фракция геля, полученная из шелухи семян подорожника блошиного

Формула изобретения

1. Гелевая фракция шелухи семян подорожника блошиного, предназначенная для снижения содержания холестерина в сыворотке крови, а также для использования в качестве пищевой добавки, которая выдерживает микробную ферментацию при проходе через моножелудочный желудочно-кишечный тракт млекопитающих, содержащая ксилозу и арабинозу при отношении масс в сухом состоянии, составляющем по меньшей мере около 3:1, а также содержащая менее чем 4 вес.% рамнозы, причем гелевая фракция растворима в разбавленном щелочном растворе и способна образовывать гель при подкислении раствора до рН около 4,5.

2. Гелевая фракция по п.1, отличающаяся тем, что весовое отношение ксилозы к рамнозе в сухом состоянии превышает 50.

3. Гелевая фракция по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит галактозу и имеет весовое отношение ксилозы к галактозе в сухом состоянии, превышающее 25.

4. Гелевая фракция по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит уроновые кислоты и имеет весовое отношение ксилозы к уроновым кислотам в сухом состоянии, превышающее 25.

5. Гелевая фракция по п.1, отличающаяся тем, что она имеет следующий состав сахаров, вес.% в сухом состоянии:

рамноза	до 3,5%
арабиноза	от 15 до 20%
ксилоза	от 55 до 70%
манноза	до 0,5%
галактоза	от 1 до 2%
люкоза и	до 0,5% г
уроновые кислоты	от 0,5 до 5%

6. Гелевая фракция по п.1, отличающаяся тем, что она имеет кажущуюся вязкость в формамиде, составляющую по меньшей мере 500 с.

7. Фармацевтическая композиция для снижения содержания холестерина в крови, характеризующаяся тем, что она содержит эффективную дозу гелевой фракции по п.1.

8. Углеводная фракция шелухи семян подорожника блошиного, предназначенная для снижения содержания холестерина в сыворотке крови, а также для использования в качестве пищевой добавки, характеризующаяся тем, что она растворима в разбавленном щелочном растворе и остается растворимой при подкислении раствора до рН около 4,5, причем указанная фракция содержит ксилозу и арабинозу при отношении по меньшей мере около 4:1, а также содержит по меньшей мере около 12 вес.% рамнозы и по меньшей мере около 15 вес.% уроновых кислот.

9. Способ снижения содержания холестерина в сыворотке крови, характеризующийся тем, что он предусматривает прием пациентом фармацевтической композиции по п.7.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к средствам для понижения содержания холестерина в сыворотке крови, к низкокалорийным пищевым загустителям (сгустителям) и к заменителям жира. Более конкретно, настоящее изобретение имеет отношение к несброженным гелеобразующим полисахаридам, полученным из шелухи семян подорожника блошиного, и их применению для понижения содержания холестерина в сыворотке крови.

Шелуху семян подорожника блошиного (Plantago ovata, известный также как испагула) обычно используют в качестве слабительного, а также для содействия регулярной функции кишечника. Шелуха семян подорожника блошиного (далее в тексте для упрощения восприятия определение "блошиный" опущено) содействует перистальтике кишечника, частично за счет увеличения массы и влажности содержимого стула (Marteau et al., 1994, Gut 35:1747-1752). Кроме того, испражнения животных и людей, которые потребляли пищу, содержащую шелуху семян подорожника, являются гелеобразными (студенистыми). Эта студенистость повышает слабительные свойства шелухи семян подорожника за счет снижения трения в кишечнике. Наблюдавшееся увеличение фекальной массы и удержания воды также может быть объяснено указанными гелеобразными свойствами материала (Marteau et al., 1994, см. выше). Гель образован в основном из не подвергавшихся брожению полисахаридов подорожника (Cabotaje et al., 1994. 1302-1307).

Используемые обычно препараты из шелухи семян подорожника имеют некоторые недостатки. Слабительные препараты из шелухи семян подорожника обычно содержат размолотую шелуху, которая является грубой и неприятной на вкус, если ее назначать для питья. Уже известно введение шелухи семян подорожника в выпечку, крекеры (галеты, печенья) и другие аналогичные продукты, однако эти продукты имеют тенденцию к неприятному на вкус образованию геля уже во рту. Однако более существенным является то, что шелуха семян подорожника может разбухать в пищеводе, что может приводить к его непроходимости. По указанным причинам препараты из шелухи семян подорожника не рекомендуются для приема внутрь пациентам, которые имеют трудности при глотании (например, пожилым людям). Наконец, рекомендуемая дневная доза шелухи семян подорожника, составляющая 3,5-11 г в день, является неудобной для проглатывания в любом виде. Таким образом, существует необходимость в такой форме препарата из шелухи семян подорожника, которая является удобной и приятной для использования.

Шелуха семян подорожника обладает многими свойствами различных видов растворимой пищевой клетчатки. Среди обычно используемых видов растворимой пищевой клетчатки можно указать пектин, камедь и овсяные отруби. Растворимая пищевая клетчатка (SDF) широко используется в пищевой промышленности и в медицине. Растворимые волокна являются компонентами таких потребляемых с минимальной обработкой источников пищи, как овес, овсяные отруби и ячмень, или же эти волокна используют как концентраты, такие как пектин, камедь и растительный клей. Камедь и растительный клей представляют собой углеводные (углеводородные) полимеры, которые обычно выделяют из растений. Растительные клеи, в частности, образуют склизкие или гелеобразные растворы в воде. Пектины имеют полимерные цепи частично метилированных галактуроновых кислот, которые также обладают способностью образовывать гель в воде. Большинство растворимых волокон быстро и полностью ферментируется и не имеет слабительных свойств.

Источником растворимой пищевой клетчатки является также вязкий холестерин сыворотки крови животных и человека (Marlett, 1997, pp.109-121, Dietary Fiber and Health. Plenum Press, New York, ed. Kritchevsky and Bonfield). Вязкость SDF, скорее чем ее ферментация (брожение) в желудочно-кишечном тракте, является ключевой в ее действии на снижение содержания холестерина (Marlett et al., 1994, Hepatology 20:1450-1457). Вязкость в просвете нижней тонкой кишки препятствует абсорбции желчных кислот и приводит к увеличению вывода желчных кислот со стулом. Можно полагать, что содержание холестерина в крови понижается в первую очередь из-за того, что он расходуется в печени для синтеза желчных кислот, необходимых для восполнения их потери (вывода). Синтез желчных кислот в печени является причиной ежедневного удаления от 40 до 50% холестерина из крови. Однако добавление в диету источника растворимого волокна, такого как овсяные отруби, приводит также к увеличению пропорции дезоксихолевой кислоты в объеме желчных кислот, что снижает абсорбцию экзогенного пищевого холестерина. Добавление в диету шелухи семян подорожника также увеличивает выведение желчных кислот ориентировочно на 50% (Gelissen et al., 1994, Am.J.Clin. Nutr. 59:395-400).

Концентраты растворимой пищевой клетчатки часто используют в пищевой промышленности в качестве загустителей и низкокалорийных заменителей жира по причине их гидроколлоидных свойств (Ward, 1997, Cereal Foods World, 42:386-390). Имеющие низкую вязкость камеди, такие как аравийская камедь, имеют как гидрофильные, так и липофильные свойства, что делает их идеальными для использования в качестве эмульгаторов, поверхностно-активных веществ и стабилизаторов. Пектины и растительные клеи обладают гелеобразующими свойствами, что делает их идеальными загустителями пищевых продуктов. Пектины традиционно экстрагируют из яблок и цитрусовых. Обычно используемые растительные клеи, как правило, экстрагируют из морских водорослей, таких как караген, агар и альгинат. Заменитель жира может быть приготовлен при комбинировании камеди с растительным клеем и/или с пектином для создания соединения, имеющего эмульсионные свойства и мягкость жира.

В соответствии с настоящим изобретением предлагается гелеобразующий компонент из шелухи семян подорожника в очищенном виде. Эта гелевая фракция (фракция геля) обладает гипохолестериновыми свойствами (свойствами снижения содержания холестерина), присущими целой (не переработанной) шелухе семян подорожника, однако имеет форму, которая легко может быть назначена в виде таблетки, капсулы или жидкости, без некоторых неприятных или небезопасных моментов, связанных с приемом нетронутой шелухи семян подорожника. Эта гелевая фракция может также найти применение в качестве пищевого загустителя или заменителя жира.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предлагается гелевая фракция шелухи семян подорожника, предназначенная для снижения содержания холестерина в сыворотке крови, а также для использования в качестве пищевой добавки, которая выдерживает микробную ферментацию (является стойкой к ней) при проходе через моножелудочный желудочно-кишечный тракт млекопитающих, которая содержит преимущественно ксилозу и арабинозу при весовом отношении в сухом состоянии (при отношении сухих масс), составляющем по меньшей мере около 3:1, и до 4% рамнозы, причем фракция растворима в разбавленном щелочном растворе и способна образовывать гель при подкислении раствора до рН около 4.5. Фракция может также содержать существенно ограниченные количества других сахаров, в частности:

от 15% до 20% арабинозы;

от 55% до 70% ксилозы;

до 0,5% маннозы;

от 1% до 2% галактозы;

до 0,5% глюкозы; и

от 0,5% до 5% уроновых кислот.

При последующей очистке гелеобразующая фракция еще более обедняется в отношении рамнозы, глюкозы и уроновых кислот.

Предпочтительное соотношение ксилозы и рамнозы в сухом состоянии превышает 50, соотношение ксилозы и галактозы, а также ксилозы и уроновых кислот (при их наличии) превышает 25.

Гелеобразующая фракция обладает также высокой вязкостью и при 0,2% концентрации в формамиде имеет кажущуюся вязкость по меньшей мере 500 сек, преимущественно 750 сек, а еще лучше 850 сек.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается также отдельная углеводная фракция шелухи семян подорожника. Эта фракция растворима в разбавленном щелочном растворе и остается растворимой при подкислении раствора до рН, составляющего около 4,5. Эта фракция содержит ксилозу и арабинозу при их отношении по меньшей мере около 4.1, а также содержит по меньшей мере около 12% (по весу) рамнозы и по меньшей мере около 15% (по весу) уроновых кислот.

Данная фракция также применима для снижения содержания холестерина в сыворотке крови и в качестве пищевой добавки.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагаются фармацевтические препараты для снижения уровней холестерина в сыворотке крови пациентов. Эти препараты имеют состав с эффективными дозами гелеобразующей фракции шелухи семян подорожника в соответствии с настоящим изобретением. Предлагаются также способы лечения пациентов с указанными заболеваниями, которые предусматривают назначение (прием) фармацевтических препаратов в соответствии с настоящим изобретением.

Указанные ранее и другие характеристики изобретения будут более ясны из последующего детального описания и приведенных далее примеров.

Было обнаружено, что гелеобразующая фракция из шелухи семян подорожника может быть использована в качестве средства для снижения содержания холестерина. В связи с этим указанная гелеобразующая фракция может быть использована изолированно или в сочетании с другими активными веществами для терапевтического лечения для снижения содержания холестерина в сыворотке крови.

Вязкая гелеобразующая фракция шелухи семян подорожника (Фракция В) в соответствии с настоящим изобретением, в первую очередь, содержит ксилозу и арабинозу. В соответствии с предпочтительным вариантом, гелеобразующая фракция содержит по меньшей мере 50% ксилозы и арабинозы по весу, преимущественно по меньшей мере 75% ксилозы и арабинозы по весу, а еще лучше по меньшей мере 85% ксилозы и арабинозы по весу. Гелеобразующая фракция имеет кажущуюся вязкость, определяемую в соответствии с методом Примера 3, которая составляет по меньшей мере 500 сек, преимущественно по меньшей мере 750 сек, а еще лучше по меньшей мере 850 сек. Гелеобразующая фракция дополнительно имеет дефицит рамнозы, галактозы и уроновых кислот, по сравнению с ксилозой. В соответствии с предпочтительным вариантом, весовое отношение ксилозы к рамнозе превышает 50, преимущественно это отношение превышает 60, а в наиболее предпочтительном варианте это отношение превышает 65. В соответствии с предпочтительным вариантом, весовое отношение ксилозы к галактозе превышает 25, преимущественно это отношение превышает 35, а в наиболее предпочтительном варианте это отношение превышает 42. В соответствии с предпочтительным вариантом, весовое отношение ксилозы к уроновой кислоте превышает 15, преимущественно это отношение превышает 25, а в наиболее предпочтительном варианте это отношение превышает 35. В соответствии с предпочтительным вариантом, весовое отношение ксилозы к арабинозе во Фракции В составляет от 2,5 до 4,5, преимущественно это отношение составляет от 3,0 до 4,0, а в наиболее предпочтительном варианте это отношение составляет от 3,25 до 3,75.

Растворимая в кислоте фракция шелухи семян подорожника (Фракция С) также имеет высокое содержание ксилозы и арабинозы. В соответствии с предпочтительным вариантом, растворимая в кислоте фракция имеет по меньшей мере 25% ксилозы и арабинозы по весу, преимущественно по меньшей мере 40% ксилозы и арабинозы по весу, а еще лучше по меньшей мере 45% ксилозы и арабинозы по весу. Несмотря на то, что Фракция С имеет кажущуюся вязкость, аналогичную вязкости Фракции В, она не имеет гелеобразующего свойства Фракции В. Фракция С дополнительно имеет высокое содержание рамнозы, галактозы и уроновых кислот, по сравнению с ксилозой. В соответствии с предпочтительным вариантом, весовое отношение ксилозы к рамнозе составляет менее 6,0, преимущественно менее 4,5, а еще лучше, если указанное весовое отношение составляет менее 3,0. В соответствии с предпочтительным вариантом, весовое отношение ксилозы к галактозе составляет менее 40, преимущественно указанное отношение составляет менее 30, а еще лучше, если указанное отношение составляет менее 25. В соответствии с предпочтительным вариантом, весовое отношение ксилозы к уроновой кислоте составляет менее 30, преимущественно указанное отношение составляет менее 10, а еще лучше, если указанное отношение составляет менее 5,0. В соответствии с предпочтительным вариантом, весовое отношение ксилозы к арабинозе во Фракции С составляет более 3,0, преимущественно указанное отношение составляет более 4,0, а еще лучше, если указанное отношение составляет более 4,5.

Приготовление фракций шелухи семян подорожника

Для получения описанных здесь выше очищенных и разделенных фракций используется следующий способ фракционирования шелухи семян подорожника. В своей наиболее основной форме способ включает в себя следующие операции:

1. Образование суспензии шелухи семян подорожника в разбавленном щелочном водном растворе (содержащем преимущественно 0,15-0,2 М гидроксильных ионов), содержащем восстановитель, в котором некоторые порции материала шелухи семян подорожника будут растворяться, в то время как некоторые другие порции останутся нерастворимыми;

2. Удаление нерастворимого в щелочи материала (который именуется здесь как "Фракция А"), например, за счет центрифугирования;

3. Подкисление растворимой в щелочи фракции операции 1 до рН в диапазоне от 3 до 6, а преимущественно до значения 4,5, чтобы получить гель (Фракция В) и растворимую в кислоте фракцию (Фракция С);

4. Выделение геля из подкисленного раствора, например, при помощи центрифугирования.

Один из примеров этого способа описан в Примере 1. Существует множество вариантов указанного способа, которые однако существенно не изменяют природу выделенного продукта. Эти варианты подробно описаны ниже.

Операция растворения (солюбилизации) в щелочи имеет множество вариаций. Описанный в Примере 1 способ является усовершенствованием известных ранее способов растворения. Прежде для растворения в щелочи полисахаридов шелухи семян подорожника использовали концентрированные щелочные растворы (например, 1,2 М NaOH, Kennedy et al., 1979, см. выше) без восстановителя. Учитывая жесткую природу такой обработки, приводящую к частичной деградации цепей полисахаридов в гелеобразующей фракции, авторы настоящего изобретения показали, что может быть получена гелеобразующая фракция предположительно в более подходящей для последующего фракционирования форме, с использованием намного менее концентрированного щелочного раствора и подходящего химического восстановителя, такого как борогидрид. Несмотря на то, что может быть использован щелочной раствор до 4 N, концентрация основания при щелочном растворении преимущественно составляет по меньшей мере 0,15 N и не более чем 1,0 N; предпочтительно по меньшей мере 0,15 N и не более чем 0,5 N; а еще лучше по меньшей мере 0,15 N и не более чем 0,2-0,3 N. При щелочной экстракции может быть использовано любое стандартное основание, в том числе (но без ограничения) гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид лития, гидроксид аммония и тетраметил гидроксид аммония.

Химический восстановитель, такой как борогидрид, должен быть добавлен при проведении операции щелочного растворения для сведения к минимуму катализируемой основанием деполимеризации. В Примере 1 использована концентрация 1 г/л борогидрвда натрия, однако диапазон эффективных концентраций составляет ориентировочно от 50 мг/л до 10 г/л. В соответствии с предпочтительным вариантом, концентрация борогидрида натрия составляет по меньшей мере 100 мг/л и не более чем 4 г/л, преимущественно по меньшей мере 500 мг/л и не более чем 2 г/л, а еще лучше по меньшей мере 800 мг/л и не более чем 1,2 г/л. При проведении этой операции могут быть использованы и другие формы борогидрида, в том числе (но без ограничения) борогидрид лития, борогидрид калия и цианоборогидрид натрия.

Степень начальной обработки шелухи семян подорожника может влиять на проведение операции щелочного растворения, что известно специалистам в данной области. Важно, чтобы материал шелухи семян подорожника был обработан таким образом, чтобы он содержал небольшие куски, что позволяет легче разделять вязкие полисахариды от нерастворимых и волокнистых материалов стенок клеток. В Примере 1 используют молотую шелуху семян подорожника, однако может быть использован любой другой процесс измельчения растительного материала, причем такие процессы хорошо известны сами по себе.

Отношение количества материала шелухи семян подорожника к объему щелочного раствора имеет важное значение для эффективной солюбилизации (растворения) фракций полисахаридов. В Примере 1 вводят 2 г шелухи семян подорожника в 400 мл щелочного раствора, однако это отношение может варьироваться без существенного влияния на солюбилизациию. Например, можно вводить ориентировочно от 0,1 г до 4 г шелухи семян подорожника в 400 мл щелочного раствора. Кроме того, время солюбилизации (в диапазоне 0,5 часа-24 часа) можно варьировать для оптимизации процедуры при температуре в диапазоне 4-50°С.

Операция 2 способа в соответствии с настоящим изобретением предусматривает разделение нерастворимых в щелочи материалов от растворимых в щелочи материалов. В Примере 1 для решения этой задачи используют центрифугирование. Однако могут быть использованы и различные другие процедуры и их вариации, которые не изменяют существенно выделенные (изолированные) растворимые материалы. Специалисты легко поймут, каким образом следует изменить время и усилие центрифугирования для адаптации операции разделения к различным роторам центрифуги, к различным растительньм материалам и к различным щелочным растворам. Для осуществления операции разделения могут быть использованы и другие методики, которые хорошо известны сами по себе, причем некоторые из этих методик лучше подходят для промышленного использования способа в соответствии с настоящим изобретением. Среди представляющих интерес способов разделения можно указать (но без ограничения) проточное центрифугирование или фильтрацию (с перемешиванием). В Примере 1 дополнительно предусмотрены промывка нерастворимых материалов при помощи щелочного раствора и повторное разделение для повышения выхода растворимых в щелочи материалов. Указанная операция промывки не является обязательной, но может быть преимущественно использована для повышения выхода материала.

Операция 3 предусматривает подкисление растворимых в щелочи материалов, полученных при проведении операции два. В Примере 1 это осуществлено путем добавления ледяной уксусной кислоты в объединенные растворимые в щелочи материалы, пока рН не достигнет значения 4,5. Диапазон значений рН, применимый при этой кислотной солюбилизации, может варьироваться без существенного влияния на процедуру. В соответствии с предпочтительным вариантом, используют значение рН в диапазоне от 3 до 6, преимущественно в диапазоне от 4 до 5, а еще лучше, если рН равно ориентировочно 4,5, как это использовано в Примере 1. Выбор кислоты также подвержен вариациям. Среди прочих, при проведении операции три могут быть использованы уксусная, соляная, серная, щавелевая, трихлоруксусная и трифторуксусная кислоты. При проведении операции 3, как и при проведении операции один, могут варьироваться время, температура и другие параметры солюбилизации, однако преимущественно эту операцию проводят при окружающей температуре в течение ориентировочно 2 часов.

Операция 4 предусматривает разделение нерастворимого в кислоте гелеобразного материала (Фракция В) от растворимых в кислоте материалов (Фракция С). Для проведения указанного разделения преимущественно используют центрифугирование. Для повышения эффективности разделения можно также использовать промывку нерастворимой массы геля (например, в воде, в буферном или ином подходящем растворителе).

В качестве альтернативы центрифугированию при проведении операции 4 могут быть использованы два других подхода, которые годятся для промышленного выпуска препаратов. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что гелеобразный материал Фракции В всплывает, причем гель имеет хорошую целостность. Поэтому гель может быть сцежен или снят с поверхности подкисленной смеси при помощи лопатки, например, такого типа, которую используют для снятия творога (створоженного молока) при производстве сыра. После этого гелевый материал помещают в отдельный резервуар, где он может быть промыт при проведении дополнительной операции очистки. Альтернативно, сосуд, в котором находится подкисленный раствор с плавающим на его поверхности гелем, может быть дренирован снизу за счет силы тяжести или при приложении небольшого вакуума, так чтобы гель оставался на дне сосуда. И в этом случае гель может быть дополнительно промыт.

При подготовке Фракции В и Фракции С для хранения и/или для использования могут быть применены различные процедуры. Для хранения могут быть использованы полисахаридные препараты Фракций В и С, или же эти фракции могут хранится в гидратированной форме. При хранении в гидратированной форме могут быть добавлены консерванты или бактериостатические вещества. Для хранения особенно предпочтительным является использование сушки полисахаридных препаратов. В соответствии с предпочтительным вариантом, Фракцию В и Фракцию С обезвоживают за счет обработки 95% этанолом, промывают диэтиловым эфиром и сушат. Обезвоживание указанных фракций может быть также осуществлено при помощи других растворителей, таких как метанол, ацетон или изопропиловый спирт. Для сушки (обезвоживания) указанных фракций может быть также использован любой стандартный способ дегидратации (например, выпаривание, лиофилизация), при условии поддержания температуры ниже ориентировочно 60°С, а преимущественно ниже ориентировочно 40°С.

Использование фракций шелухи семян подорожника

Фракции шелухи семян подорожника в соответствии с настоящим изобретением используют в качестве терапевтических препаратов. Было показано, что вязкая гелеобразующая фракция, а именно Фракция В, является эффективной в качестве средства снижения содержания холестерина. Этот материал может быть использован изолированно или в сочетании с другими активными веществами в терапевтических или профилактических препаратах при повышенном содержании холестерина в сыворотке крови. Такие препараты в виде таблеток, капсул или жидкостей для приема перорально могут содержать гелеобразующую фракцию. В соответствии с предпочтительным вариантом, удобной для приема в виде таблеток или капсул является сухая форма геля, причем после приема внутрь (проглатывания) пациентом происходит регидратация геля. Что касается регидратации, то следует сказать, что гелеобразующая фракция обладает особенно предпочтительными характеристиками гидратации. После выделения и сушки гелеобразующая фракция имеет малую скорость гидратации. Основываясь на наблюдениях, полученных при экспериментах на крысах, можно определенно полагать, что введенный гель становится гидратированным в верхней части кишечника, где он оказывает свое действие по снижению содержания холестерина. Эта задержка гидратации является благоприятной, так как за счет этого снижается или исключается риск преждевременной гидратации, например, в пищеводе.

Гелеобразующие препараты могут быть также введены в пищевые продукты. Так как активные полисахариды были отделены (очищены) от других компонентов клеток растений при помощи описанного выше способа, то они не имеют неприятного вкуса, причем нет необходимости введения их значительных количеств, что требуется при применении известных в настоящее время препаратов из шелухи семян подорожника.

Как это описано далее в Примере 5, гелеобразующая фракция шелухи семян подорожника может быть использована в качестве средства для снижения содержания холестерина. И в этом случае указанная фракция может быть использована изолированно или в сочетании с другими активными веществами в качестве терапевтического средства для снижения содержания холестерина. Для взрослого человека необходимая доза Фракции В в сухом виде составляет ориентировочно от 3 до 7 г в день. Фракции В и С шелухи семян подорожника в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы также в качестве пищевых добавок. Они могут быть использованы в качестве загустителей, формирователей геля и наполнителей при приготовлении пищи. Они также могут быть использованы в сочетании с другими пищевыми добавками для получения систем имитации жиров. Так как полисахаридные препараты в соответствии с настоящим изобретением являются частично не перевариваемыми, они дополнительно являются низкокалорийными, снижающими содержание холестерина и имеющими слабительные свойства. Полисахаридные препараты Фракций В и С могут быть использованы в различных пищевых продуктах, в которых в настоящее время используют камедь и растительный клей.

Указанные ранее и другие характеристики изобретения будут более ясны из последующих примеров, не имеющих ограничительного характера.

ПРИМЕР 1

Фракционирование шелухи семян подорожника

Молотая шелуха семян подорожника (2 г) в атмосфере азота, в течение 90 минут, была перемешана с 0,2 N гидроксидом калия (400 мл), содержащим борогидрид натрия (400 мг). Смесь центрифугировали в течение 20 минут при 23,500×g. Надосадочная жидкость была сцежена с нерастворимой фракции, которая осаждалась в колбе центрифуги. Нерастворимую фракцию (именуемую как "Фракция А") перемешивали со свежим раствором гидроксида калия и борогидрида натрия (100 мл) дополнительно в течение 15 минут и повторно центрифугировали. Надосадочные жидкости после двух операций центрифугирования объединяли. Значение рН объединенных надосадочных жидкостей доводили до 4,5 при помощи ледяной уксусной кислоты, при перемешивании, при окружающей температуре, после чего центрифугировали в течение 60 минут при 25,500×g. Надосадочная жидкость (Фракция С) была сцежена с массы геля (Фракция В), которая осаждалась в колбе центрифуги. Гель был осторожно промыт водой (50 мл) для удаления налипшей надосадочной жидкости, причем эта промывочная вода была добавлена в надосадочную жидкость. Гелевая фракция была обезвожена за счет обработки 95% этанолом, промыта диэтиловым эфиром и высушена.

Ранее обезвоживания Фракции В в некоторых случаях проводят дополнительную очистку Фракции В путем повтора описанных здесь выше операций щелочной солюбилизации и подкисления. При этом гель повторно суспендируют в 0,2 N КОН, подкисляют до рН 4,5 и центрифугируют для извлечения геля.

ПРИМЕР 2

Определение состава сахара Фракций В и С шелухи семян подорожника

Было проведено определение составов сахара гелевой фракции (Фракция В) и

растворимой в кислоте фракции (Фракция С), полученных по способу, описанному в

Примере 1. Результаты сведены в Таблицу 1.

Таблица 1. Состав фракций шелухи семян подорожника (вес.% в сухом состоянии).
Шелуха семян		Нерастворимая в	Растворимая в щелочи
подорожника (2 г)		щелочи (Фракция А)	Нерастворимая в кислоте (Фракция В)	Растворимая в кислоте (Фракция С)
Выход (г)	-	0,328	1,164	0,255
Состав (вес.% в сухом состоянии)
Рамноза	3,17	0,49	0,95	14,86
Арабиноза	19,93	33,58	19,45	8,11
Ксилоза	49,15	3,16	67,20	38,79
Манноза	2,17	10,84	0,0	0,0
Галактоза	3,83	12,86	1,59	1,89
Глюкоза	4,37	19.34	0,37	0,75
Уроновые	5,41	3,58	1,74	16,84
Отношения в сухом
Ксилоза	/15,50	6,45	70,70	2,61
Ксилоза	/2,47	0,094	3,46	4,78
Ксилоза	/12,83	0,25	42,26	20,52
Ксилоза/Уроновые	9,08	0,88	38,62	2,30

ПРИМЕР 3

Измерение вязкости гелеобразующей фракции шелухи семян подорожника

Была определена кажущаяся вязкость гелеобразующей фракции (Фракция В) шелухи семян подорожника. Раствор для определения кажущейся вязкости был получен путем перемешивания в течение ночи 0,2% раствора сухой фракции в формамиде. После этого раствор при перемешивании нагревали до 70°С в течение 5 минут, а затем перемешивали 1 час при окружающей температуре. Измерение кажущейся вязкости производили с использованием вискозиметра с пипеткой (Ostwald Dropping Pipet Viscometer, Cat. No. 13-695, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Вязкость раствора измеряли три раза и находили среднее значение.

Таблица 2. Кажущаяся вязкость Фракции В шелухи семян подорожника, с
Растворимая в щелочи и не растворимая в кислоте фракция (Фракция В)	876
Формамид (только растворитель)	303

ПРИМЕР 4

Экстракция растворителем компонентов шелухи семян подорожника

Компоненты шелухи семян подорожника могут быть также получены путем экстракции различными растворителями. Среди таких растворителей можно указать формамид, диметилсульфоксид и 4-метилморфолин-N-оксид (50% раствор в воде).

Молотую шелуху семян подорожника (2 г) добавляли небольшими порциями в выбранный растворитель (200 мл) при перемешивании в течение 30-60 мин. В соответствии с одной из методик смесь перемешивали в течение двух дней при комнатной температуре, а затем центрифугировали в течение 40 мин при 27,000×g. В соответствии с альтернативной методикой смесь перемешивали при повышенной температуре (до 60°С), при этом продолжительность перемешивания может быть снижена до 12 часов.

Гранулированный нерастворимый материал повторно суспендировали и перемешивали в дополнительном растворителе (50 мл) в течение 30 мин, а затем повторно центрифугировали. Добавляли объединенные надосадочные жидкости при перемешивании в 95% этанол (5 объемов), и доводили конечную концентрацию этанола до 80%. Этанол на этом этапе может быть замещен метанолом, изонропиловым спиртом, ацетоном или другими аналогичными растворителями. Осадок собирали и промывали абсолютным этанолом, а затем диэтиловым эфиром, после чего сушили.

Полученный не растворимый в этаноле осадок аналогичен по составу растворимому в щелочи материалу, описанному в Примерах 1-3. Составы сахаров фракций, полученных при помощи описанной первоначальной экстракции растворителем, приведены в Таблице 3.

Таблица 3. Составы сахаров фракций (вес.% сухой массы)
	Фопмамид	4-метилморфолин-N-оксид	Диметилсульсфокси
Рамноза	3,03	3,25	0,48
Арабиноза	18,95	16,54	17,38
Ксилоза	65,56	57,47	65,33
Манноза	0,05	0,0	0,12
Галактоза	1,54	1,50	1,64
Глюкоза	0,21	0,22	0,34
Уроновые кислоты	4,30	4,69	0,94

ПРИМЕР 5

Влияние шелухи семян подорожника и ее фракций на реабсорбцию желчных кислот из тонких кишок крыс

Одним из основных участков гипохолестеринового действия пищевой клетчатки (за счет действия на желчные кислоты) является нижняя часть тонких кишок (подвздошная кишка). Желчные кислоты в тонкой кишке работают как эмульгаторы, способствующие перевариванию и абсорбции жира. Они синтезируются из холестерина в печени, хранятся в желчном пузыре и поступают в тонкую кишку при еде. Желчные кислоты сохраняются за счет реабсорбции в подвздошной кишке и рециркулируются назад в печень через кровь. Переваривание пищи и абсорбция влаги протекают по мере перемещения пищевого материала в кишечнике таким образом, что нижняя треть тонкой кишки в просвете содержит главным образом непереваренный материал (то есть волокна) и некоторую часть жидкости. В настоящее время известно, что многие вязкие растворимые волокна сохраняют свою вязкость при проходе через верхний желудочно-кишечный тракт и накапливаются главным образом в нижней части кишечника. Эти растворимые волокна эффективно препятствуют реабсорбпии желчных кислот в подвздошной кишке, которая является единственным участком кишечника, обеспечивающим необходимые транспортирующие протеины для желчных кислот. Желчные кислоты выводятся со стулом и восполняются за счет нового синтеза в печени из холестерина крови, что эффективно снижает уровни холестерина в крови.

У подопытных крыс хирургическим путем удаляли слепую кишку и ободочную кишку и соединяли конец подвздошной кишки с прямой кишкой. После восстановительного периода 7-10 дней эти животные выделяли мягкий отформованный материал, который называется идеальными испражнениями (экскретами). Идеальные испражнения являются более предпочтительными, чем стул, для измерения воздействия вещества на абсорбцию желчных кислот, так как бактериальное трансформирование желчных кислот в толстой кишке может снижать наполовину их содержание в стуле.

Тестовая (испытательная, пробная) пища скармливалась группам крыс, каждая из которых состояла из четырех крыс. Тестовая пища содержала 5% волокна либо (1) шелухи семян подорожника (PSH); либо (2) целлюлозы (в качестве контроля); или (3) количество выбранной Фракции (А, В или С) шелухи семян подорожника, отдельно или в сочетании, которое содержится в 5% шелухи семян подорожника. Тестовая пища также содержала не перевариваемый маркер, так что концентрация маркера в идеальных испражнениях может быть использована для расчета количества тестовой пищи, образовавшей идеальные испражнения.

Результаты анализа после приема тестовой пищи приведены в Таблице 4.

Таблица 4. Количество выведенных желчных кислот после приема тестовой пищи, содержащей различные растворимые волокна.
Тестовая пища	Количество выведенных желчных кислот* (мкмоль/г тестовой пищи)
Целлюлоза	8,32±2,42
Немолотая PSH	18,41±2,61
Фракция А	9,07±2,75
Фракция В	16,08±3,20
Фракция С	13,76±2,71
Совместно А, В, С	15,65±1,37
*Среднее±SEM (среднеквадратическая погрешность), n=4 крысы

Увеличение экскреции желчных кислот свидетельствует о сопутствующем снижении желчных кислот, реабсорбируемых в кровь. Вещество, которое препятствует реабсорбции желчных кислот в кровь из подвздошная кишки, считается имеющим гипохолестериновые свойства. Приведенные выше результаты показывают, что гипохолестериновые свойства имеет шелуха семян подорожника (PSH), а в особенности удобно вводимая гелеобразующая фракция (Фракция В), которая по гипохолестериновому действию в основном эквивалентна целой шелухе семян подорожника.

ПРИМЕР 6

Демонстрация слабой ферментации гелеобразующей фракции шелухи семян подорожника in vitro

Для проведения ферментации in vitro (в пробирке) шелухи семян подорожника и ее фракций были использованы колбы для ферментации емкостью 40 мл. Для ферментации использовали 200 мг углеводов, из которых 31 мг получали из телячьего бульона и 45 мг из дрожжей, а остаток был образован Фракциями А, В и С шелухи семян подорожника. Фракции были выделены из молотой шелухи семян подорожника в соответствии с ранее описанным. Проба "3 фракции вместе" содержит три выделенные из шелухи семян подорожника фракции, которые повторно объединены в пропорциях, соответствующих их исходной концентрации в указанной шелухе. Инокулят представляет собой фекальные содержимые, полученные от крыс, получавших очищенную пищу, содержащую 5% (по весу) шелухи семян подорожника. Экспериментальные протоколы и анализы соответствуют методикам, описанньм в публикации Monsma & Marlett (J. Nutr. 126. - 554-563, 1996). Было показано, что полученные по этой методике результаты аналогичны результатам, полученным in vivo при ферментации у людей (Monsma et al., J.Nutr. 130: 585-593, 2000). Все ферментации были подготовлены и проведены в анаэробной камере, причем их проводили дважды (дублировали).

В Таблице 5 приведены результаты ферментации in vitro. Углеводы в колбах для ферментации содержат 11 нейтральных и аминосахаров, а также уроновые кислоты; они были получены из телячьего бульона и из дрожжей тестового субстрата (смотри примечания "а" и "b" к Таблице 5). Кажущаяся ферментация сахаров из указанных источников подытожена, так чтобы выделить ферментацию тестовых фракций. Как это показано в таблице, Фракция С почти полностью ферментируется за 24 часа. В отличие от этого, Фракция В ферментируется только частично (Ориентировочно на 25-35%), причем ее ферментация прекращается через 48 часов. Фракция А ферментирована слабо, и ее ферментация ограничена первыми 12 часами периода ферментации.

Таблица 5.

Исчезновение нейтральных сахаров в ходе ферментации in vitro шелухи семян подорожника и ее фракций

Полисахарид/сахар		0 ч	12 ч	24 ч	48 ч	72 ч
	буфер a	фракцияb	- оставшийся % -
	- мг в колбе -
Шелуха семян подорожника
Рамноза	0,6	4,5	21	22	21	22
Арабиноза	0,9	28,1	84	84	76	82
Ксилоза	2,6	69,3	68	46	39	40
Галактоза	4,3	5,4	61	67	61	66
Другие сахарас	65,5	9,2	23	22	19	21
3 объединенные фракции
Рамноза	0,6	4,4	19	22	22	22
Арабиноза	0,9	29,9	85	81	76	80
Ксилоза	2,6	70,0	73	47	44	44
Галактоза	4,3	5,7	56	61	58	60
Другие сахара	65,5	8,6	24	22	21	20
Фракция С
Рамноза	0,6	21,4	16	6	6	6
Арабиноза	0,9	11,6	47	19	18	19
Ксилоза	2,6	57,3	53	11	9	8
Уроновые кислоты	3,1	30,5	22	следы	следы	следы
Другие сахара	69,9	3,6	14	12	8	9
Фракция В
Рамноза	0,6	1,3	79	61	52	53
Арабиноза	0,9	26,8	93	85	78	76
Ксилоза	2,6	91,4	84	76	65	59
Другие сахара	69,9	2,2	13	10	10	10
Фракция А
Арабиноза	0,9	49,2	100	100	100	100
Ксилоза	2,6	4,6	68	58	59	59
Манноза	15,4	16,0	56	58	65	55
Галактоза	4,3	19,8	91	89	94	98
Глюкоза	35,3	29,4	53	50	54	55
Другие сахара	17,4	0,7	27	23	19	19

а. Сахара из телячьего бульона и из дрожжей, которые являются частью ферментата, обеспечивают ориентировочно 70-75 мг углеводов для ферментации.

b. Сахара в тестовом субстрате по расчету обеспечивают ориентировочно 120-125 мг углеводов для ферментации.

с. Включает в себя сахара из следующего списка, которые специально не указаны: рамноза, фукоза, рибоза, арабиноза, ксилоза, манноза, галактоза, глюкоза, миоинозит, глюкозамин и галактозамин. Несмотря на то, что уроновые кислоты и были включены в расчет количества подлежащих ферментации углеводов, измерение их количества производилось не во всех пробах и поэтому не включено во все сводки, за исключением сводки для Фракции С.

ПРИМЕР 7

Восстановительное расщепление и ЯМР анализ Фракции В шелухи семян подорожника

Полисахарид Фракции В шелухи семян подорожника был полностью метилирован и затем восстановительно расщеплен в присутствии триэтилсилана и триметилсилил трифторметансульфоната в соответствии со стандартными методиками. Полученные продукты были ацетилированы на месте нахождения и проанализированы при помощи газовой и жидкостной хроматографии и массовой спектрометрии (GLC-MS) в колонке DB-5. Результаты приведены в Таблице 6.

Таблица 6.

Результаты анализа восстановительного расщепления

Пик	Радикал	Молекулярный процент
1	Окончание Xylp	23,27
2	Окончание Araf	16,95
3	3-связанный Araf	10,76
4	3-связанный Xylp	4,33
5	Окончание Galp	1,07
6	2,3- или 3,4-связанный Xylp	11,84а
7	2,3-связанный Araf	3,44
8	2,4-связанный Xylp	21,41b
	3,5-связанный Araf	0,58b
9	2,5-связанный Xylp	2,68
10	Неопознанный
11	3-связанный Galp	0,66b
	2,3,4-связанный Xylp	3,01 b

а. Стандартный анализ путем метилирования показывает, что этот радикал Xylp является 3,4-связанным.

b. Коэлюирующие компоненты были разделены при помощи GLC на колонке RTx-200.

При использовании процесса восстановительного расщепления намного легче разделить компоненты для проведения их идентификации и количественной оценки, а также для получения более точной структурной информации, чем в случае применения стандартной методики метилирования и гидролиза. Приведенные в Таблице 6 данные показывают, что полисахарид Фракции В является высокоразветвленной и очень сложной молекулой. Основная ксилановая цепь содержит, в дополнение к ветвям ксилозы и арабинозы, ветви неопределенной длины, которые могут содержать оба сахара.

Полисахарид также подвергался двухмерному ЯМР-анализу, результаты которого показывают, что радикалы ксилозы являются бета-связанными, а радикалы арабинозы являются альфа-связанными. Последнее утверждение поддерживается действием альфа-L-арабинофуранозидазы на полисахарид.

Несмотря на то, что были описаны предпочтительные варианты осуществления изобретения, совершенно ясно, что в них специалистами в данной области могут быть внесены изменения и дополнения, которые не выходят однако за рамки формулы изобретения.