способ диагностики хронического пиелонефрита у детей

Формула изобретения

Способ диагностики хронического пиелонефрита, включающий исследование периферической крови, отличающийся тем, что определяют степень экспрессии лимфоцитами маркеров CD95 методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител и при содержании в периферической крови маркеров CD95 более 21,31% считают наличие хронического течения пиелонефрита подтвержденным.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, иммунологии. Оно может быть использовано в клинике для диагностики хронического пиелонефрита (ХП) у детей.

Известен способ диагностики ХП по клиническим признакам, согласно которому ХП дифференцируют от цистита, гломерулонефрита, наследственного нефрита и других заболеваний (Возианов А.Ф., Майданник В.Г., Видный В.Г., Багдасарова И.В. Основы нефрологии детского возраста. - К.: Книга плюс, 2002. - С.22-91).

Известен способ диагностики пиелонефрита по определению уровня цитокинов, который выбран в качестве ближайшего аналога. Этот способ включает выявление повышения уровня цитокинов (фактора некроза опухоли-альфа, трансформирующего фактора роста-бета 1) в плазме крови иммуноферментным методом (Хворостов И.Н., Смирнов И.Е., Зоркин С.Н., Кучеренко А.Г. Цитокины при обструктивных уропатиях у детей // Вопросы современной педиатрии. - Приложение №1: Сборник материалов Х Съезда педиатров России «Пути повышения эффективности медицинской помощи детям». - 2005. - Т.4. - С.572). Недостатком данного способа является его высокая стоимость.

Целью изобретения является повышение точности, эффективности и объективизация дифференциальной диагностики хронического пиелонефрита, что обеспечит быстроту постановки диагноза, экономичность, а также своевременное и рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий.

Сущность предложенного способа диагностики состоит в том, что наряду с клиническими данными и исследованием мочи определяют уровень маркеров CD95 лимфоцитов периферической крови ребенка методом непрямой иммунофлюоресценции с применением моноклональных антител и при содержании маркеров CD95 более 21,31% диагностируют хроническое течение пиелонефрита.

CD95 (FasR) относится к рецепторным белкам семейства факторов некроза опухолей - ФНО. Основная функция системы Fas-рецептор-Fas-лиганд (FasL) - индукция апоптоза в клетках. При связывании лиганда с рецептором происходит олигомеризация цитоплазматических белков, в результате чего активируется апоптозоспецифическая протеаза (каспаза-8) и развиваются характерные для апоптоза процессы. Кроме генетически детерминированных медиаторов апоптоза, клетка может подвергаться действию других соединений, регулирующих этот процесс, например цитокинов (интерлейкинов 2, 4, 10), циркулирующих в крови или связанных с биомембранами. При инфекционных процессах развитие апоптоза зависит от конкретных факторов, выделяемых микроорганизмами (суперантигены-экзотоксины часто выступают в качестве индукторов активационного апоптоза). Разрушение клеток канальцевого эпителия, наряду с некрозом, может происходить и путем апоптоза. На завершающих этапах воспаления апоптозу принадлежит важная роль, поскольку в этот период происходит устранение активированных клеток иммунной системы, выполнивших свои функции. Возможна негативная роль апоптоза в развитии вторичного иммунодефицита у больных хроническим пиелонефритом.

Способ осуществляется следующим образом: из пробы (4-5 мл) гепаринизированной крови, взятой натощак у больных детей, выделяют лимфоциты на градиенте фиколл-верографина, затем 1-0,1 млн лимфоцитов в объеме 50 мкл вносят в лунки 96-луночного круглодонного планшета. К клеткам добавляют 5 мкл тестируемых моноклональных антител (CD95) и инкубируют 30-45 мин при +4°С. Затем добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 200 g. После удаления супернатанта вносят 50 мкл раствора Хенкса, клетки суспендируют, добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 200 g. К осадку отмытых клеток добавляют 50 мкл F(ab˜) ₂-фрагментов овечьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ и разведенных 1:100 (для разведения используют раствор Хенкса, содержащий 0,5% желатины и 0,1% азида натрия). Клетки суспендируют и инкубируют 30 мин при +4°С, затем клетки 2 раза отмывают как указано выше. Окрашенные клетки анализируют с помощью люминесцентного микроскопа. Клетки суспендируют, переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом, и препарат просматривают под иммерсией с увеличением (×3; объектив ×90). Количество антигенпозитивных клеток определяют как % флюоресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом % флюоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля используют препараты, подготовленные аналогичным образом, но без обработки моноклональными антителами. При экспрессии маркеров CD95 более 21,31% лимфоцитов устанавливают хроническое течение пиелонефрита.

ПРИМЕР.

Девочка Д., 5 лет. Год назад находилась на стационарном лечении по поводу острого пиелонефрита; отмечались симптомы интоксикации, болевой абдоминальный синдром, мочевой синдром, представленный лейкоцитурией, бактериурией. Два дня назад после кратковременного переохлаждения повысилась температуры тела до 38,50°C, появились боли в животе, в поясничной области. При поступлении в стационар состояние средней тяжести, температура 38,5°С, кожные покровы бледные, параорбитальный цианоз. Отеков и пастозности тканей нет. В легких везикулярное дыхание. ЧДД 20 в 1 мин. Тоны сердца удовлетворительной звучности. Пульс 122 в 1 мин, АД 100/60 мм рт.ст. Живот мягкий, болезненный при пальпации в области правого фланка. Симптом Пастернацкого справа положительный. Мочеиспускания учащены до 10 раз в сутки, безболезненные. В общем анализе крови нейтрофильный лейкоцитоз, увеличение СОЭ. Биохимический анализ крови: уровень общего белка, мочевины, креатинина в пределах нормы, С-реактивный белок - отриц. В общем анализе мочи - лейкоцитурия, оксалурия. Анализ мочи по Нечипоренко: лейкоциты - 25.500 в 1 мл (нейтрофилы 82%, лимфоциты 18%), эритроциты - 1000 в 1 мл. Бактериологическое исследование мочи: Е. coli 100000 КОЕ в 1 мл, чувствительна к цефтриаксону, цефтазидиму, гентамицину, норфлоксацину. Снижена антикристаллобразующая способность мочи к оксалатам кальция. По результатам исследования клиренса по эндогенному креатинину, анализа мочи по Зимницкому - функция почек сохранена. УЗИ почек и мочевого пузыря: неоднородность центрального эхо-комплекса за счет гиперэхогенных сигналов, нарушено соотношение паренхимы и чашечно-лоханочной системы справа, эхо-признаки воспалительного процесса правой почки. Экскреторная урография: выделение контрастного вещества не нарушено, отмечается сглаженность форниксов правой почки.

Уровень экспрессии маркеров CD95 лимфоцитами периферической крови 25,00%.

Диагноз. Хронический вторичный (дисметаболический) пиелонефрит, рецидивирующее течение, активная стадия. Функция почек сохранена.

Данные показывают, что уровень маркеров CD95 лимфоцитов периферической крови может служить дополнительным критерием в дифференциальной диагностике ХП.

Способ диагностики хронического пиелонефрита у детей по уровню экспрессии маркеров CD95 лимфоцитами периферической крови был апробирован на 38 детях с предварительным диагнозом хронический пиелонефрит, поставленным на основании клинических признаков (основная группа). Группу сравнения составили 14 детей с диагнозом острый пиелонефрит, контрольную группу - 30 детей с первой группой здоровья, с нормальными анализами крови и мочи. Всем обследованным производился забор крови и определение уровня экспрессии маркеров CD95 лимфоцитами периферической крови перечисленным выше способом.

Результаты проведенного исследования представлены в таблице. Для обработки полученного материала и проведения статистического анализа в исследованных группах была использована программа статистической обработки информации «STATGRAPHICS PLUS». Вычисляли среднюю и ошибку средней (М±m). Сравнение в исследованных группах проводили попарно при помощи параметрических методов, так как изучаемые выборки могли быть аппроксимированы нормальным законом распределения. Сравнение осуществляли с помощью критериев Стьюдента (t) (сравнение средних) и Фишера (сравнение средних квадратических отклонений). Уровень достоверности оценивали значением р. Различия при сравнении считали достоверными с вероятностью более 95% при P<0,05.

Таблица СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ПИЕЛОНЕФРИТА У ДЕТЕЙ
	CD95 (%) M±m (min, max)
Хронический пиелонефрит	25,45±2,07*
(n=38)	(21,31-29,59)
Острый пиелонефрит	14,20±1,38*
(n=14)	(11,44-16,96)
Здоровые	8,00±0,32*
(n=30)	(7,36-8,64)
Примечание: * - р<0,05 - достоверность различия в группах при сравнении.

У здоровых детей маркеры CD95 экспрессируют не более 8,64% лимфоцитов периферической крови, у детей, больных острым пиелонефритом, - не более 16,96%.

Полученные данные показали, что при ХП уровень маркеров CD95 лимфоцитов периферической крови достоверно увеличивался по сравнению с уровнем у детей с ОП и контрольной группой, следовательно, уровень экспрессии молекул CD95 лимфоцитами периферической крови можно считать высоко чувствительным маркером при ХП.

Использование предложенного способа диагностики имеет следующие преимущества:

1) высокую информативность для дифференциальной диагностики ХП;

2) является информативным методом определения количественного маркера нарушений механизмов апоптоза при ХП в динамике;

3) быструю диагностику;

4) обеспечивает своевременное и рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий.