способ лечения или предупреждения ожирения

Формула изобретения

1. Применение композиции, включающей амилин или агонист амилина, для изготовления лекарственного средства для лечения ожирения при условии, что композиция не включает холецистокинин или агонист холецистокинина, причем агонист амилина имеет следующую аминокислотную последовательность:

¹A ₁-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr- ¹⁰Gln-Arg-Leu-

B₁-Asn- ¹⁵Phe-Leu-C₁-D₁ -E₁-²⁰F ₁-G₁-Asn-H₁ -Gly-²⁵Pro-I₁-

Leu-Pro-J₁-³⁰Thr-K ₁-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z,

где A₁ обозначает Lys, Ala, Ser или водород;

B₁ обозначает Ala, Ser или Thr;

C₁ обозначает Val, Leu или Ile;

D₁ обозначает His или Arg;

E ₁ обозначает Ser или Thr;

F₁ обозначает Ser, Thr, Gln или Asn;

G₁ обозначает Asn, Gln или His;

H₁ обозначает Phe, Leu или Tyr;

I₁ обозначает Ile, Val, Ala или Leu;

J₁ обозначает Ser, Pro или Thr;

K₁ обозначает Asn, Asp или Gln;

X и Y независимо выбирают из остатков, имеющих боковые цепи, которые химически связаны друг с другом с образованием внутримолекулярной связи, при этом указанные внутримолекулярные связи включают дисульфидную, лактамную или тиоэфирную связь; и Z обозначает амино, алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси; при условии, что когда A₁ обозначает Lys, B₁ обозначает Ala, C₁ обозначает Val, D₁ обозначает Arg, E ₁ обозначает Ser, F₁ обозначает Ser, G₁ обозначает Asn, H₁ обозначает Leu, I₁ обозначает Val, J ₁ обозначает Pro, и K₁ обозначает Asn, то один или более из A₁-K ₁ обозначает D-аминокислоту, и Z выбирают из группы, состоящей из алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси.

2. Применение композиции, включающей агонист амилина, для изготовления лекарственного средства для лечения ожирения, при условии, что композиция не включает холецистокинин или агонист холецистокинина, причем агонист амилина имеет следующую аминокислотную последовательность:

¹A₁-X-Asn-Thr-⁵ Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-

B₁-Asn-¹⁵Phe-Leu-C ₁-D₁-E₁- ²⁰F₁-G₁-Asn-H ₁-Gly-²⁵Pro-I₁ -

Leu-J₁-Pro-³⁰ Thr-K₁-Val-Gly-Ser-³⁵ Asn-Thr-Tyr-Z,

где A₁ обозначает Lys, Ala, Ser или водород;

B₁ обозначает Ala, Ser или Thr;

C₁ обозначает Val, Leu или Ile;

D₁ обозначает His или Arg;

E₁ обозначает Ser или Thr;

F₁ обозначает Ser, Thr, Gln или Asn;

G₁ обозначает Asn, Gln или His;

H₁ обозначает Phe, Leu или Tyr;

I ₁ обозначает Ile, Val, Ala или Leu;

J ₁ обозначает Ser, Pro, Leu, Ile или Thr;

K ₁ обозначает Asn, Asp или Gln;

Х и Y независимо выбирают из остатков, имеющих боковые цепи, которые химически связанны друг с другом с образованием внутримолекулярной связи, при этом указанная внутримолекулярная связь включает дисульфидную, лактамную или тиоэфирную связь; и Z обозначает амино, алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси; и при условии, что когда

(а) А ₁ обозначает Lys, B₁ обозначает Ala, C₁ обозначает Val, D₁ обозначает Arg, E₁ обозначает Ser, F ₁ обозначает Ser, G₁ обозначает Asn, H₁ обозначает Leu, I₁ обозначает Val, J₁ обозначает Pro, и K ₁ обозначает Asn, или

(б) A₁ обозначает Lys, B₁ обозначает Ala, C ₁ обозначает Val, D₁ обозначает His, E₁ обозначает Ser, F₁ обозначает Asn, G₁ обозначает Asn, H ₁ обозначает Leu, I₁ обозначает Val, J₁ обозначает Ser, и K₁ обозначает Asn,

то один или более из A ₁-K₁ обозначает D-аминокислоту, и Z выбирают из группы, состоящей из алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси.

3. Применение композиции, включающей агонист амилина, для изготовления лекарственного средства для лечения ожирения, при условии, что композиция не включает холецистокинин или агонист холецистокинина, причем агонист амилина имеет следующую аминокислотную последовательность:

¹ A₁-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr- ¹⁰Gln-Arg-Leu-

B₁-Asn- ¹⁵Phe-Leu-C₁-D₁ -E₁-²⁰F ₁-G₁-Asn-H₁ -Gly-²⁵I₁-J ₁-

Leu-Pro-Pro-³⁰Thr-K ₁-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z,

где A₁ обозначает Lys, Ala, Ser или водород;

B₁ обозначает Ala, Ser или Thr;

C₁ обозначает Val, Leu или Ile;

D₁ обозначает His или Arg;

E ₁ обозначает Ser или Thr;

F₁ обозначает Ser, Thr, Gln или Asn;

G₁ обозначает Asn, Gln или His;

H₁ обозначает Phe, Leu или Tyr;

I₁ обозначает Ala или Pro;

J₁ обозначает Ile, Val, Ala или Leu;

K₁ обозначает Asn, Asp или Gln;

X и Y выбирают независимо из остатков, имеющих боковые цепи, которые химически связанны друг с другом с образованием внутримолекулярной связи, при этом указанная внутримолекулярная связь включают дисульфидную, лактамную или тиоэфирную связь; и Z обозначает амино, алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси; и при условии, что когда А₁ обозначает Lys, B₁ обозначает Ala, C ₁ обозначает Val, D₁ обозначает Arg, E₁ обозначает Ser, F₁ обозначает Ser, G₁ обозначает Asn, H ₁ обозначает Leu, I₁ обозначает Pro, J₁ обозначает Val, и K₁ обозначает Asn, то один или более из A₁ -K₁ обозначает D-аминокислоту, и Z выбирают из группы, состоящей из алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси.

4. Применение композиции, включающей агонист амилина, для изготовления лекарственного средства для лечения ожирения, при условии, что композиция не включает холецистокинин или агонист холецистокинина, причем агонист амилина имеет следующую аминокислотную последовательность:

¹A ₁-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr- ¹⁰Gln-Arg-Leu-

B₁-Asn- ¹⁵Phe-Leu-C₁-D₁ -E₁-²⁰F ₁-G₁-Asn-H₁ -Gly-²⁵Pro-I₁-

Leu-Pro-Pro-³⁰Thr-J₁ -Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z,

где А₁ обозначает Lys, Ala, Ser или водород;

B₁ обозначает Ala, Ser или Thr;

C₁ обозначает Val, Leu или Ile;

D ₁ обозначает His или Arg;

E₁ обозначает Ser или Thr;

F₁ обозначает Ser, Thr, Gln или Asn;

G₁ обозначает Asn, Gln или His;

H₁ обозначает Phe, Leu или Tyr;

I₁ обозначает Ile, Val, Ala или Leu;

J₁ обозначает Asn, Asp, или Gln;

X и Y независимо представляют собой выбранные остатки, имеющие боковые цепи, которые химически связаны друг с другом с образованием внутримолекулярной связи, при этом указанная внутримолекулярная связь включает дисульфидную связь, лактамную или тиоэфирную связь; и Z обозначает амино, алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси; и при условии, что когда А₁ обозначает Lys, B₁ обозначает Ala, C ₁ обозначает Val, D₁ обозначает Arg, Е₁ обозначает Ser, F₁ обозначает Ser, G₁ обозначает Asn, H ₁ обозначает Leu, I₁ обозначает Val, и J₁ обозначает Asn, то один или более из A₁-J₁ обозначает D-аминокислоту, и Z выбирают из группы, состоящей из алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси.

5. Способ лечения ожирения у человека, включающий введение указанному субъекту количество композиции, включающей агонист амилина, эффективное для лечения ожирения при условии, что композиция не включает холецистокинин или агонист холецистокинина, при этом агонист амилина представляет собой ^25,28,29Pro-h-амилин.

6. Способ по п.5, в котором агонист амилина вводят в количестве от примерно 0,01 мг до примерно 5 мг в день.

7. Способ по любому из пп.5 и 6, в котором агонист амилина вводят от 1 до 4 раз в день.

8. Способ по любому из пп.5-7, в котором агонист амилина вводят в количестве от 2,5 мкг до примерно 5 мг на дозу.

9. Способ по любому из пп.5-8, в котором агонист амилина вводят в количестве от 10 мкг до примерно 1,25 мг на дозу.

10. Способ по любому из пп.5-9, в котором агонист амилина вводят в количестве от 30 до примерно 300 мкг на дозу.

11. Способ по любому из пп.5-10, в котором человек имеет индекс массы тела по меньшей мере 27,0 кг/м².

Описание изобретения к патенту

Настоящая заявка является заявкой в частичное продолжение патентной заявки США №08/870762, поданной 6 июня 1997 г., содержание которой полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам лечения ожирения. Более конкретно, изобретение относится к использованию амилина или агониста амилина при лечении ожирения.

Предпосылки создания изобретения

Амилин

В настоящее время имеются обзоры, посвященные структуре и биологическому действию амилина. (См., например. Rink et al., Trends in Pharmaceutical Sciences, 14:113-118 (1993); Gaeta and Rink, Med. Chem. Res., 3:483-490 (1994); and Pittner et al., J. Cell Biochem; 553:19-28 (1994)). Амилин представляет собой гормон белковой природы, состоящий из 37 аминокислот. Он был выделен, очищен и охарактеризован как основной компонент амилоидных отложений в панкреатических островках умерших людей с диабетом II типа (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8628-8632 (1987)). Молекула амилина имеет две важных посттрансляционные модификации: С-конец ее амидирован (например, 37-й аминокислотный остаток представлен тирозинамидом), и цистеины в положении 2 и 7 сшиты поперечными связями с образованием N-концевой петли (через цистиновый остаток). Последовательность в открытой рамке считывания гена человеческого амилина демонстрирует наличие сигнала для протеолитического расщепления в области сайта двухосновных аминокислот Lys-Arg, расположенного перед N-концевым кодоном для Lys, и при Gly, расположенным перед Lys-Arg протеолитическим сигналом в С-концевом положении, что характерно для последовательности, распознаваемой протеинамидазным ферментом ПАМ (РАМ)) (Cooper et al., Biochem. Biophys. Acta, 1014:247-258 (1989)). Амилин описан и заявлен в патенте США №5367052, выданном 22 ноября 1994 г.

Было показано, что при диабете I типа имеется дефицит амилина, в связи с чем было предложено перейти на комбинированное лечение, включающее инсулин, как предпочтительный способ лечения всех форм диабета в сравнении с применением только одного инсулина. Использование амилина и других амилиновых агонистов при лечении сахарного диабета является объектом изобретения в патенте США №5175145, выданном 29 декабря 1992 г. Фармацевтические композиции, содержащие амилин и амилин плюс инсулин, описаны и заявлены в патенте США №5124314, выданном 23 июня 1992 г.

Отмечалось, что действие амилина при его избытке имитирует ключевые признаки диабета II типа, и поэтому блокада амилина была предложена в качестве новой терапевтической стратегии. В патенте США №5266561, выданном 30 ноября 1993 года, раскрывается, что амилин вызывает снижение как базового, так и инсулинстимулированного включения меченой глюкозы в гликоген скелетной мышцы. Последний эффект был раскрыт также в контексте пептида, связанного с геном кальцитонина (КГСП (CGRP)) (см. также Leighton and Cooper, Nature, 335:632-635 (1988)). Имеются также данные о том, что амилин снижает инсулинстимулированное поступление глюкозы в скелетную мышцу и снижает содержание гликогена (Young et al., Amer. J. Physiol., 259:45746-1 (1990)). Раскрывается также лечение диабета II типа и инсулин-резистентности амилиновыми агонистами.

Последовательность амилина примерно на 50% гомологична последовательности КГСП, белков, состоящих также из 37 аминокислот, которые, будучи широко распространены в качестве нейротрансмиттеров, характеризуются многообразной мощной биологической активностью, включая вазодилатацию. Амилин и КГСП имеют ²Cys-⁷Cys дисульфидный мостик и С-концевой остаток в виде амида аминокислоты, оба из которых важны для проявления полной биологической активности (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 857763-7766 (1988)). Как сообщалось, амилин, может быть одним из членов семейства родственных пептидов, включающих КГСП, инсулин, инсулинподобные ростовые факторы и релаксины, и которые характеризуются общими генетическими корнями (Cooper et al., Prog. Growth Factor Research, 1:99-105 (1989)).

Амилин синтезируется в основном в панкреатических бета - клетках и затем секретируется в ответ на пищевые раздражители, такие как глюкоза и аргинин. Исследования на линиях клонированных опухолевых бета-клеток (Moore et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 179 (1) (1991)) показали, что пищевые средства, усиливающие секрецию, такие как глюкоза и аргинин, стимулируют высвобождение амилина и инсулина. Коэффициент молярного отношения амилин:инсулин в секретируемых белках варьирует в препаратах от примерно 0,01 до 0,4, но, по всей видимости, не варьирует в значительной мере в ответ на острые стимулы в пределах любого одного препарата. Однако, в ходе продолжительной стимуляции повышенными уровнями глюкозы коэффициент отношения амилин:инсулин может прогрессивно возрастать (Gedulin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 180(1), 782-789 (1991)). Таким образом, амилин и инсулин не всегда секретируются с постоянной скоростью.

Было показано, что некоторые действия амилина имеют сходство с некоторыми неметаболическими функциями КГСП и кальцитонина; однако метаболические функции амилина, обнаруженные в процессе изучения указанного нового идентифицированного белка, по всей видимости, отражают его преимущественную биологическую роль. При этом, по меньшей мере, некоторые из этих метаболических функций имитируются КГСП, хотя и в дозах, которые обладают выраженным вазодилатационным эффектом (см. также Leighton et al., Nature, 335:632-635 (1988)); Molina et al., Diabetes, 39:260-265 (1990)).

Первым обнаруженным действием амилина было снижение стимулируемого инсулином включения глюкозы в гликоген скелетной мышцы крысы (Leighton et al., Nature, 335:632-635 (1988)), при этом мышца становится "инсулинрезистентной".

Последующая работа с камбаловидной мышцей крысы ex-vivo и in vitro указывает на то, что амилин снижает гликогенсинтазную активность, ускоряет превращение гликогенфосфорилазы из неактивной b формы в активную а форму, способствует итоговой потере гликогена (в присутствии или в отсутствие инсулина), повышает уровень глюкоза-6-фосфатазы и может повышать общий выход лактазы (см., например, Deems et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181 (I):116-120 (1991); Young et al., FEBS Letts, 281 (1,2):149-151 (1991)). Амилин, по всей видимости, не влияет на транспорт глюкозы per se (см., например, Pittner et al., FEBS Letts, 365 (I):98-100 (1995)). Изучение зависимости доза-ответ на амилине и инсулине показывает, что амилин действует в скелетной мышце как неконкурентный или функциональный антагонист инсулина (Young et al., Am. J. Physiol, 263 (2):Е274-Е281 (1992)). Нет доказательств того, что амилин препятствует связыванию инсулина с его рецепторами или последующей активации инсулинового рецептора тирозинкиназой (Follet et al., Clinical Research. 39 (1):39А (1991); Koopmans et al., Diabetologia, 34:218-224 (1991)).

Считается, что амилин действует с вовлечением рецепторов, имеющихся на плазменных мембранах. Изучение амилина и КГСП, а также влияния селективных антагонистов позволяет предположить, что амилин действует через свой собственный рецептор (Beaumont et al., Br. J. Pharmacol, 115 (5):713-715 (1995); Wang et al., FEBS Letts., 219; 195-198 (1991b)), что не совпадает с выводом других исследователей о том, что амилин может действовать в основном на рецепторах КГСП (например, Chantry et al., Biochem. J., 277:139-143 (1991); Galeazza et al., Peptides, 12:585-591 (1991); Zhu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 177 (2):771-776 (1991)). Рецепторы амилина и их использование в методах скрининга и тестирования соединений - агонистов и антагонистов амилина - описаны в Патенте США №5264372, выданном 23 ноября 1993 г.

Хотя известно, что амилин проявляет выраженное воздействие на энергетический метаболизм в печени in vivo, отсутствует общее согласие по вопросу о том, как он действует в изолированных гепатоцитах или перфузированной печени. Имеющиеся данные не поддерживают представление о том, что амилин способствует гликогенолизу в печени, иными словами, он не действует подобно глюкагону (например, Stephens et al., Diabetes, 40:395-400 (1991)); Gomez-Foix et al., Biochem. J., 276:607-610 (1991)). Было высказано предположение о том, что амилин может воздействовать на печень, способствуя превращению лактата в гликоген и повышая количество глюкозы, способной высвободиться под действием глюкагона (см. Roden et al., Diabetologia, 35:116-120 (1992)). Таким образом, амилин может действовать в печени как анаболический партнер инсулина, в отличие от механизма его функционирования в мышце, носящем катаболический характер.

В жировых клетках действие амилина, в отличие от мышц, не сказывается заметным образом на инсулин-стимулированном поглощении глюкозы, включении глюкозы в триглицерид, образовании CO₂ (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:7763-7766 (1988)), стимулируемом эпинефрином липолизе или ингибировании липолиза инсулином (Lupien and Young, "Diabetes Nutrition and Metabolism - Clinical and Experimental", Vol.6(1), pages 1318 (February 1993)). Амилин, таким образом, проявляет тканеспецифические действия, при этом отмечается прямое воздействие его на скелетную мышцу, выраженное опосредованное воздействие (через снабжение субстратом) и, возможно, прямое воздействие на печень, тогда как адипоциты остаются, по всей видимости, слепыми к наличию или отсутствию амилина.

Имеются данные о том, что амилин может проявлять выраженный эффект на секрецию инсулина. Эксперименты на интактных крысах (Young et al., Mol. Cell. Endocrinol., 84:R1-R5 (1992)) указывают на то, что амилин ингибирует секрецию инсулина. Другие исследователи, однако, не смогли обнаружить эффект амилина на изолированных (3-клетках, на изолированных панкреатических островках или на уровне целого животного (см. Broderick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 177:932-938 (1991)).

Амилин или агонисты амилина оказывают мощное ингибирующее воздействие на опустошение желудка у крыс (Young et al., Diabetologia 38 (6): 642-648 (1995)), у собак (Brown et al., Diabetes 43 (Suppl 1): 172A (1994)) и у людей (Macdonald et al., Diabetologia 38 (Suppl 1):A32 (abstract 118) (1995)). По имеющимся сообщениям, опустошение желудка ускоряется у амилиндефицитных ВВ крыс с диабетом I типа (Young et al., Diabetologia, supra; Nowak et al., J. Lab. Clin. Med., 123 (1):110-6 (1994)) и у крыс, принимавших селективный антагонист амилина AC 187 (Gedulin et al., Diabetologia, 38(Suppl 1):A244 (1995)). Действие амилина на опустошение желудка является, скорее всего, физиологическим (оперативным на уровне нормально циркулирующих концентраций).

Неметаболическое действие амилина включает вазодилататорный эффект, который может быть опосредован взаимодействием с сосудистыми рецепторами КГСП. Имеющиеся данные тестирования in vivo позволяют предположить, что амилин является в 100-1000 раз менее мощным вазодилататором, чем КГСП (Brain et al., Eur. J. Pharmacol., 183:2221 (1990); Wang et al., FEBS Letts., 291:195-198 (1991)). В литературе имеется публикация, касающаяся действия амилина на регионарную гемодинамику, включая почечный кровоток, у находящихся в сознании крыс (Gardiner et al., Diabetes, 40:948-951 (1991)). Указанные авторы отмечают, что инфузия крысиного амилина сопровождается более выраженной дилатацией почечных сосудов и меньшей мезентериальной вазоконстрикцией, чем при введении человеческого -КГСП. В этом контексте указанные авторы полагают, что в свете усиления почечной гиперемии в большей степени, чем это делает -КГСП, крысиный амилин может вызывать менее выраженную стимуляцию системы ренин-ангиотензин и, в этой связи, меньшую степень вторичной ангиотензин-11-опосредованной вазоконстрикции. Однако, они также отмечают, что в ходе совместной инфузии человеческого -^8-37-КГСП и крысиного амилина не имеет места маскирование ренальной и мезентериальной вазоконстрикции, что определяется в основном несбалансированным вазоконстрикторным эффектом ангиотензина II, и отмечают, что обнаруженный эффект аналогичен тому, что наблюдалось при совместной инфузии человеческого -КГСП и человеческого -^8-37-КГСП (id. at 951).

Было показано, что амилин оказывает воздействие и на изолированные остеокласты, которые он приводит к переходу в состояние покоящихся клеток, и in vivo, где, как было обнаружено, он снижает плазменный уровень кальция, примерно на 20% у крыс, а также у кроликов и у людей с болезнью Педжета (см., например, Zaidi et al., Trends in Endocrinol. and Metab., 4:255-259 (1993)). На основании доступных данных можно предположить, что амилин представляет собой в 10-30 раз менее мощное средство, чем кальцитонин, оказывающий такое же действие. Были приведены интересные данные о том, что амилин, по всей видимости, повышает образование цАМФ остеокластами, но не повышает уровень Са²⁺ в цитозоле, тогда как кальцитонин осуществляет все эти эффекты (Alam et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 179 (I):134-139 (1991)). Было сделано предположение, хотя это еще не установлено, что кальцитонин может действовать через рецепторы двух типов, а амилин может взаимодействовать с одним из них.

Неожиданно, в свете полученных ранее данных о дилатации почечных сосудов и ряда других свойств, было обнаружено, что амилин при его подкожном введении заметно повышает активность ренина в плазме интактных крыс, причем по механизму, который не оказывает воздействия на давление крови. Последний аспект важен, поскольку снижение давления является мощным стимулом для высвобождения ренина. Антагонисты амилина, такие как антагонисты рецептора амилина, включающие те из них, которые являются селективными относительно рецепторов КГСП и/или кальцитонина, могут использоваться для блокирования амилин-провоцированного повышения активности ренина в плазме. Использование антагонистов амилина для лечения расстройств, связанных с ренином, описаны и заявлены в патенте США №5376638, выданном 27 декабря 1994 г.

Было показано, что у нормальных людей уровень амилина при голодании составляет от 1 до 10 пМ, а после приема пищи или после введения глюкозы он колеблется от 5 до 20 пМ (например, Koda et al., The Lancet, 339:1179-1180 (1992)). При ожирении у инсулин-резистентных индивидуумов уровень амилина после приема пищи может подняться до более высоких значений, достигая примерно 50 пМ. Целям сравнения могут служить следующие данные по уровню инсулина у здоровых людей при голодании и после приема пищи, которые составляют от 20 до 50 пМ и от 100 до 300 пМ соответственно, при этом они могут достичь в 3-4 раза более высоких значений у инсулинрезистентных людей. При диабете I типа, для которого характерно разрушение бета - клеток, содержание амилина находится на уровне или ниже обнаруживаемого количества и не растет в ответ на введение глюкозы (Koda et al., The Lancet, 339:1179-1180 (1992)). У нормальных мышей и крыс, как было показано, базальный уровень составляет от 30 до 100 пМ, тогда как у некоторых инсулин-резистентных диабетических штаммов грызунов этот показатель может достичь значения 600 пМ (например, Huang et al., Hypertension, 19:1-101-1-109 (1991)).

Показано, что при инъецировании в мозг или при периферальном введении амилин подавляет всасывание пищи (например, Chance et al.. Brain Res., 539:352-354 (1991)) and Chance et al., Brain Res., 607:185-188 (1993)), оказывая воздействие, которое сближает его с КГСП и кальцитонином. Эффективные концентрации в клетках, которые опосредуют указанное действие, не известны. Использование амилина и агонистов амилина для лечения анорексии описано и заявлено в патенте США №5656590, выданном 12 августа 1997 г. Композиции, включающие агонист холецистокинина и агонист амилина или гибридную молекулу, для использования с целью снижения всасывания пищи или контроля аппетита или веса тела раскрыты и заявлены в патенте США №5739106, выданном 14 апреля 1998 г.

Ожирение

Ожирение представляет собой хроническое заболевание, широко распространенное в современном обществе, последствия которого имеют отношение не только к социальным бедам, но также к снижению продолжительности жизни и многочисленным медицинским проблемам, включая также неблагоприятное психологическое развитие, репродуктивные нарушения, такие как полицистоз яичника, дерматологические заболевания, такие как инфекции, варикозное расширение вен, акантоз (acanthosis nigricans) и экзема, а также затрудненную двигательную активность, сахарный диабет, инсулин-резистентность, гипертензию, гиперхолестеринемию, холелитиаз, остеоартрит, ортопедические нарушения, тромбоэмболическую болезнь, рак и коронарную болезнь сердца (Rissanen et al., British Medical Journal, 301:835-837 (1990)).

Ожирение, и в особенности ожирение верхней части тела, представляет собой распространенную и весьма серьезную проблему здравоохранения Соединенных Штатов и во всем мире. В соответствии с последними статистическими данными, более 25% населения США и 27% населения Канады имеют избыточный вес (Kuczmarski, Amer. J. of Clin. Nut. 55:4953-5023 (1992); Reeder et al., Can. Med. Ass. J., 23:226-233 (1992)). Ожирение верхней части тела является сильнейшим фактором риска развития сахарного диабета II типа, а также серьезным фактором развития сердечно-сосудистых заболеваний и рака. Последние оценки стоимости медицинских убытков, связанных с ожирением, составляют во всем мире 150000000000 дол. США. Проблема становится настолько серьезной, что хирурги общей практики выступили с инициативой бороться с безудержным ростом тучности в американском обществе.

В значительной мере индуцированную ожирением патологию можно рассматривать в тесной связи с дислипидемией, гипертензией и инсулин-резистентностью. Во многих исследованиях было показано, что снижение степени ожирения при применении диеты и физической тренировки резко ослабляет указанные факторы риска. Но, к сожалению, такие способы лечения зачастую не приводят к успеху, при этом процент неудач достигает 95%. Эту ситуацию можно объяснить тем, что рассматриваемое состояние тесно связано с генетически наследуемыми факторами, которые способствуют повышению аппетита, предпочтению высококалорийной пищи, сниженной физической активности и повышенному липогенному метаболизму. Это указывает на то, что люди, унаследовавшие такие генетические черты, будут проявлять склонность к ожирению, независимо от их усилий по борьбе с таким состоянием. В этой связи имеется необходимость в разработке нового фармакологического средства, которое было бы способно корректировать указанный недостаток и давало в руки возможность успешно лечить тучных пациентов, независимо от их наследственного отягощения.

Существующие способы лечения ожирения включают стандартные диеты и физические упражнения, очень низкокалорийные диеты, поведенческую терапию, фармакотерапию, включающую средства, подавляющие аппетит, термогенные средства, ингибиторы всасывания пищи, механические устройства, такие как фиксация челюсти, стягивание талии и хирургическое вмешательство (Jung and Chong, Clinical Endocrinology, 35:11-20 (1991); Bray, Am. J. Clin. Nutr., 55:538S-544S (1992)). Имеется сообщение об эффективности снижения веса тела у подростков при использовании модифицированного способа голодания на фоне приема небольшого количества белка (Lee et al., Clin. Pediatr., 31:234-236 (April 1992)). Ограничение количества калорий как средство лечения ожирения вызывает катаболизм запасных белков организма и приводит к отрицательному азотному балансу. В этой связи получили популярность диеты с добавками белка, как средств, способствующих потере азота при ограничении поступления калорий в организм. Поскольку такие диеты приводят лишь к умеренному воздействию на азотный метаболизм, имеется потребность в более эффективном способе сохранения нужной тенденции изменения веса тела и запасов белка в организме. Кроме того, в целях усовершенствования лечения ожирения, желательно, чтобы такой режим приводил также к ускоренному снижению уровня жиров в организме. Различные подходы к решению этой проблемы описаны в работе Вайнтрауба и Брея (Weintraub and Bray, Med. Clinics N. Amer., 73:237 (1989)); Bray, Nutrition Reviews, 49:33 (1991)).

В свете высокого процента в нашем обществе и в контексте тех серьезных обсуждавшихся выше последствий, которые связаны с проблемой ожирения, следует ожидать, что любое терапевтическое средство, потенциально способное при его использовании снижать вес тела, будет иметь выраженный эффект на здоровье таких людей. Имеется потребность в таком лекарственном средстве, которое будет снижать общий вес тела тучных людей в направлении идеального для них веса и будет способствовать поддержанию такого сниженного уровня.

Краткое описание сущности изобретения

Авторами было обнаружено, что амилин и агонисты амилина, например аналог агониста амилин - ^25,28,29Pro-h-амилин (обозначаемый так же, как "прамлинтад" и описанный ранее как "АС-0137"), могут быть использованы для лечения ожирения у людей.

Настоящее изобретение относится к новым способам лечения или профилактики ожирения у людей, включающим введение амилина или агониста амилина, например аналога агониста амилина - ^25,25,29Pro-h-амилина. Амилин или агонист амилина могут быть введены сами по себе или в сочетании с другим средством снижения ожирения. В одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения ожирения у человека, включающему введение указанному субъекту эффективного количества амилина или такого же количества агониста амилина. Под термином "лечение" подразумевается ведение и уход за пациентом с целью борьбы с заболеванием, состоянием или расстройством, и он включает введение амилина или агониста амилина для предупреждения появления симптомов или осложнений, для облегчения симптомов или осложнений или для устранения болезненного состояния или расстройства. Лечение ожирения в этой связи включает ингибирование прибавления веса и индукцию снижения веса у пациентов при наличии такой необходимости. Кроме того, лечение ожирения в контексте настоящего описания включает регулирование веса с косметической целью у людей, что означает регулирование веса для улучшения внешнего вида человека.

Термин "амилин" в контексте настоящего описания включает соединения, такие как определены в патенте США №5234906, выданном 10 августа 1993 года под названием "Гипергликемические композиции", общее содержание которого приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Так, например, он содержит описание пептидного гормона человека, обозначаемого как амилин, который секретируется бета-клетками поджелудочной железы и различных его видов. "Агонист амилина" представляет собой термин, известный в технике, который относится к соединению, имитирующему действие амилина. Агонист амилина может быть соединением пептидным или не пептидным и включает аналоги агониста амилина.

Термин "аналог агониста амилина" относится к производным амилина, которые действуют как агонисты амилина, при этом они обычно, как в настоящее время считается, действуют посредством связывания или с помощью другого непосредственного или опосредованного взаимодействия с амилиновым рецептором или другим рецептором, или рецепторами, с которыми сам амилин может взаимодействовать с проявлением биологической реакции. Полезные аналоги агониста амилина включают те из них, которые были идентифицированы в международной заявке WPI Acc. №93-182488/22, озаглавленной "New Amylin Agonist Peptides Used for Treatment and Prevention of Hypoglycemia and Diabetes Mellitus" ("Новые пептидные агонисты амилина, используемые для лечения и профилактики гипогликемии и сахарного диабета"), общее содержание которой также включено в настоящее описание в качестве ссылки.

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения агонист амилина представляет собой аналог агониста амилина, предпочтительно, ^25,25,29Pro-h-амилин. ^25,25,29Pro-h-амилин и другие аналоги агониста амилина описаны и заявлены в Патенте США №5686411, выданном 11 ноября 1997 года, общее содержание которого также включено в настоящее описание в качестве ссылки.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к новым методам снижения индуцированного инсулином прибавления веса у людей, принимающих инсулин, включающим введение терапевтически эффективного количества амилина или агониста амилина. В одном варианте реализации изобретения указанный субъект имеет сахарный диабет, например сахарный диабет I типа или II типа. В предпочтительном варианте реализации изобретения агонист амилина представляет собой ^25,28,29Pro-h-амилин.

Подробное описание изобретения

В исследовании, описанном в Примере 1, было показано, что введение агониста амилина ^25,28,29Pro-h-амилина (прамлинтида) больным диабетом, применяющим инсулин (II типа), приводит к снижению веса тела через 4 недели и достигает статистической значимости в двух группах дозирования, а именно принимающих 60 мкг трижды в день и 60 мкг четыре раза в день. В исследовании, описанном в Примере 2, показано, что введение прамлинтида (30 мкг или 60 мкг четыре раза в день) при диабете I типа приводит к статистически значимому снижению веса тела, в сравнении с группой приема плацебо, к моменту 13, 26 и 52 недели. В исследовании, описанном в Примере 3, показано, что введение прамлинтида (30, 75 или 150 мкг три раза в день) пациентам с диабетом II типа, которые нуждаются в инсулине, приводит к статистически значимому снижению веса тела, в сравнении с группой приема плацебо, к моменту 13, 26 и 52 недели. Указанные результаты резко контрастируют с данными по лечению одним инсулином у пациентов с диабетом I типа или II типа, которое обычно связано с прибавлением веса.

Аналоги агониста амилина, используемые в настоящем изобретении, включают аналоги агониста амилина, описанные и заявленные в вышеуказанном Патенте США №5686411. Агонисты амилина включают следующие аналоги агониста амилина:

1. Аналог агониста амилина, имеющий аминокислотную последовательность;

¹A ₁-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr- ¹⁰Gln-Arg-Leu-

B₁-Asn- ¹⁵Phe-Leu-C₁-D₁ -E₁-²⁰F ₁-G₁-Asn-H₁ -Gly-²⁵Pro-I₁-

Leu-Pro-J₁-³⁰Thr-K ₁-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z,

где

A₁ обозначает Lys, Ala, Ser или водород;

B₁ обозначает Ala, Ser или Thr;

C₁ обозначает Val, Leu или Ile;

D₁ обозначает His или Arg;

E₁ обозначает Ser или Thr;

F ₁ обозначает Ser, Thr, Gln или Asn;

G ₁ обозначает Asn, Gln или His;

H₁ обозначает Phe, Leu или Tyr;

I₁ обозначает Ile, Val, Ala или Leu;

J₁ обозначает Ser, Pro или Thr;

K₁ обозначает Asn, Asp или Gln;

X и Y выбирают независимо из остатков, имеющих боковые цепи, химически связанные друг с другом с образованием внутримолекулярной связи, при этом указанные внутримолекулярные связи включают дисульфидную, лактамную или тиоэфирную связь; и Z обозначает амино, алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси; при условии, что когда A₁ обозначает Lys, B₁ обозначает Ala, C ₁ обозначает Val, D₁ обозначает Arg, E₁ обозначает Ser, F₁ обозначает Ser, G₁ обозначает Asn, H ₁ обозначает Leu, I₁ обозначает Val, J₁ обозначает Pro, и K₁ обозначает Asn, то один или более из A₁ -K₁ обозначает D-аминокислоту, и Z выбирают из группы, состоящей из алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси.

2. Аналог агониста амилина, имеющий аминокислотную последовательность:

¹A₁-X-Asn-Thr- ⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-

B₁-Asn-¹⁵Phe-Leu-C ₁-D₁-E₁- ²⁰F₁-G₁-Asn-H ₁-Gly-²⁵Pro-I₁ -

Leu-J₁-Pro-³⁰ Thr-K₁-Val-Gly-Ser-³⁵ Asn-Thr-Tyr-Z,

где

A₁ обозначает Lys, Ala, Ser или водород;

B₁ обозначает Ala, Ser или Thr;

C₁ обозначает Val, Leu или Ile;

D₁ обозначает His или Arg;

E₁ обозначает Ser или Thr;

F₁ обозначает Ser, Thr, Gln или Asn;

G₁ обозначает Asn, Gln или His;

H₁ обозначает Phe, Leu или Tyr;

I ₁ обозначает Ile, Val, Ala или Leu;

J ₁ обозначает Ser, Pro, Leu, Ile или Thr;

K ₁ обозначает Asn, Asp или Gln;

X и Y выбирают независимо из остатков, имеющих боковые цепи, химически связанные друг с другом с образованием внутримолекулярной связи, при этом указанная внутримолекулярная связь включает дисульфидную, лактамную или тиоэфирную связь; и Z обозначает амино, алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси; и при условии, что когда

(a) A ₁ обозначает Lys, B₁ обозначает Ala, C₁ обозначает Val,

D ₁ обозначает Arg, E₁ обозначает Ser, F₁ обозначает Ser,

G ₁ обозначает Asn, H₁ обозначает Leu, I₁ обозначает Val,

J ₁ обозначает Pro, и K₁ обозначает Asn, или

(б) A₁ обозначает Lys, B ₁ обозначает Ala, C₁ обозначает Val,

D₁ обозначает His, E ₁ обозначает Ser, F₁ обозначает Asn,

G₁ обозначает Asn, H ₁ обозначает Leu, I₁ обозначает Val,

J₁ обозначает Ser, и K ₁ обозначает Asn;

то один или более из A ₁-K₁ обозначает D-аминокислоту, и Z выбирают из группы, состоящей из алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси.

3. Аналог агониста амилина, имеющий аминокислотную последовательность:

¹A ₁-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr- ¹⁰Gln-Arg-Leu-

B₁-Asn- ¹⁵Phe-Leu-C₁-D₁ -E₁-²⁰F ₁-G₁-Asn-H₁ -Gly-²⁵I₁-J ₁-

Leu-Pro-Pro-³⁰Thr-K ₁-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z,

где

A₁ обозначает Lys, Ala, Ser или водород;

B₁ обозначает Ala, Ser или Thr;

C₁ обозначает Val, Leu или Ile;

D₁ обозначает His или Arg;

E₁ обозначает Ser или Thr;

F ₁ обозначает Ser, Thr, Gln или Asn;

G ₁ обозначает Asn, Gln или His;

H₁ обозначает Phe, Leu или Tyr;

I₁ обозначает Ala или Pro;

J₁ обозначает Ile, Val, Ala или Leu;

K₁ обозначает Asn, Asp или Gln;

X и Y выбирают независимо из остатков, имеющих боковые цепи, химически связанные друг с другом с образованием внутримолекулярной связи, при этом указанная внутримолекулярная связь включают дисульфидную, лактамную или тиоэфирную связь; и Z обозначает амино, алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси; и при условии, что когда A₁ обозначает Lys, B₁ обозначает Ala, C ₁ обозначает Val, D₁ обозначает Arg, E₁ обозначает Ser, F₁ обозначает Ser, G₁ обозначает Asn, H ₁ обозначает Leu, I₁ обозначает Pro, J₁ обозначает Val, и K₁ обозначает Asn, то один или более из A₁ -K₁ обозначает D-аминокислоту, и Z выбирают из группы, состоящей из алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси.

4. Аналог агониста амилина, имеющий аминокислотную последовательность:

¹A₁-X-Asn-Thr- ⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-

B₁-Asn-¹⁵Phe-Leu-C ₁-D₁-E₁- ²⁰F₁-G₁-Asn-H ₁-Gly-²⁵Pro-I₁ -

Leu-Pro-Pro-³⁰Thr-J ₁-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z,

где

A₁ обозначает Lys, Ala, Ser или водород;

B₁ обозначает Ala, Ser или Thr;

C₁ обозначает Val, Leu или Ile;

D₁ обозначает His или Arg;

E₁ обозначает Ser или Thr;

F ₁ обозначает Ser, Thr, Gln или Asn;

G ₁ обозначает Asn, Gin или His;

H₁ обозначает Phe, Leu или Tyr;

I₁ обозначает Ile, Val, Ala или Leu;

J₁ обозначает Asn, Asp, или Gln;

X и Y представляют собой независимо выбранные остатки, имеющие боковые цепи, которые химически связаны друг с другом с образованием внутримолекулярной связи, при этом указанная внутримолекулярная связь включает дисульфидную связь, лактамную или тиоэфирную связь; и Z обозначает амино, алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси; и при условии, что когда A₁ обозначает Lys, B₁ обозначает Ala, C₁ обозначает Val, D ₁ обозначает Arg, Ei обозначает Ser, F₁ обозначает Ser, G₁ обозначает Asn, H ₁ обозначает Leu, I₁ обозначает Val, и J₁ обозначает Asn, то один или более из A₁-K₁ обозначает D-аминокислоту, и Z выбирают из группы, состоящей из алкиламино, диалкиламино, циклоалкиламино, ариламино, аралкиламино, алкилокси, арилокси или аралкилокси.

Предпочтительные аналоги агониста амилина включают:

^25,28,29Pro-h-амилин, ¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-амилин и ¹⁸Arg^25,28,Pro-h-амилин.

Активность соединений в качестве агонистов амилина может быть подтверждена и количественно определена при проведении различных скрининговых тестов, которые включают тест по связыванию с рецептором прилегающего ядра, описанный ниже в Примере 1, с последующим тестом на камбаловидной мышце, описанном далее в Примере 8, тест по опустошению желудка, описанный в Примере 9 или 10, или тест, основанный на способности индуцировать гипокальциемию или снижать у млекопитающих возникающую после приема пищи гипергликемию, как приведено в настоящем описании.

Тест по связыванию с рецептором или конкурентный тест, который определяет способность соединения специфически связываться с мембранно-связанными рецепторами амилина, описан и заявлен в Патенте США №5264372, выданном 23 ноября 1993 года, полное раскрытие которого включено в настоящее описание в качестве ссылки. Тест по связыванию с рецептором приведен также в настоящем описании, далее в Примере 7. Предпочтительным источником для получения мембранных препаратов, используемых в тесте, является базальное вещество переднего мозга, которое включает мембраны из прилегающих ядер и окружающих регионов. Тестируемые соединения конкурируют за связывание с указанными рецепторными препаратами с ¹²⁵I амилином крысы (Bolton Hunter). Конкурентные кривые, в которых количество связанного (В) соединения наносится на график как функция log концентрации лиганда, далее подвергают компьютерному анализу нелинейной регрессии в 4-параметровом логистическом уравнении (программа Inplot; Graph-PAD Software, San Diego, California) или программы ALLFIT of DeLean et. al. (ALLFIT, Version 2.7 (NIH, Bethesda, MD 20892)). Munson and Rodbard, Anal. Biochem. 107:220-239 (1980).

Тест на биологическую активность агонистов амилина в камбаловидной мышце может быть проведен с использованием описанных ранее методов (Leighton, В. and Cooper, Nature, 335:632-635 (1988); Cooper, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7763-7766 (1988)), в которых активность агониста амилина оценивают по измерению ингибирования инсулин-стимулируемого синтеза гликогена. Тест на камбаловидной мышце описан также в Примере 8 ниже.

Методы измерения скорости опустошения желудка описаны, например, в работе Янга с соавторами (Young et. al., Diabetologia, 38 (6). 642-648 (1995)). В рамках метода с использованием фенолового красного, который описан далее в Примере 9, находящиеся в сознании крысы получают через зонд неокрашенный гель, содержащий метилцеллюлозу и феноловый красный индикатор. Через двадцать минут после введения зонда животных анестезируют с использованием галотана, обнажают желудок и, зафиксировав его на пилорическом сфинктере и сфинктере нижнего пищевода, вынимают и опустошают в щелочной раствор. Содержимое кишечника может быть оценено по интенсивности окраски фенолового красного в щелочном растворе, которую измеряют по поглощению при длине волны 560 нМ. По методу, включающему использование тритированной глюкозы, который описан ниже в Примере 10, находящимся в сознании крысам вводят зондом тритированную глюкозу в воде. Крыс осторожно придерживают за хвост, кончик которого анестезируют с помощью лидокаина. Для определения уровня трития в плазме ее, отделяя от хвостовой крови, отбирают в различные временные точки и анализируют на бета-счетчике. Исследуемые соединения обычно вводят за одну минуту до зондирования.

Действие амилина или агонистов амилина на вес тела может быть идентифицировано, оценено или отслежено при использовании методов, описанных ниже в Примерах 1-3, или с помощью других известных в технике эквивалентных методов для определения воздействия соединения на вес тела. Предпочтительные соединения агонистов амилина проявляют активность в тесте по связыванию с рецептором, на порядок меньшую, чем примерно 1-5 нМ, предпочтительно меньше, чем примерно 1 нМ, и более предпочтительно меньше, чем примерно 50 пМ. В тесте с камбаловидной мышцей предпочтительные соединения агониста амилина демонстрируют значение ЭК ₅₀ на порядок меньше, чем примерно 1-10 микромолей. В тесте по опустошению желудка предпочтительные соединения агониста демонстрируют значения ЭК₅₀ на порядок меньше, чем 100 мкг/крысу.

Амилин и пептидные агонисты амилина могут быть получены с помощью стандартной техники твердофазного пептидного синтеза и предпочтительно с использованием автоматизированного или полуавтоматизированного устройства для синтеза пептидов. В типичном случае, с использованием указанной техники -N-карбамоил-защищенную аминокислоту и аминокислоту, прикрепленную к растущей пептидной цепи на смоле, связывают при комнатной температуре в инертном растворителе, таком как диметилформамид, N-метилпирролидинон или метиленхлорид, в присутствии связывающих агентов, таких как дициклогексилкарбодиимид и 1-гидроксибензотриазол, в присутствии основания, такого как диизопропилэтиламин. -2N-карбамоил-защищающую группу удаляют от полученного продукта пептид-смола с использованием реагента, такого как трифторуксусная кислота или пиперидин, и реакцию связывания повторяют со следующей желательной N-защищенной аминокислотой, добавляемой к пептидной цепи. Подходящие N-защищенные группы хорошо известны в технике, при этом в настоящем изобретении предпочтительными являются т-бутилоксикарбонил (тБок) и флуоренилметоксикарбонил (Фмок), при этом (Фмок) является предпочтительной.

Растворители, производные аминокислот и 4-метилбензогидриламинную смолу, используемые в устройстве для пептидного синтеза, получают от Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA). Используемые для синтеза аминокислоты с защищенной боковой цепью могут быть также получены от Applied Biosystems Inc.: Boc-Arg(Mts), Fmoc-Arg(Pmc), Boc-Thr(Bzl), Fmoc-Thr(t-Bu), Boc-Ser(Bzl), Fmoc-Ser(t-Bu), Boc-Tyr(BrZ), Fmoc-Tyr(t-Bu), Boc-Lys(Cl-Z), Fmoc-Lys(Boc), Boc-Glu(Bzl), Fmoc-Glu(t-Bu), Fmoc-His(Trt), Fmoc-Asn(Trt) и Fmoc-GIn(Trt). Boc-His(BOM) может быть получен от Applied Biosystems Inc. или Bachem Inc. (Torrance, CA). Анизол, метилсульфид, фенол, этандигиол и тиоанизол могут быть получены от Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI). Компания Air Products and Chemicals (Allentown, PA) поставляет HF. Этиловый эфир, уксусная кислота и метанол могут быть получены от Fisher Scientific (Pittsburgh, PA).

Твердофазный синтез пептидов может быть проведен в автоматическом пептидном синтезаторе (Model 430А, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) с использованием системы NMP/HOBt (Option 1) и химическую технологию на основе Tboc или Fmoc групп (см. Applied Biosystems User's Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, Version 1.3B July 1, 1988, section 6, pp.49-70, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) с защитным покрытием. Бок-пептид-смолы могут быть расщеплены с помощью HF (от -5°С до 0°С, 1 час). Пептид может быть выделен из смолы при чередовании экстракции водой и уксусной кислотой, и затем фильтраты лиофилизируют. Фмок-пептидные смолы могут быть расщеплены с использованием стандартных методов (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems Inc., 1990, pp.6-12). Пептиды могут быть также получены с использованием синтезатора Advanced Chem Tech Synthesizer (Model MPS 350, Louisville, Kentucky).

Пептиды могут быть очищены с помощью ВЭЖХ с обращением фаз (препаративной и аналитической) с использованием системы Waters Delta Prer 3000. Для выделения пептидов может быть использована препаративная колонка С 4, С 8 или С 18 (10 мкм, 2,2×25 см; Vydac, Hesperia, CA), и их чистота может быть определена с использованием аналитической колонки С4, С8 или С18 (5 мкм, 0,46×25 см; Vydac). Растворители (А=0,1% ТФУ/вода и В=0,1% ТФУ/СН₃CN) могут подаваться на аналитическую колонку со скоростью 1,0 мл/мин, и на препаративную колонку со скоростью 15 мл/мин. Аминокислотный анализ проводят на системе Waters Pico Tag и обрабатывают полученные данные с помощью программы Maxima. Пептиды могут быть гидролизованы при осуществлении кислотного гидролиза в паровой фазе (115°С, 20-24 часа). Гидролизаты могут быть преобразованы в соответствующие производные и далее проанализированы стандартными методами (Cohen et. al., The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, pp.11-52, Millipore Corporation, Milford, MA (1989)). Анализ по методу бомбардировки ускоренными атомами может быть проведен на M-Scan, Incorporated (West Chester, PA). Калибровка по массе может быть проведена с использованием йодида цезия или йодида цезия/глицерина. Анализ методом десорбционной ионизации в плазме на основании данных о времени полета может быть проведен на масс-спектрометре Applied Biosystems Bio-Ion 20.

Используемые по настоящему изобретению пептидные соединения могут быть также получены с помощью техники рекомбинантной ДНК, в рамках методов, известных в технике. (См., например, Sambrook et. al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor (1989)). Непептидные соединения, используемые в способе по настоящему изобретению, могут быть получены известными в технике методами.

Указанные выше соединения могут образовывать соли с различными неорганическими и органическими кислотами и основаниями. Такие соли включают соли, полученные при взаимодействии с органической и неорганической кислотами, например, HCl, HBr, H₂SO₄, Н ₃PO₄, а также трифторуксусной кислотой, уксусной кислотой, муравьиной кислотой, метансульфоновой кислотой, толуолсульфоновой кислотой, малеиновой кислотой, фумаровой кислотой и камфорсульфоновой кислотой. Соли, полученные с помощью оснований, включают соли аммония, соли щелочных металлов, например, соли натрия и калия, и соли щелочноземельных металлов, например, соли кальция и магния. Предпочтительными солями являются ацетатные, гидрохлоридные и трифторуксусные соли. Ацетатные соли являются наиболее предпочтительными. Соли могут быть образованы традиционными способами, такими как взаимодействие продукта в форме свободной кислоты или основания с одним или более эквивалентами соответствующего основания или кислоты в растворителе или среде, в которых соль нерастворима, или в растворителе, таком как вода, который затем удаляют под вакуумом или при лиофильном высушивании, или при замене ионов имеющейся соли на другой ион с использованием подходящей ионообменной смолы.

Используемые в настоящем изобретении композиции могут быть традиционно представлены в виде препаратов, пригодных для парентерального (включая внутривенное, внутримышечное и подкожное), назального, или перорального введения. Подходящий режим введения определяется индивидуально для каждого пациента медицинским специалистом. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и их композиции описаны в стандартных руководствах (например, Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W.Martin; см. также Wang, Y.J. and Hanson, M.A. "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers", Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report №10, Supp.42:23 (1988)). Соединения, приготовленные в виде парентеральных композиций для инъекции или инфузии, могут быть, например, суспендированы в инертном масле, приемлемыми являются кунжутное, арахисовое, оливковое масло или другой приемлемый носитель. Предпочтительно их суспендируют в водном носителе, например в изотоническом буферном растворе при рН примерно 5,6-7,4. Указанные композиции могут быть затем простерилизованы с использованием традиционной техники стерилизации или могут быть подвергнуты стерильному фильтрованию. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые дополнительные вещества, которые требуются для того, чтобы приблизить их к физиологическим условиям, такие как рН-забуферивающие агенты. Используемые буферы включают, например, буферы на основе ацетата натрия/уксусной кислоты. Препараты с замедленным высвобождением в пролонгированной форме или в форме "депо" также могут быть использованы с тем, чтобы доставлять терапевтически эффективные количества препарата в кровяное русло в течение многих часов или дней после трансдермальной инъекции или иного способа доставки.

Предпочтительно, указанные парентеральные дозированные формы готовят в соответствии со способом совместной патентной заявки, которая озаглавлена: "Parenteral, Liquid Formulations for Amylin Agonist Peptides", серийный №60/035140, поданной 8 января 1997 года, и в заявке на Патент США, серийный №09/005262, поданной 8 января 1998 года, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки, и которые включают примерно от 0,01 до 0,5% (вес/объем) соответственно амилина или агониста амилина в водной системе вместе с примерно 0,02-0,5% (вес/объем) ацетатного, фосфатного, цитратного или глютаматного буфера с целью поддержания рН в готовой композиции на уровне примерно от 3,0 до 6,0 (более предпочтительно, от 3,0 до 5,5), а также примерно от 1,0 до 10% (вес/объем) углевода или многоатомного спирта, в качестве тонизирующего средства, в водной непрерывной фазе. В предпочтительной композиции продукта, направленной на то, чтобы позволить пациенту отказаться от многократного приема доз препарата, также присутствует противомикробный консервант в количестве примерно от 0,005 до 1,0% (вес/объем), отобранный из группы, состоящей из м-крезола, бензилового спирта, метил-, этил-, пропил- и бутилпарабена и фенола. Стабилизатор не требуется. Для получения желательной концентрации раствора используют некоторое достаточное количество воды для инъекций. Могут, кроме того, присутствовать хлорид натрия, а также другие наполнители, если желательно. Такие наполнители, однако, должны способствовать поддержанию общей стабильности амилина или пептидного агониста амилина. Жидкие композиции должны быть по существу изотоническими, что означает, что они находятся в диапазоне ±20% изотоничности и, предпочтительно, в диапазоне 10% изотоничности. Более предпочтительно, в композиции на основе амилина или агониста амилина для парентерального введения многоатомный спирт представляет собой маннит, буфер представляет собой ацетатный буфер, консервант содержится в концентрации от 0,1 до 0,3% (вес/объем) и представляет собой м-крезол, и рН имеет значение примерно от 3,1 до 4,3. Желательный уровень изотоничности может быть достигнут при использовании хлорида натрия или других фармацевтически приемлемых солей.

При желании растворы указанных композиций могут быть загущены с использованием загустителя, такого как метилцеллюлоза. Они могут быть приготовлены в эмульгированной форме, либо в виде воды в масле или в виде масла в воде. При этом может быть использован любой из широкого перечня фармацевтически приемлемых эмульгаторов, которые включают, например, порошок аравийской камеди, неионное поверхностно-активное вещество (такое как Твин) или ионное поверхностно-активное вещество (такое как сульфаты щелочного металла полиэфирного спирта или их сульфонаты, например Тритон).

Композиции, используемые по настоящему изобретению, готовят при смешивании ингредиентов в рамках, принятых для этого процедур. Так, например, отобранные компоненты могут быть просто смешаны в смесителе или другом стандартном устройстве с получением концентрированной смеси, которую затем доводят до конечной концентрации и вязкости посредством добавления воды или загустителя и, возможно, вносят буфер для регулирования рН или дополнительный раствор для контроля тонизирующих характеристик.

Для удобства применения врачом композиции поставляют в стандартной дозированной форме, содержащей определенное количество амилина или агониста амилина, например соединение аналога агониста амилина, которое является эффективным в однократной или многократной дозировке в отношении контроля степени ожирения на нужном уровне. Терапевтически эффективные количества амилина или агониста амилина, такого как аналог агониста амилина, с целью использования для контроля ожирения, являются такими же, как и в случае применения их для снижения веса тела. Как это понятно специалисту со средним уровнем знаний в данной области, эффективное количество терапевтического вещества варьирует, в зависимости от множества факторов, включающих возраст и вес больного, физическое состояние пациента, ожидаемый результат и другие факторы.

Эффективные однократные, разделенные или непрерывно вводимые анальгетические дозы соединений, включающих, например, ^25,28,29Pro-h-амилин, ¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-амилин и ¹⁸Arg^25,28,Pro-h-амилин, в типичном случае представлены значениями, варьирующими в диапазоне от примерно 0,01 до 5 мг/день, предпочтительно от примерно 0,05 до примерно 2 мг/день и более предпочтительно от примерно 0,1 до 1 мг/день для пациента весом 70 кг, которые вводятся в виде однократной, разделенной или непрерывной доз. Точная доза, которая должна быть введена, определяется лечащим врачом и зависит от множества факторов, включающих указанные выше параметры. Введение должно начинаться с появлением первого признака ожирения. Введение может представлять собой инъекцию или инфузию, предпочтительно, внутривенную, подкожную или внутримышечную. Перорально активные соединения могут употребляться перорально, однако, дозировки должны быть увеличены в 5-10 раз.

В общем случае, при лечении или предупреждении ожирения соединения по настоящему изобретению могут вводиться пациенту, при необходимости такого применения, в дозировке, варьирующей в диапазоне, близком к данному ранее, однако, соединения могут вводиться более часто, например один, два или три раза в день или непрерывно. Предпочтительно, дозы пептидных агонистов, например прамлинтида, вводятся подкожно в дозах 30-300 мкг, которые дают от одного до четырех раз в день, и более предпочтительно, в дозах от 30-120 мкг, которые вводятся от двух до четырех раз в день.

Ниже приведены примеры с целью пояснения настоящего изобретения, которые описывают результаты множества проведенных экспериментов. Однако исследование, касающееся настоящего изобретения, не следует трактовать как ограничивающее его, при этом такие вариации и модификации изобретения, которые еще не известны или будут позже получены и которые находятся в компетенции специалиста со средним уровнем знаний в данной области, рассматриваются как попадающие в рамки настоящего изобретения в том виде, как они приведены в настоящем описании и заявлены в прилагаемой формуле изобретения.

ПРИМЕР 1

Измерение веса тела: 4-недельное исследование с больными диабетом II типа, нуждающимися в инсулине

Участниками исследования были мужчины и женщины в возрасте от 25 до 78 лет, которые имели в Истории болезни запись о наличии сахарного диабета II типа и которые нуждались в лечении инсулином, по меньшей мере, в течение 6 месяцев до визита накануне скрининга. В исследование включают пациентов, которые имеют вес тела, отличающийся не более чем на 45% от желательного веса перед самим исследованием (на основании таблиц жизненных показателей Metropolitan). В исследовании использованы методы, описанные в работе Томпсона с соавторами (Thompson et. al., Diabetes 46:632-636 (1997)). После подготовительного периода приема плацебо пациентов распределяют случайным образом на группы, получающие плацебо или одну из трех дозировок ^25,28,29Pro-h-амилина (прамлинтида) в течение 4 недель: 30 мкг четыре раза в день (перед завтраком, вторым завтраком, обедом и ужином), 60 мкг три раза в день (перед завтраком, вторым завтраком и обедом) или 60 мкг четыре раза в день (перед завтраком, вторым завтраком, обедом и вечерним приемом пищи). В течение всего периода исследования препарата пациенты вводят себе сами четыре инъекции исследуемого средства в день в течение 15 минут при каждом приеме пищи и во время вечерней закуски. В ходе периода двойного слепого исследования пациентов распределяют случайным образом в группы приема прамлинтида по 60 мкг трижды в день и приема плацебо перед вечерней закуской. Обе группы, принимающие прамлинтид и плацебо, применяют указанные средства в качестве отдельных инъекций в подкожную ткань передней брюшной стенки; после каждой инъекции чередуют конкретное место введения. Пациентов инструктируют о необходимости сохранять в течение всего исследования свою обычную диету, курс приема инсулина и выполнение упражнений, если особо исследователем не указывается иное, и воздержаться от приема алкогольных напитков перед посещениями клиники.

Как показано в Таблице 1, отмечается статистически значимое снижение веса тела относительно базового уровня к 4 неделе приема прамлинтида в дозе 60 мкг трижды в день (среднее значение составляет -0,89 кг, р=0,0056) и прамлинтида в дозе 60 мкг четыре раза в день (среднее значение составляет -0,72 кг, р=0,0014), в соответствующих группах. При проведении корректировки по Хохбергу (Hochberg adjustment) для целей множественных сравнений ни в одной из трех групп приема прамлинтида в сравнении с группой приема плацебо не отмечается статистически значимого изменения веса тела относительно базового уровня к моменту 4 недели. Таким образом, введение прамлинтида на фоне приема инсулина улучшает гликемический контроль при снижении веса тела, которое достигает статистической значимости при использовании дозы 60 мкг в группах, принимающих его трижды в день и четыре раза в день. Факт такого снижения резко отличается от результатов по увеличению веса, который обычно сопровождает улучшение контроля глюкозы и который возникает при применении только инсулина пациентами с диабетом II типа.

Таблица I Вес тела. Изменение относительно базового уровня к 4 неделе
Группа приема препарата	N	Среднее значение на базовом уровне (кг)	Изменения к 4 неделе		Значение р*
			среднее значение (кг)	медиана (кг)	в группе приема исследуемого средства	в группе сравнения при приеме плацебо
Плацебо	47	87,0	-0,04	0,0	НС	НИ
Прамлинтид 30 мкг 4/день	47	88,5	-0,36	-0,45	НС	НС
Прамлинтид 60 мкг 2/день	48	86,2	-0,89	-1,05	0,0056	НС
Прамлинтид 60 мкг 4/день	51	91,5	-0,72	-0,45	0,0014	НС
* Т-тест Стьюдента (при сравнении в рамках группы приема препарата). Двухходовый тест ANOVA (при сравнении с группой приема плацебо) с проведением корректировки по Хохбергу. НС - статистически незначимый, НИ - не исследовался

ПРИМЕР 2

Измерение веса тела: 52-недельное исследование с больными диабетом I типа

Указанное исследование представляет собой многоцентровое, двойное слепое исследование и с контролем в виде параллельной группы, принимающей плацебо, испытание с возможностью повышения дозы. В исследовании приняли участие мужчины и женщины в возрасте от 16 до 70 лет, больные сахарным диабетом I типа. Пациенты ежедневно делали сами себе подкожные инъекции 30 мкг прамлинтида или плацебо, перед каждым приемом пищи и легкой закуской перед сном. Некоторых пациентов (тех из них в группе прамлинтида, которые характеризуются снижением HbAlc от базового уровня менее чем 1,0% после 13 недель лечения) на 20 неделе вновь распределяют случайным образом в группу приема дозы либо 30 мкг, либо 60 мкг четыре раза в день в течение оставшегося периода исследования. В указанном испытании пациенты принимают исследуемое средство с рН 4,0 в концентрации, позволяющей инъекцию 0,1 мл на дозу. 477 пациентов получают по меньшей мере одну дозу исследуемого лекарственного средства (прамлинтида или плацебо). Из 477 пациентов, которые были случайным образом распределены и принимали соответствующие дозы, 341 закончили 52-недельное исследование.

Пациенты, которые принимали прамлинтид, продемонстрировали клинически выраженное и статистически значимое снижение веса тела в сравнении с группой приема плацебо к 13, 26 и 52 неделям (Таблица II). Наибольшее отличие от плацебо было отмечено к 26 и 52 неделям (снижение по меньшей мере на 1,2 кг в сравнении с группой приема плацебо в указанные временные точки). Потеря веса имела место в особенности у тех пациентов, которые имели на базовом уровне индекс массы тела (ИМТ), по меньшей мере, 27,0 кг/м², показывая наибольшую отдачу у таких тучных пациентов (Таблица III).

Пациенты, принимавшие прамлинтид в подгруппе пациентов с базовым уровнем HbAlc, составляющм по меньшей мере 8,0%, и на стабильном фоне инсулина продемонстрировали среднее значение снижения веса тела в сравнении с группой плацебо во всех трех временных точках (Таблица IV). Указанное наблюдение согласуется с хорошо известным действием инсулина, способствующим прибавлению веса тела. Таким образом, прамлинтид, по всей видимости, снижает инсулин-индуцированное увеличение веса.

Нормально распределенные данные проанализировали с использованием двухходового анализа вариантов. В тех случаях, где было показано, что данные не следуют нормальному режиму распределения, использовались непараметрические методы (тест Крускала-Валлиса (Kruskal-Wallis test)), основанные на анализе рядов. В этих случаях вместо среднего значения дана оценка Ходжеса-Лемана (Hodges-Lehman) для указания отличий от плацебо.

ПРИМЕР 3

Измерение веса тела: 52-недельное исследование с больными диабетом II типа, нуждающимися в инсулине

Указанное исследование представляет собой многоцентровое, двойное слепое и с контролем в виде параллельной группы, принимающей плацебо, испытание с возможностью варьирования дозы. В испытании приняли участие мужчины и женщины в возрасте от 18 до 75 лет, больные сахарным диабетом II типа и нуждающиеся в инсулине. Пациенты ежедневно вводили сами себе три подкожные инъекции прамлинтида (30, 75 или 150 мкг, трижды в день) или плацебо (трижды в день) перед каждым приемом пищи в течение 52 недель. В указанном исследовании пациенты принимают испытуемое лекарственное средство с рН 4,7 в концентрации, необходимой для инъекции 0,3 мл в расчете на дозу. Проведению двойного слепого испытания предшествовал 3-10-дневный вводный период приема плацебо с одной слепой меткой. Из 539 пациентов, которые были распределены случайным образом на группы и принимали соответствующие дозы, 381 пациент закончил 52-недельное исследование.

Пациенты, которые принимали любую из трех доз прамлинтида, продемонстрировали клинически выраженное и статистически значимое снижение веса тела в сравнении с группой приема плацебо к 13, 26 и 52 неделям (Таблица V). Наибольшее отличие от уровня плацебо отмечалось к 26 неделе и 52 неделе (снижение на 2,3 и 2,7 кг в сравнении с плацебо в указанные временные точки). Вес пациентов, принимавших плацебо, увеличивался относительно базового уровня во всех трех временных точках, в отличие от результатов в трех группах приема прамлинтида, где отмечалось снижение веса тела во всех временных точках. Потеря веса имела место у тех пациентов, которые имели значение индекса массы тела (ИМТ) на базовом уровне по меньшей мере 27,0 кг/м², и у тех, кто имел на базовом уровне значение ИМТ менее чем 27,0 кг/м ² (Таблица VI).

Пациенты, которые принимали прамлинтид во всех трех группах с базовым значением HdAlc, равным, по меньшей мере, 8,0%, и на фоне стабильного приема инсулина, продемонстрировали снижение веса тела в сравнении с группой приема плацебо во все временные точки (Таблица VII). Выраженность ответа была в целом сравнимой для всех пациентов, что предполагает независимость эффекта от изменений в дозе инсулина.

Нормально распределенные данные проанализировали с использованием двухходового анализа вариантов (с использованием корректировки по Хохбергу (Hochberg) в процедуре Бонферрони (Bonferroni) для проведения множественных сравнений). В тех случаях, когда представленные данные не подчинялись нормальному распределению, были использованы непараметрические методы анализа (тест Крускала-Валлиса (Kruskal-Wallis)), основанные на анализе рядов. В этих случаях вместо среднего значения представлена оценка по Ходжесу-Леману (Hodges-Lehman) для указания отличий от данных, полученных в группе приема плацебо.

ПРИМЕР 4

Получение ^25,28,29 Pro-h-амилина

Твердофазный синтез ^25,28,29 Pro-h-амилина с использованием смолы, связанной с метилбензилгидриламиновым якорем, и защиты боковой цепи N^a-Бок/бензилом проводят в рамках стандартной техники синтеза пептидов. ^2,7-[дисульфид]амилин-МБГА- смолу получают при обработке Acm-защищенных цистеинов трифторацетатом таллия(III) в трифторуксусной кислоте. После проведения циклизации смолу и защищающую группу боковой цепи расщепляют жидкой HF в присутствии диметилсульфида и анизола. ^25,28,29Pro-h-амилин очищают препаративной ВЭЖХ с обращением фаз. С использованием аналитической ВЭЖХ и капиллярного электрофореза было показано, что пептид является гомогенным, при этом его структура была подтверждена аминокислотным анализом и анализом последовательности. Продукт характеризовался желательным масс-ионом. FAB масс-характеристики: (М+Н) ⁺=3,949.

ПРИМЕР 5

Получение ¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-амилина

Твердофазный синтез ¹⁸Arg ^25,28,29Pro-h-амилина с использованием смолы, связанной с метилбензилгидриламиновым якорем, и защиты боковой цепи N ^a-Бок/бензилом проводят в рамках стандартной техники синтеза пептидов. ^2,7-[дисульфид]амилин-МБГА-смолу получают при обработке Acm-защищенных цистеинов трифторацетатом таллия(III) в трифторуксусной кислоте. После проведения циклизации смолу и защищающую группу боковой цепи расщепляют жидким HF в присутствии диметилсульфида и анизола. ¹⁸ Arg^25,28,29Pro-h-амилин очищают препаративной ВЭЖХ с обращением фаз. Методами аналитической ВЭЖХ и капиллярного электрофореза было показано, что пептид является гомогенным, при этом его структура была подтверждена аминокислотным анализом и анализом последовательности. Продукт характеризуется наличием желательного масс-иона. FAB масс-характеристики: (М+Н) ⁺=3,971.

ПРИМЕР 6

Получение ¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-амилина

Твердофазный синтез ¹⁸Arg ^25,28,29Pro-h-амилина с использованием смолы, связанной с метилбензилгидриламиновым якорем, и защиты боковой цепи N ^a-Бок/бензилом проводят в рамках стандартной техники синтеза пептидов. ^2,7-[дисульфид]амилин-МБГА-смолу получают при обработке Acm-защищенных цистеинов трифторацетатом таллия (III) в трифторуксусной кислоте. После проведения циклизации смолу и защищающую группу боковой цепи расщепляют жидким HF в присутствии диметилсульфида и анизола. ¹⁸ Arg^25,28,29Pro-h-амилин очищают препаративной ВЭЖХ с обращением фаз. Методами аналитической ВЭЖХ и капиллярного электрофореза было показано, что пептид является гомогенным, при этом его структура была подтверждена аминокислотным анализом и анализом последовательности. Продукт характеризуется наличием желательного масс-иона. FAB масс-характеристики: (М+Н) ⁺=3,959.

ПРИМЕР 7

Тест на связывание с рецептором

Оценку связывания соединений с рецепторами амилина проводят следующим образом, ¹²⁵I-амилин крыс (меченый на N-концевом лизине по методу Болтона-Хантера (Bolton-Hunter)) получают от Amersham Corporation (Arlington Heights, IL). К моменту использования удельная активность варьирует в диапазоне от 1950 до 2000 Ci/ммоль. Немеченные пептиды получают от Bachem Inc. (Torrance, CA) и Peninsula Laboratories (Belmont, CA).

Самцов крыс линии Спрэг Доли (Sprague-Dawley) (весом 200-250 граммов) умерщвляют декапитацией. Мозг крыс удаляют и помещают в холодный фосфатно-буферный раствор (ФБР). От брюшной поверхности делают ростральный надрез к гипоталамусу, связанному латерально с обонятельными путями, и расширяют под углом 45° в медиальном направлении от этих путей. Указанную базальную ткань переднего мозга, содержащую прилежащие ядра и окружающие участки, взвешивают и гомогенизируют в холодном 20 мМ HEPES буфере (20 мМ HEPES кислота со значением рН, доведенным до 7,4 с помощью NaOH при 23°С). Мембраны промывают три раза в свежем буфере с использованием центрифугирования в течение 15 минут при 48000×g. Конечный мембранный осадок ресуспендируют в 20 мМ HEPES буфере, содержащем 0,2 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ).

Для измерения уровня связывания ¹²⁵I-амилина инкубируют мембраны из 4 мг исходного сырого веса ткани с ¹²⁵I-амилином в концентрации 12-16 пМ в 20 мМ HEPES буфере, содержащем 0,5 мг/мл бацитрацина, 0/5 мг/мл бычьего сывороточного албумина и 0,2 мМ ФМСФ. Раствор инкубируют в течение 60 минут при температуре 23°С. По завершении инкубации проводят фильтрование через стекловолокнистый фильтр GF/B (Whatman Inc., Clifton, NJ), который предварительно вымачивался в течение 4-х часов в 3% полиэтиленимине для снижения неспецифического связывания радиоактивно меченых пептидов. Пептиды промывают непосредственно перед фильтрованием 5 мл холодного ФБР, и сразу же после фильтрования их также промывают 15 мл холодного ФБР. Фильтры удаляют и оценивают уровень радиоактивности на гамма-счетчике с эффективностью счета 77%. Строят конкурентные кривые при измерении связывания в присутствии от 10 ^-12 до 10^-6 М немеченого исследуемого соединения и анализируют их методом нелинейной регрессии с использованием 4-параметрового логистического уравнения (Inplot program; GraphPAD Software, San Diego).

В указанном тесте очищенный человеческий амилин связывается со своим рецептором со значением ИК ₅₀, равным, как показали измерения, примерно 50 пМ. Ниже/ в Таблице VIII, приведены результаты, полученные для исследуемых соединений, которые показывают, что каждое из этих соединений обладает значительной рецептор-связывающей активностью.

ПРИМЕР 8

Тест на камбаловидной мышце

Определение агонистской активности исследуемых соединений в отношении амилинов проводят с использованием теста на камбаловидной мышце, описанного ниже. Используют самцов крыс линии Харлан Спрэг Доли (Harlan Sprague-Dawley) весом примерно 200 г с тем, чтобы иметь возможность поддерживать вес расщепленной камбаловидной мышцы на уровне менее 40 мг. Животных выдерживают без пищи в течение 4-х часов, затем умерщвляют декапитацией. С нижней конечности снимают кожу и прикалывают ее к пробковой поверхности. Ахиллово сухожилие разрезают выше пяточной кости, при этом икроножная мышца выдается из задней части большеберцовой кости. После этого осторожно отрывают камбаловидную мышцу, представляющую собой мелкую 15-20 мм длиной, 0,5 мм толщиной плоскую мышцу на костевой поверхности икроножной мышцы и очищают ее от перимизия с использованием миниатюрных ножниц и пинцета. После этого камбаловидную мышцу расщепляют на равные части с помощью лезвия, проходя в передне-заднем направлении по брюшку мышцы, с получением в целом 4-х мышечных полосок от каждого животного. После иссечения мышцы из животного ее хранят в течение короткого времени в физиологическом растворе. Нет необходимости держать мышцу под напряжением, поскольку при этом не было показано выраженного эффекта на включение в гликоген радиоактивной меченой глюкозы.

Мышцы вносят в колбы Эрленмейера на 50 мл, содержащие 10 мл газированного бикарбонатного буфера Кребса-Рингера, содержащего (на каждый литр) NaCl - 118,5 ммоль (6,93 г), KCl - 5,94 ммоль (443 мг), CaCl₂ - 2,54 ммоль (282 мг), MgSO₄ -1,19 ммоль (143 мг), КН ₂PO₄ - 1,19 ммоль (162 мг), NaHCO ₃ - 25 ммоль (2,1 г), глюкозы - 5,5 ммоль (1 г) и рекомбинантный человеческий инсулин (Humulin-R, Eli Lilly, IN), а также исследуемое соединение, как детально приведено ниже. Проверяют значение рН при 37°С с тем, чтобы оно держалось в диапазоне между 7,1 и 7,4. Мышцы распределяют по различным колбам так, чтобы 4 кусочка мышцы от каждого животного были равномерно распределены по различным условиям тестирования. Инкубационные среды насыщают газом при осторожном продувании над их поверхностью карбогена (95% О ₂, 5% CO₂) при постоянном перемешивании при 37°С в колеблющейся водяной бане. После получасовой преинкубации добавляют 0,5 мкCi U-¹⁴С-глюкозы в каждую колбу и затем инкубируют их еще в течение 60 минут. Каждый кусочек мышцы после этого быстро вынимают, промакивают и замораживают в жидком N₂, взвешивают и хранят с последующим определением ¹⁴С-гликогена.

Определение ¹⁴С-гликогена проводят в сцинтилляционных флаконах на 7 мл. Каждый образец замороженной мышцы помещают во флакон и переваривают в 1 мл 60% гидроксида калия при 70°С в течение 45 минут при непрерывном перемешивании. Растворенный гликоген осаждают во флаконе при добавлении 3 мл абсолютного этанола и охлаждении в течение ночи при -20°С. Супернатант осторожно отсасывают, гликоген снова промывают этанолом, отсасывают и осадок высушивают под вакуумом. Весь этанол выпаривают с тем, чтобы избежать тушения при сцинтилляционном счете. Оставшийся гликоген перерастворяют в 1 мл воды и 4 мл сцинтилляционной жидкости и считают уровень ¹⁴С.

Уровень включения глюкозы в гликоген (выраженный в мкмоль/г/ч) получают на основе удельной активности ¹⁴С глюкозы в инкубационной среде с содержанием 5,5 мМ глюкозы, и общий счет ¹⁴С, оставшегося в гликогене, вычитают из значений, полученных для каждой мышцы. Кривые доза-ответ соотносят с 4-параметровой логистической моделью при использовании стандартной процедуры подсчета наименьших квадратов (ALLFIT, v2,7, NIH, MD) для получения значений ЭК₅₀. Поскольку ЭК ₅₀ демонстрирует нормальное распределение в log-варианте, его выражают в виде ±стандартная ошибка логарифма. Сравнение пар проводят с использованием т-теста на основании стандартной процедуры SYSTAT (Wilkinson, "SYSTAT: the system for statistics", SYSTAT Inc., Evanston IL (1989)).

Кривые дозы-ответ получают при добавлении мышц к средам, содержащим 7,1 нМ (1000 мкЕд/мл) инсулина, при этом каждое исследуемое соединение добавляют в конечных (номинальных) концентрациях 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300 и 1000 нМ. Каждая среда для тестирования также содержит внутренний положительный контроль, состоящий из единичной партии амилина крысы, лиофилизированного и хранящегося при -70°С.

Человеческий амилин известен как гипергликемический пептид и измерения ЭК₅₀ амилиновых препаратов в тесте с камбаловидной мышцей типично дают значения в диапазоне от примерно 1-10 нМ, хотя некоторые коммерческие препараты, которые имеют чистоту менее 90%, имеют более высокие значения ЭК ₅₀ в связи с присутствием загрязнителей, которые сказываются на более низкой измеряемой активности. Результаты исследования испытуемых соединений приведены ниже, в Таблице VIII.

Таблица VIII
Мышца ЭК50 (нМ)	Тест на связывание с рецептором ИК50	Тест на камбаловидной мышце
1) 25Pro26Val28,29 Pro-h-амилин	18,0	4,68
2) 2,7Цикло-[ 2Asp,7Lys]-h-амилин	310,0	6,62
3) 2-37h-амилин	236,0	1,63
4) 1Ala-h-амилан	148,0	12,78
5) 1Ser-h-амилин	33,0	8,70
6) 25,28Pro-h-амилин	26,0	13,20
7) дез-1Lys 25,28Pro-h-амилин	85,0	7,70
8) 18Arg 25,28Pro-h-амилин	32,0	2,83
9) дез-1 Lys18Arg25,28Pro-h-амилин	82,0	3,77
10) 18Arg 25,28,29Pro-h-амилин	21,0	1,25
11) дез-1 Lys18Arg25,28,29Pro-h-амилин	21,0	1,86
12) 25,28,29Pro-h-амилин	10,0	3,71
13) дез-1Lys 25,28,29Pro-h-амилин	14,0	4,15

ПРИМЕР 9

Тест на опустошение желудка с феноловым красным

Измерение опустошения желудка проводят с использованием модификации Плоурда с соавторами (Plourde et al., Life Sci. 53: 857-862 (1993)) оригинального метода Скарпигнато с соавторами (Scarpignato et al., Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 246; 286-295 (1980)). Вкратце, процедура состоит в том, что находящимся в сознании крысам дают с помощью зонда 1,5 мл неокрашенного геля, содержащего 1,5% метилцеллюлозы (М-0262, Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) и 0,05% фенолового красного в качестве индикатора. Через двадцать минут после введения зонда крыс анестезируют с использованием 5% галотана, желудок обнажают и с помощью артериального зажима фиксируют на пилорическом и нижнем пищеводном сфинктерах, вынимают его и опустошают содержимое в щелочной раствор, который доводят до фиксированного объема. Содержимое желудка определяют по интенсивности окрашивания феноловым красным в щелочном растворе, которую измеряют по поглощению при длине волны 560 нм. В большинстве экспериментов желудок был чистым. В других экспериментах с целью последующего измерения поглощения содержимое желудка центрифугируют для просветления раствора. В тех случаях, когда и после разбавления содержимое желудка продолжает оставаться мутным, спектроскопическое поглощение, связанное с феноловым красным, определяют как разницу между таковым в щелочном растворе и в подкисленном разбавителе. В отдельном эксперименте на 7 крысах желудок и тонкий кишечник вырезают и опустошают в щелочной раствор. Количество фенолового красного, которое могло быть восстановлено из верхнего желудочно-кишечного тракта в течение 29 минут зондирования, составляет 89±4%; количество красителя, по всей видимости, связывается необратимо с поверхностью просвета кишки, может быть подсчитано на основе баланса. Для компенсирования этой небольшой потери - процент содержимого желудка, оставшегося после 20 минут, выражают в виде фракции желудочного содержимого, получаемого у контрольных крыс, умерщвленных сразу после кормления зондом в том же самом эксперименте. Процент оставшегося содержимого в опустошенном желудке - (поглощение к 20 мин)/(поглощение к 0 мин). Кривые доза-ответ в тесте опустошения желудка соотносят с 4-параметровой логической моделью при использовании стандартной процедуры подсчета наименьших квадратов (ALLFIT, v2,7, NIH, Bethesda, MD) с получением значений ЭК ₅₀. Поскольку значения ЭК₅₀ демонстрируют нормальное распределение в логарифмическом варианте, их выражают в виде ± стандартная ошибка логарифма. Сравнение пар проводят с использованием одноходового анализа вариантов и теста для проведения множественных сравнений Стьюдента-Ньюмена-Колса (Student-Newman-Keuls) (Instat v2,0, GraphPad Software, San Diego, CA) с использованием Р<0,05 в качестве уровня значимости.

В исследованиях доза-ответ амилин крысы (Bachem, Torrance, CA) растворяют в 0,15 М солевом растворе и затем вводят в виде 0,1 мл подкожного болюса в дозах 0, 0,01, 0,1, 1, 10 или 100 мкг за 5 минут до введения зонда крысам Харлан Спрэг Доли (Harlan Sprague Dawley) (без диабета), которых выдерживают без пищи в течение 20 часов и диабетическим ВВ крысам, которых выдерживают без пищи в течение 6 часов. В том случае, когда подкожные инъекции амилина делают за 5 минут до введения зонда с индикатором феноловым красным, отмечается зависимое от дозы подавление опустошения желудка (данные не приведены). Подавление опустошения желудка было полным у нормальных HSD крыс, которым вводили 1 мкг амилина, и у диабетических крыс, которым вводили 10 мкг (Р=0,22, 0,14). Значения ЭК₅₀ ингибирования опустошения желудка у нормальных крыс составляет 0,43 мкг (0,60 нмоль/кг)±0,19 log единиц, а также 2,2 мкг (2,3 нмоль/кг)±0,18 log единиц у диабетических крыс.

ПРИМЕР 10

Тест на опустошение желудка с третированной глюкозой

С использованием 2% лидокаина у находящихся в сознании, не голодающих крыс линии Харлан Спрэг Доли (Harlan Sprague Dawley) анестезируют кончик хвоста, поддерживая за него животных. На бета-счетчике определяют уровень трития в плазме, выделенной из хвостовой крови, отобранной на момент времени 0, 15, 30, 60, 90 и 120 минут после введения зонда. Крысам инъецируют подкожно 0,1 мл солевого раствора, содержащего 0, 0,1, 0,3, 1, 10 или 100 мкг амилина крыс, за одну минуту до введения зонда (n=8, 7, 5, 5, 5 соответственно). После введения зондом солевого раствора крысам, которым уже инъецировали глюкозу, уровень трития в плазме быстро повышается (значение t 1/2 составляет примерно 8 минут) до асимптоты и затем медленно снижается. Подкожная инъекция амилина зависимым от дозы образом снижает и/или задерживает поглощение метки. Активность трития в плазме интегрируют в течение 30 минут, получая величину площади под кривой, построенной в виде функции дозы амилина. Значение ЭК₅₀, полученное на основе логистической модели, составляет 0,35 мкг амилина.