микосорбент для очистки водной поверхности от нефтяных загрязнений

Формула изобретения

Микосорбент для очистки водной поверхности от нефтяных загрязнений, включающий нефтеокисляющие микроорганизмы, взятые в эффективном количестве, и носитель на основе торфа, отличающийся тем, что в качестве носителя он содержит гидрофобный нефтяной сорбент, в качестве нефтеокисляющих микроорганизмов - биомассу штамма микромицета: Fusarium solani ИБ-МГУ 1, или Fusarium moniliforme ИБ-МГУ 2, или Trichoderma harzianum ИБ-МГУ 3, или Cladosporium resinae ИБ-МГУ 4, или консорциума этих штаммов, иммобилизованных в гидрофобный нефтяной сорбент путем обрастания сорбента микромицетами, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Биомасса штамма микромицета
Fusarium solani ИБ-МГУ 1, или
Fusarium moniliforme ИБ-МГУ 2, или
Trichoderma harzianum ИБ-МГУ 3, или
Cladosporium resinae ИБ-МГУ 4, или
консорциума штаммов микромицетов	20-50
Гидрофобный нефтяной сорбент на основе торфа	Остальное

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к нефтяной промышленности и экологии и может быть использовано для очистки поверхности природных и искусственных водоемов, сточных вод и жидких отходов производств от загрязнений нефтью и нефтепродуктами с одновременной утилизацией загрязнения микроорганизмами.

Известны гидрофобные сорбенты на основе торфа (патенты РФ № 2116128, № 2191067, № 2201898, заявка 2003127857. Все гидрофобные сорбенты характеризуются высокой нефтеемкостью и плавучестью.

Известен гидрофобный органоминеральный нефтяной сорбент "СОРБОНАФТ" (ТУ 0392-001-55763877-2003). Сорбент получен по способу, описанному в патенте РФ №2214859.

Максимальная поглотительная способность сорбента составляет 650%, крупность частиц насыпного сорбента 0,2-3,0 мм.

Недостатком этого сорбента является то, что собранную с поверхности воды нефть необходимо либо отделять от сорбента, что требует дополнительных затрат, или утилизировать сорбент вместе с нефтью.

Известен сорбент НАФТОКС для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов (патент РФ № 2053205), выбранный нами за прототип, включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии, взятые в эффективном количестве и наполнитель в виде органического или минерального твердого субстрата, например торфа, дерновоподзолистой почвы, чернозема, торфяно-навозного компоста.

Недостатком этого биопрепарата является то, что применяемый субстрат не обладает гидрофобностью на глади воды и не имеет достаточной поглотительной способности нефти и нефтепродуктов.

Задачей изобретения является получение нового сорбента, способного осуществлять одновременно сорбцию и утилизацию нефти и нефтепродуктов с водной поверхности за счет применения штаммов микромицетов и их консорциума, способных к иммобилизации к гидрофобному сорбенту путем обрастания и характеризующихся высокой биодеструкционной активностью при ликвидации интенсивных (более 40% нефти) загрязнений в возрасте более 3 месяцев.

В этом состоит технический результат.

Результат достигается тем, что микосорбент для очистки водной поверхности от нефтяных загрязнений, включающий нефтеокисляющие микроорганизмы, взятые в эффективном количестве и носитель на основе торфа отличающийся тем, что в качестве носителя содержит гидрофобный нефтяной сорбент, в качестве нефтеокисляющих микроорганизмов - штаммы микромицетов, выбраные из Fusarium moniliforme, F.solani, Trichoderma harzianum, Cladosporium resinae (= Amorphotheca resinae) или консорциум этих штаммов, иммобилизованных в сорбент нефти путем обрастания сорбента грибами, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Штамм микромицета или
консорциум штаммов микромицетов	20-50
Гидрофобный нефтяной сорбент на основе торфа	остальное

"Штаммы Fusarium solani, F. moniliforme и Trichoderma harzianum Cladosporium resinae не депонированы и хранятся в отделе почвоведения Института биологии КНЦ УрО РАН и лаборатории экотоксикологического анализа почв факультета почвоведения МГУ им. Ломоносова и имеют обозначения присвоенные авторами:

- Fusarium solani ИБ-МГУ 1;

- F. moniliforme ИБ-МГУ 2;

- Trichoderma harzianum ИБ-МГУ 3;

- Cladosporium resinae (Amorphotheca resinae) ИБ-МГУ 4".

Штаммы получены путем селекции из нефтепродуктов и нефтезагрязненных субстратов на подкисленных средах методом чередования накопительных и чашечных культур с обязательной проверкой чистоты (Литвиненко С.Н. Защита нефтепродуктов от действия микроорганизмов. - М.: Химия, 1977 г.). Для получения применима среда следующего состава: КН₂PO₄ - 2,5; NH₄NO₃ - 5,0; MgSO₄×7H₂O - 1,0, Н₂O - 1 л и нефть - 5,0 г. В случае твердых питательных сред добавляют 20 г агар-агар на 1 л среды.

Штаммы и их консорциум, как и микоосорбент в целом (микромицеты, иммобилизованные в сорбенте) характеризуются как экологически нетоксичные. Экспериментальная оценка степени опасности препаратов проведена в соответствии с "Критериями отнесения опасных отходов к классу опасности для окружающей природной среды", утвержденными Приказом МПР России от 15 июня 2001 г., № 511. Полученные результаты подтверждены двумя стандартными методами биотестирования с применением дафний ("Определение токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафний Daphnia magna", ФР 1.1.39.2001-00-283) и водорослей ("Определение токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по изменению уровня флуоресценции хлорофилла и численности клеток водорослей Scenedesmus quadricauda", ФР 1.1.39.2001-00-284). Испытания проводились в аккредитованной лаборатории Экотоксикологического анализа почв факультета почвоведения МГУ (ЛЭТАП) (аттестат аккредитации № РОСС RU.0001.513050).

Для получения посевного материала применяют среду следующего состава, г/л: 850 мл - H ₂O; сусло - 150 мл при рН среды - 7,0 и температуре +24°С, либо картофельно-глюкозный агар (КГА).

Характеристика культур.

Fusarium solani (Mart.) Appel&Wollenw. Телеоморфа: Nectria haematococca Berk.&Br.

Колонии характеризуются довольно высокой скоростью роста - на картофельно-глюкозном агаре (КГА) за 4 дня при Т° 25°С достигают 3-2 см в диаметре. Воздушный мицелий белый, слабо-пушистый, на котором в массе образуются розоватые спородохии. Микроконидии обильные (разм. 8-14×2-4 мкм), образуются на удлиненных слегка разветвленных конидиеносцах. Септированные (с 3-мя перегородками) макроконидии (разм. 28-42×4-6 мкм) в умеренном количестве развиваются на коротких разветвленных конидиеносцах, которые вскоре формируют спородохии. Образует округлые хламидоспоры 6-10 мкм в диаметре, конечные и промежуточные, гиалиновые. Способен к анаэробному росту, однако при этом хламидоспоры не образуются.

Усваивает большой набор Сахаров и сахароспиртов. Хорошо развивается при пониженном содержании кислорода. Выдерживает 20%-ное содержание CO₂ без изменения скорости роста. Обладает широким спектром биологически активных веществ и экзоферментов, участвующих в деградации целлюлозе- и кератинсодержащих субстратов, 1-нафтола, пестицидов, моноспиртов и большого количества n-парафинов.

Оптимальная температура для линейного роста колоний 27-31°С, однако способен расти при температуре 6-7°С. Оптимум рН 6-5.

Штамм Fusarium moniloforme Sheld. Телеоморфа: Gibberella fujikuroi (Saw.) Wollenw.

Колонии плотные пушистые розоватые. Микроконидии одноклеточные формируются в цепочках из монофиалид на разветвленных конидиофорах воздушного мицелия. Макроконидии с заостренными концами серповидные, обычно с 3-мя перегородками образуются редко.

В качестве источников углерода способен потреблять глюкозу, маннозу, галактозу, фруктозу, рамнозу, арабинозу, ксилозу, рибозу, сахарозу, крахмал, сорбитол и др. Продуцирует широкий спектр ферментов и биологически активных веществ, участвующих в разложении целлюзосодержащих природных и искусственных субстратов, в деградации гербицидов, окислении углеводородов (алканов и парафинов). Способен к синтезу биостимуляторов роста (светом стимулируется синтез гиббереллина пр.)

Способен расти в анаэробных условиях, толерантен к 15%-ному содержанию NaCl в среде, что важно при ликвидации нефтяных загрязнений и сопутствующих пластовых вод.

Оптимальная температура роста 22.5-27.5°С, минимальная 2.5-5.0°С.

Trichoderma harzianum Rifai. Телеоморфа: Hypocrea sp. Webster

Колонии быстрорастущие - на 5 сутки достигают в диаметре более 9 см при 20°С. Мицелий бесцветный, стелющийся, паутинистый. Спороношение темно-зеленого цвета появляется на 3-5 день роста. Обратная сторона колонии бесцветная. Пигмент в среду не выделяется. Экссудат бесцветный. Запах отсутствует. Гифы бесцветные, гладкие 2.0-6.0 мкм в диаметре. Конидиеносцы неокрашенные, гладкие, прямые, несколько большего диаметра - 4.0-8.0 мкм. Обильно образует интеркалярные хламидоспоры. Фиалиды расположены на веточках мутовками по 2-6, редко по одной. Конидии гладкие зеленые, собраны в слизистые округлые головки размером 2.0-3.5×1.5-2.7 мкм.

Активно продуцирует гидролазы, растет на парафинах нефти.

Оптимум температурного роста широкий 15-35°С, рН 3.7-4.7, при подщелачивании среды рост замедляется, толерантен к 5%-ному содержанию в среде NaCl.

Cladosporium resinae (Lindau) G.A. de Vries (= Amorphotheca resinae Parbery)

Колонии относительно быстрорастущие, на сусло-агаре при 20°С в течение 10 дней достигают 2-3 см в диаметре. Поверхность колонии серовато-коричневая, обратная сторона (реверс) - темная оливково-коричневая. Конидиеносцы длиной 30-120 мкм, диаметром 4-5 мкм, прямые или слегка изогнутые, гладкие (бородавчатые), несколько темнее, чем вегетативные гифы. Гладкостенные эллипсоидные конидии размером 3-7×2-4 мкм формируются на нескольких уровнях, часто в цепочках. Образуют округлые хламидоспоры диаметром 9-13 мкм.

В качестве источника углерода использует мальтозу, D-глюкозу, D-ксилозу, D-галактозу, L-арабинозу и др. В качестве источника азота - пептон, сульфат аммония, нитраты. Способен к деградации крезола, керосина, фенолов, растительных масел дизельного топлива. Быстро утилизирует углеводороды (С ₉-С₁₉), несколько медленнее - с более длинной цепью. Растет на древесине, обработанной медь-, хром-, мышьяксодержащими консервантами, асфальтовом покрытии, может быть причиной коррозии металлов.

Оптимальная температура роста около 30°С, но полное торможение роста происходит лишь при 0 и выше 50°С, при температуре ниже 10°С и выше 40°С рост замедленный. Гриб растет в широком диапазоне - рН 3-8.

Способ получения микосорбента включает иммобилизацию путем обрастания готового нефтяного гидрофобного сорбента на основе торфа мицелием грибов от 20 до 50 процентов (по сухому весу) с последующей сушкой полученных фракций.

Микосорбент, содержащий не менее 20% микроорганизмов, наносят на нефтезагрязненную водную поверхность, при этом осуществляется одновременная и биодеструкция адсорбированной нефти микроскопическими грибами.

Способ получения микосорбента и его свойства показаны на примерах.

В качестве готового гидрофобного сорбента использовали нефтяной сорбент СОРБОНАФТ.

В опыте предусматривалось первоначально обрастание сорбента мицелием грибов, затем, после нанесения сорбента на нефтезагрязненную водную поверхность, определение прочности закрепления грибов и деструкции ими адсорбированной сорбентом нефти.

Способность мицелия микромицетов F.solani, F.moniliforme, T.harzianum обрастать сорбент испытывалась в лабораторных условиях. Для этого в каждую чашку Петри (диаметром 90 мм) на предварительно простерилизованную автоклавированием фильтровальную бумагу, пропитанную питательной средой (пивное неохмеленное сусло) (из расчета 2 мл на один диск фильтровальной бумаги), равномерно распределили 2 г сорбента. Культуры микроорганизмов в виде суспензии спор плодность 10⁶ ед./мл наносили на сорбент в расчете 1 мл на 1 чашку Петри.

Через 10 дней сорбент полностью покрывался мицелием грибов. Биомасса иммобилизованных в сорбент микроорганизмов составляла от 20 до 50% (по сухому весу).

Затем в цилиндрические сосуды, содержащие по 100 мл воды, на поверхность наливали по 2 мл нефти, после чего на загрязненную нефтью поверхность переносили препарат микосорбента из чашек Петри.

Сорбент полностью адсорбировал нефть и в течение 8 дней находился на поверхности воды. На 8-й день были взяты пробы воды и сорбента на микробиологический анализ.

Проба воды в количестве 0,1 мл и сорбент (на кончике бактериальной иглы) были нанесены на питательную среду Чапека в чашках Петри и равномерно распределены бактериальным шпателем по поверхности среды. Через 4 дня в чашках Петри с посевом воды появились только бактериальные колонии, в чашках с посевом сорбента наблюдался сплошной рост соответствующих грибов. Таким образом, можно говорить об устойчивом закреплении мицелия грибов на сорбенте. При микроскопическом исследовании было хорошо видно как мицелий грибов пронизывает массу сорбента с нефтью. Отмечалось образование конидий и хламидоспор грибов на не погруженной в воду хорошо аэрируемой поверхности сорбента.

По истечении 15 суток инкубации грибов повторный микробиологический анализ препарата микосорбента и воды под слоем сорбента подтвердил первичное наблюдение об прочном закреплении мицелия на поверхности сорбента.

Данные об эффективности очистки поверхности воды от нефти и нефтепродуктов с помощью предложенного микосорбента и характеристика некоторых физико-химических свойств сорбента и его эффективности в процессе биологической трансформации нефти представлены в таблице 1.

Последующая экспериментальная проверка показала заметное (на 22.5-40%) снижение уровня загрязнения микосорбента нефтью как с препаратами на основе монокультур грибов, так и в ассоциациях. Для получения препарата в большем количестве следует описанную процедуру выполнять на поверхностях большей площади.

Пример. Для получения микосорбента в качестве компонентов брали штаммы микромицета Fusarium Solani ИБ-МГУ 1, или Fusarium moniliforme ИБ-МГУ 2, или Trichoderma harzianum ИБ-МГУ 3, или Cladosporium resinae ИБ-МГУ 4 (= Amorphotheca resinae), или консорциум этих штаммов и гидрофобнный нефтяной сорбент «СОРБОНАФТ». Осуществляли иммобилизацию штамма в сорбент путем обрастания по вышеописанному способу. По окончании процесса обрастания полученную фракцию высушивали и определяли количественное соотношение биомассы штаммов и гидрофобного сорбента. Содержание биомассы штамма иммобилизованного в гидрофобный сорбент и биодеструктивная активность полученных биосорбентов приведены в таблице 1.

Таблица 1
№ п/п	Вариант	Убыль нефти, %	Биомасса штамма, иммобилизованного в гидрофобный сорбент, %	Химические показатели микосорбента через 27 суток после нанесения на нефтезагрязненную поверхность воды				Доля осевшего на дно сорбента, % к исходному
				рН	азот гидролиз.	фосфор	калий
					мг на 100 г в.с.в.
1	Fusarium monifliorme ИБ-МГУ 2	32.0	31	6.51	9.8	3.4	26.8	6.9
2	Fusarium solani ИБ-МГУ 1	22.5	20	7.13	7.0	2.3	14.6	9.4
3	Cladosporium resinae ИБ-МГУ 4 (= Amorphotheca resinae)	36,3	50	6.58	4.2	0.8	10.9	3.5
4	Trichoderma harzianum ИБ-МГУ 3	35.5	41	6.66	7.0	9.5	16.2	10.3
5	Консорциум штаммов микромицетов	42,0	35	6,7	8,5	4,2	22,2	7,0