата и стимулирует заживление окружающей костной ткани. Правильную интеграцию в кость рассматривают как признак успешных клинических исходов ортопедического лечения и лечения внутричелюстными зубными имплантатами.

Таблица II Количество образующихся минеральных единиц (оме) на квадратный мм поверхности имплантата, оцененное СЭМ. Значения выше 10000 записаны как «вырожденные»
Имплантаты	Контроль (n=8) [оме]	Биогидроксидированные (n=8) [оме]
1	1225	8100
2	1936	Вырожденное
3	2704	Вырожденное
4	1369	5625
5	3844	Вырожденное
6	5184	7744
7	1444	Вырожденное
8	3249	9025
Средние значения	2619	>8812

Пример 8: Получение двойного слоя биомолекула-гидроксид титана на поверхности имплантата.

Технология из примера 3 может быть использована для получения двойного слоя гидроксида титана, содержащего биомолекулу на поверхности электрополированных, монетообразных титановых имплантатов с общей поверхностью, подвергаемой воздействию электролита 0,35 см ². Внутренний слой может быть получен с использованием амелогенина в качестве биомолекулы в соответствии со способом в примере 3. Сразу после этой процедуры и без просушки воздухом между, электролит и условия могут быть изменены на таковые примера 5 с использованием геномной человеческой ДНК в качестве биомолекулы. Таким образом, титановые имплантаты могут быть получены с наружным слоем гидроксида титана-ДНК, покрывающим внутренний слой гидроксида титана-амелогенина. После электролиза имплантаты удаляют из электролитической ячейки, промывают в стерильной воде и высушивают воздухом в сушильной печи.

После высушивания титановых образцов с прикрепленными экспериментальными нуклеиновыми кислотами и белками, соответственно промывают три раза в буфере Трис-ЭДТА (ТЭ-буфер; 10 мМ ТрисCl и 1 мМ ЭДТА в стерильной воде). При каждом промывании рН повышается, начиная с рН 7,4, затем промывают при рН 7,6 и окончательно при рН 8,0. После промывания в ТЭ оставшиеся ДНК и белок на титановых имплантатах окончательно удаляют с использованием 0,1 Н NaOH. Промывочные фракции затем разделяют на две; одна часть для исследования нуклеиновой кислоты и одна для исследования белка. Фракции ДНК соответственно осаждают равным объемом абсолютного спирта при -20°С в течение 1 часа и затем очищают от надосадочной жидкости путем центрифугирования при 13000 д при 4°С. Затем осадок в пробирке растворяют в 50 мкл ТЭ буфера рН 7,4 и оценивают количество ДНК из всех четырех промывающих растворов флуориметрическим анализом с использованием красителя Хехст (Boehringer Mannheim).

Фракции для анализа белка соответственно осаждают равным объемом 0,6 Н перхлорной кислоты и надосадочные жидкости очищают центрифугированием. Осажденные осадки, включающие соль и белки, затем растворяют в 50 мкл 2×ДСН-РАСЕ буфера для образцов (0,4 г ДСН, 1,0 г 2 меркаптоэтанола, 0,02 г бромфенолового синего и 4,4 г глицерина в 10 мл 0,125 М Tris/HCl, рН 6,8) и кипятят в течение пяти минут. Затем все образцы подвергают электрофорезу в 10% ДСН-полиакриламидном геле при 80 мА в течение 4 часов. После электрофореза белки в геле переносят в серебряный окрашивающий раствор, и амелогенин, присутствующий во фракциях, визуализируют как отдельные полосы в геле.

Одинаковые контрольные имплантаты, присутствующие в той же самой электролитической ячейке, что и экспериментальные имплантаты, но не присоединенные к аноду, могут быть использованы в качестве контрольных.

Пример 9: Получение поверхностей имплантатов, покрытых двухзонным слоем биомолекула-гидроксид титана.

Технология из примера 3 может быть использована для получения двух отдельных зон слоев титанового гидроксида. Электрополированные, палочкообразные титановые имплантаты с общей площадью поверхности 2 см² обрабатывали в соответствии с примерами 3 и 4. Сначала имплантаты помещают в электролит из примера 3 так, что только половина каждого имплантата погружена в электролит. После завершения процедуры примера 1 имплантаты поворачивают верхней стороной вниз и помещают в новый электролит, сходный с таковым, используемым в примере 4, так, что необработанная половина каждого имплантата погружается в электролит. Затем применяют технологию и условия реакции из примера 4, после чего титановый образец удаляют из электролитической ячейки, промывают в стерильной воде и позволяют высохнуть в сушильной печи.

После электролиза имплантаты с двойной зоной разрезали на два в центре. Половины, покрытые гидроксидом титана - синтетическим пептидом FGF-4, могут быть подвергнуты анализу в соответствии с примером 4. Другие половины имплантатов, покрытые гидроксидом титана - амелогенином, могут быть проанализированы в соответствии с примером 3. Одинаковые контрольные имплантаты, присутствующие в той же самой электролитической ячейке, что и экспериментальные имплантаты, но не присоединенные к аноду, могут быть использованы в качестве контрольных.

Пример 10: Получение остеоиндуктивных поверхностных слоев имплантатов из гидроксида титана, включающих биомолекулы.

Восемь монетообразных имплантатов с диаметром 6,25 мм прикрепляли к титановому электроду и погружали в стерильный электролит, содержащий 0,5 М NaCl, доведенный до рН 8,0 с использованием 1,0 М NaOH, и амелогенин (протеин, считают, что он стимулирует заживление ран и образование кости) в окончательной концентрации 1 мг/мл. Электрод прикрепляли к положительному выходу источника энергии и применяли электрический ток 10 В при 100 мА в течение 16 часов при 60°С в соответствии с настройками в примере 1. Электролитический процесс способствовал образованию тонкого слоя гидроксида титана с включенным амелогенином на поверхности имплантатов. После электролиза имплантаты промывали в стерильной воде и затем помещали в стерильные стеклянные контейнеры, где им позволяли высохнуть на воздухе.

Восемь гидроксидизированных имплантатов из примера 2 включали как контрольную группу.

Титановые имплантаты с поверхностями, модифицированными амелогенином/гидроксидом (n=8) и контрольные (n=8) помещали в калиброванные дефекты кортикального слоя кости в большеберцовой кости кроликов (Новозеландские белые). Небольшую центральную фенестрацию в костный мозг под каждым имплантатом делали для того, чтобы позволить мигрировать остеогенным клеткам на поверхности имплантатов. Все используемые методы соответствовали стандартизированной и подтвержденной модели, установленной для изучения прикрепления кости к поверхности титановых имплантатов (Ronold, H.J. and Ellingsen, J.E.: The use of a coin shaped implant for direct in situ measurement of attachment strength for osseointegrating biomaterial surfaces, Biomaterials 23, 2201-2209 (2002)). Каждый кролик получил четыре имплантата, по два в каждую большеберцовую кость. Расположение тестируемых и контрольных имплантатов было рандомизировано, и хирург не был посвящен.

Через шесть недель после имплантации кроликов умерщвляли и большеберцовые кости с прикрепленными имплантатами удаляли.

Непосредственно после удаления большеберцовые кости фиксировали в специально созданном зажимном приспособлении, и имплантаты отделяли с использованием калиброванной методики выделения, измеряя силу связывания между имплантатом и костью. Силу, необходимую для отделения имплантатов, записывали в ньютонах (Н).

Результаты (таблица III) демонстрируют, что титановые имплантаты, которые имели поверхности, модифицированные электролитическим включением молекул амелогенина и ионов гидроксида, были достоверно (р<0,001) более прочно прикреплены к кортикальному слою кости, чем контрольные имплантаты (только гидроксидизированные) через шесть недель заживления. Данный результат является клинически важным, так как раннее прикрепление кости является знаком уменьшенного времени заживления кости. Это важно для успешных клинических исходов методики «ранней нагрузки» в ортопедическом лечении и лечении с помощью внутричелюстных зубных имплантатов.

Таблица III
Оцениваемая сила отделения прикрепления имплантатов, необходимая для отделения имплантатов от кости, измеряемая в ньютонах (Н)
Имплантаты	Контроль (n=8) [Н]	Биогидроксидизированные (n=8) [Н]
1	39,6	28,6
2	29,0	77,6
3	44,8	46,0
4	11,6	30,7
5	26,4	67,8
6	6,2	87,9
7	6,9	73,9
8	17,7	62,1
Среднее значение	22,8	59,3

Пример 11: Получение микрошероховатой, мезопористой поверхности гидроксида титана с органическим соединением включения

После тщательной очистки образцов титан класса 2 монетообразных, электрополированных титановых имплантатов с площадью поверхности 0,35 см² анодно поляризовали в растворе, состоящем из 0,5 М NaCl и 5 М NaOH. Это делали при повышенной температуре для получения условий реакции для образования гидроксида титана, который морфологически модифицирует рельеф поверхности. Температуру 80°С выбирают в качестве температуры реакции, и электролиз проводят в течение 16 часов при 20 В. Микрошероховатость анализировали атомной силовой микроскопией и конфокальной лазерной сканирующей микроскопией. Пористость оценивали сканирующей электронной микроскопией. Толщина слоя гидроксида титана может быть определена микроскопией металлографических поперечных сечений. После гидроксидирования образцы имплантатов переносили в другую электролитическую ячейку, включающую амелогенин, в условия, идентичные используемым в примере 3. После дополнительного электролиза в течение 16 часов в этой ячейке количество белка в модифицированной титановой поверхности оценивали в соответствии с примером 3.

Данный эксперимент служит примером возможности способа получения микроструктурированной, мезопористой поверхности гидроксида титана с органическими включениями в двухстадийной методике.