ксеногенные олиго- или/и полирибонуклеотиды в качестве средств для лечения злокачественных опухолей

Формула изобретения

1. Способ получения лекарственного средства для лечения карцином, за исключением злокачественных кожных заболеваний, включающий

а) получение ксеногенной РНК в качестве биологически активного вещества;

6) получение конъюгатов указанной ксеногенной РНК с клетками подвергаемой лечению опухоли путем инкубации в условиях in vitro;

в) добавление физиологически приемлемых носителей, вспомогательных веществ, разбавителей и/или добавок;

причем указанное биологически активное вещество представляет собой ксеногенную РНК из тканей животных, растений и/или одноклеточных организмов.

2. Способ по п.1, в котором биологически активное вещество представляет собой ксеногенную РНК из дрожжевых клеток.

3. Способ по п.1, в котором биологически активное вещество представляет собой ксеногенную тРНК.

4. Способ по п.1, в котором ксеногенная РНК получена путем экстракции фенолом.

5. Применение конъюгата ксеногенной РНК с клетками подвергаемой лечению опухоли для лечения карцином, за исключением злокачественных кожных заболеваний.

6. Применение по п.5, в котором нуждающемуся в таком лечении пациенту или животному вводят ксеногенную РНК, предварительно инкубированную in vitro с клетками подвергаемой лечению злокачественной опухоли.

7. Способ лечения карцином, за исключением злокачественных кожных заболеваний, в котором нуждающемуся в таком лечении пациенту или животному одно- или многократно вводят ксеногенную РНК в форме конъюгата в эффективном количестве 50-100 мг тРНК или общей РНК.

8. Способ по п.7, в котором пациенту или животному вводят ксеногенную РНК в форме коньюгата с опухолевыми клетками подвергаемой лечению опухоли.

9. Способ по п.7, где пациенту или животному вводят инкубированную in vitro смесь 10⁵-10⁶ опухолевых клеток с 50-100 мг тРНК или общей РНК.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к ксеногенным олиго- или/и полирибонуклеотидам в качестве средств для лечения злокачественных опухолей. Далее оно относится к применению этих ксеногенных олиго- или/и полирибонуклеотидов для получения лекарственных средств в целях лечения злокачественных опухолей.

Уровень техники

В конце шестидесятых и в начале семидесятых годов в рамках исследования трансплантации было найдено, что предварительно обработанные ксеногенными гетерогенными нуклеиновыми кислотами ткани или "слабые" (низкоиммуногенные) антигены в различных иммунологических методах исследования обладают в значительной степени повышенными антититрами. Эти результаты затем были подтверждены исследованиями in vitro и in vivo с рядом различных антигенов. Однако нет никаких указаний на то, что нуклеиновые кислоты и в особенности олиго- или/и полирибонуклеотиды ксеногенного происхождения могут быть пригодны для лечения злокачественных опухолей.

Прежде всего в США в то же самое время проводили опыты с определенными синтетическими поли- и олигонуклеотидами, особенно с рибонуклеотидами, которые, однако, из-за их высокой токсичности in vivo были прекращены.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения поэтому являлось получение лекарственного средства, пригодного для лечения злокачественных опухолей. Злокачественные опухоли, в смысле настоящего изобретения, не охватывают злокачественные кожные заболевания.

Задача согласно изобретению решается благодаря способу получения лекарственного средства для лечения злокачественных опухолей, которое в качестве биологически активного вещества содержит ксеногенные олиго- или/и полирибонуклеотиды предпочтительно в форме их конъюгатов с клетками подвергаемых лечению опухолей.

Ксеноген, в смысле настоящего изобретения, означает, что рибонуклеиновая кислота происходит из другого, чем подвергаемый лечению с ее помощью организм, то есть такие олиго- или/и полирибонуклеотиды происходят не из того же самого организма, в который нужно вводить лекарственное средство. В случае используемых согласно изобретению ксеногенных олиго- или/и полирибонуклеотидов речь идет предпочтительно о тех, которые происходят из тканей животных (как, например, ткань крупного рогатого скота, плодная телячья ткань), растений и одноклеточных организмов, предпочтительно из дрожжевых клеток (в особенности Saccharomyces cerevisiae). Предпочтительно используют олиго- или/и полирибонуклеотиды из организмов, которые согласно истории развития по возможности чужеродны подвергаемому лечению организму. В случае лекарственных средств для человека, таким образом, предпочтительно применяют РНК из тканей животных или особенно предпочтительно из растений или одноклеточных организмов, как, например, дрожжи.

Используемые согласно изобретению олиго- или/и полирибонуклеотиды нетоксичны и сами не антигенны.

Можно эффективно использовать препараты общей РНК и ее солей и соединений. Особенно предпочтительна транспортная рибонуклеиновая кислота (тРНК). В качестве способа получения используемых согласно изобретению рибонуклеиновых кислот в особенности предпочтительна экстракция фенолом, в частности обозначаемые в настоящем контексте как метод I и метод II способы.

Далее найдено, что ксеногенные рибонуклеиновые кислоты (РНК), связанные с пептидами, полипептидами и протеинами, увеличивают свою антигенность. На основании этих наблюдений опухолевую ткань пораженных заболеванием пациентов подвергают лечению с помощью ксеногенной РНК как in vitro, так и также in vivo. Терапию клеток опухолевой ткани пациента с помощью ксеногенной РНК, предпочтительно тРНК, предпочтительно осуществляют in vitro. Смесь затем системно вводят пациенту. В случае поверхностных злокачественных опухолей РНК также можно применять локально в пригодной галеновой форме.

Дополнительно к терапии человека, с помощью ксеногенных олиго- или/и полирибонуклеотидов согласно настоящему изобретению, тем же способом можно также лечить теплокровных, как например: лошади, крупный рогатый скот, овцы и т.д.

Изобретение далее поясняется нижеследующими примерами и результатами испытаний.

Примеры

Пример 1

Получение применяемых согласно изобретению олиго- или/и полирибонуклеотидов

В соответствующей литературе описываются многочисленные способы получения нуклеиновых кислот, нуклеотидов и нуклеозидов, для каждого из которых известны соответствующие испытания. В настоящем изобретении предпочтительно используют два метода с незначительными модификациями, причем оба основаны на обработке фенолом (фенолизация): метод I для получения общей РНК (Georgiev G.P. и Mantieva V.L., Biochim. Biophys. Acta, 61, 153 (1962)) и метод II для получения тРНК (Bauer S. и др. Biotechnology and Bioengineering, 15, 1081 (1973)). Оба метода служат для экстракции больших количеств.

Метод I

15%-ную суспензию пивных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) в буфере (А) [0,001 М этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТУ), 0,01 М буфер Трис-HCl, рН=5-6, 25% сахарозы, 0,5% додецилсульфата натрия, 0,3% дезоксихолата натрия] гомогенизировали в гомогенизаторе Уоринга при температуре 10°С в течение 3 минут со скоростью 3000 оборотов в минуту. Гомогенат смешивали с равным объемом раствора (В) [80% перекристаллизованного фенола в буфере (А), 0,1% 8-гидроксихинолина, 1,2% диэтилпирокарбоната] и затем медленно перемешивали в течение 30 минут при температуре 60°С. Все буферные растворы приготавливали на деионизированной воде, которую предварительно встряхивали с бентонитом. Затем фенолизированный гомогенат центрифугировали при комнатной температуре, примерно 20°С, в течение 15 минут с ускорением 10000 g. Водную фазу отделяли, фенольную и промежуточную фазы отбрасывали. Водную фазу смешивали с равным объемом смеси в соотношении 1:1 раствора (В) и смеси хлороформа и изоамилового спирта (в соотношении 96:4) и экстрагировали как описано выше. Водную фазу встряхивали 3 раза с половинным объемом диэтилового эфира с целью удаления остаточного фенола. В раствор вводили ацетат натрия до концентрации 2% и РНК осаждали с помощью 2,5 объемов абсолютного этанола.

Осажденную РНК отделяли путем центрифугирования при температуре 0°С и скорости 5000 оборотов в минуту и обрабатывали охлажденным во льде 0,01 М буфером Трис-HCl, рН=7,0, и 0,01 M MgCl ₂. Для расщепления возможной ДНК раствор смешивали с 4 мкг/мл электрофоретически чистой панкреатической дезоксирибонуклеазы (ДНКаза) и инкубировали в течение 3 часов при температуре 22°С. Затем протеиновые остатки, ДНКазу и РНКазы расщепляли с помощью 10 мкг/мл проназы в течение 3 дней при температуре 37°С. В течение этого времени проназа также подвергалась деструкции за счет саморестрикции. Раствор РНК экстрагировали как описано выше с помощью раствора (В) в течение 20 минут при температуре 60°С при "мягком" перемешивании, фазы разделяли путем центрифугирования, водную фазу отделяли и встряхивали с диэтиловым эфиром. После добавления ацетата натрия (конечная концентрация 2%) РНК осаждали с помощью 2,5 объемов этанола и отделяли путем центрифугирования. Осадок обрабатывали с помощью холодного 2%-ного раствора ацетата натрия, осаждали с помощью 2,5 объемов этилового спирта и выдерживали в течение ночи при температуре -20°С в спиртовой смеси. Затем преципитат отделяли путем центрифугирования, промывали два раза с помощью 75%-ного этанола, два раза с помощью абсолютного этанола и два раза с помощью диэтилового эфира. После высушивания в сушильном шкафу получали сыпучую сухую РНК, которую хранили в темном стеклянном сосуде при комнатной температуре.

Метод II

Этот метод служит также для экстракции больших количеств дрожжей (килограммовые количества).

Заданную массу дрожжей гомогенизировали в четырехкратном количестве буфера (А) (см. выше, метод I) в низкотемпературной камере. К гомогенату добавляли 40% объем/объем фенольного раствора (В) и 5% мас./объем кубиков льда из деионизированной воды и перемешивали в течение 30 минут. Супернатант отсасывали и еще дважды, как описано в методе I, обрабатывали фенолом. Водные супернатанты собирали в сосуд, в котором находилась суспензия диэтиламиноэтилцеллюлозы (DEAE) (примерно 10% мас./объем, Whatman DE-22), соответственно половинному объему собранных супернатантов. Суспензию DEAE-целлюлозы поддерживали в суспендированном состоянии в течение 30 минут путем перемешивания. Затем оставляли осаждаться DEAE-целлюлозу в течение часа. Супернатант отсасывали. Тем временем промежуточную и фенольную фазы еще дважды перемешивали с аликвотным количеством раствора (С) (83% деионизированной воды, 15% мас./объем кубиков льда, 2% концентрата ацетата магния [0,5 М ацетата магния в 0,25 мл меркаптоэтанола]) в течение 30 минут и затем оставляли на 70-80 минут для разделения. Водные супернатанты переносили в сосуд с DEAE-целлюлозой, снова перемешивали и оставляли осаждаться. Супернатант отсасывали и диэтиламиноэтилцеллюлозу, как указано выше, промывали лишь дважды раствором (С), затем еще раз раствором (D) (2 объема концентрата ацетата магния, 2 объема концентрата NaCl [3,75 М NaCl в воде], 0,2 объема концентрата Трис-HCl [2,5 М Трис-HCl, рН=7,5, в воде, 96 объемов воды]).

DEAE-целлюлозу затем вносили в колонку, которая снизу была закрыта. Все дальнейшие стадии осуществляли в низкотемпературной камере при температуре 4°С. Колонку промывали с помощью 12-кратного, по отношению к содержимому колонки, количества раствора (D), при скорости потока 1,4 л/ч (только за счет силы тяжести). Затем тРНК элюировали с помощью раствора (Е) [2 объема концентрата ацетата магния, 0,2 объема концентрата Трис-HCl, 14 объемов концентрата NaCl и 84 объема воды; конечная концентрация NaCl 0,525 М] со скоростью потока 3 л/ч. Содержащие более чем 35 А_206нм Ед./мл фракции объединяли и осаждали с помощью 1,5 объемов этанола. Дальнейший ход работы соответствовал методу I.

Альтернативно, последний преципитат можно обрабатывать водой и лиофилизировать.

Вариантом этого метода является обычная обработка фенолом исходного материала.

Из верхней фазы изопропанолом осаждают сырую тРНК. Осадок после центрифугирования экстрагируют натрийацетатным буфером и хроматографируют на DEAE-целлюлозе. Элюирование осуществляют с помощью градиента ацетат натрия/хлорид натрия, как это известно биохимикам. Пригодные фракции, см. выше, определяют посредством логометрии и объединяют; тРНК осаждают этанолом, осадок обрабатывают как указано выше и предпочтительно лиофилизируют.

Для исследования чистоты общей РНК и тРНК и для их характеристики использовали следующие тесты: протеин определяли согласно Lowry О.Н. и др. (J. Biol. Chem., 193, 265 (1951)) и по соотношению А ₂₆₀/А₂₈₀ 2; ДНК определяли согласно Dische (Mikrochemie, 8, 4 (1930)); общую РНК определяли согласно Mejbaum (Physiol. Chem., 258, 117 (1939)); количественное определение тРНК и встраивание аминокислот определяли согласно Sprinzl и Sternbach (Methods in Enzymology, 59, 182 (1979)); токсичность определяли согласно М.Nöldner (М.Nöldner, Сообщение); апирогенность (Pyrogenfreiheit) определяли in vitro согласно DAB 1997 (LAL-тест) и in vivo согласно Ph. Eur./DAB 1997.

Результаты исследований

(Свойства общей РНК и тРНК, средние значения из десяти тестирований)

Абсорбция

A₂₆₀/A ₂₈₀ 1,94-2,0

C,H,N - Анализ

С	32,67 32,42
Н	5,22 5,20
N	2,29 2,00

с соответствующими значениями различных общей РНК и тРНК.

УФ- и ИК-спектры

УФ- и ИК-спектры изменяются, они почти одинаковы, но не идентичны, соответственно, биологическим веществам.

Молекулярная масса

Молекулярная масса общей РНК и тРНК из дрожжей имеет среднее значение 22000-27000 Дальтонов, изменяющееся в случае различных препаратов;

Белок	ДНК (общее содержание)
2,3%	отриц. общая РНК Saccharomyces cerevisiae
1,9%	отриц. тРНК Saccharomyces cerevisiae
0,9%	отриц. общая РНК бычьего происхождения

Среднее, в общем, обычное качество. Повышенная чистота при слишком повышенных затратах не приводит ни к какому в значительной степени улучшенному терапевтическому действию.

Встраивание аминокислот в случае тРНК, среднее значение из 10 исследований

Лизин	69-85 пмоль/А 260 Ед
Phe	41-55
Ser	39-50
Val	77-90

Эти средние значения в случае дрожжей различных партий изменяются в указанных рамках.

Токсичность

Тест на острую токсичность на мышах:

животные: самцы мышей линии NMRI, фирма Janvier, Франция

введение: внутривенно в хвостовую вену

длительность наблюдения: 24 часа

объем выборочных проб: n=10 в самой высокой концентрации

тестируемое вещество: а. бычья общая РНК

б. тРНК из пивных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae)

растворитель: 0,9% NaCl в воде для инъекций

Результат:

Вплоть до максимальной дозировки 1 г/кг/10 мл внутривенно подопытные животные в течение периода времени наблюдения 24 часа не проявляли никаких необычностей (поведения).

Апирогенность:

А. Пирогенное содержание общей РНК, а также тРНК, причем обе, как описанные выше, определяли с помощью in vitro-теста на эндотоксины согласно DAB 1997 (LAL TEST) и в случае кроликов согласно Ph. Eur. / DAB 1997.

1. Общая РНК

Эндотоксиновый стандарт ЕС 5

Амебоцитный лизат:

- декларированная чувствительность:	0,06 эндотоксиновых единиц/мл
- найденная чувствительность:	0,06 эндотоксиновых единиц/мл

тест-раствор: 100 мг РНК, растворенные в 20 мл воды-LAL (0,5%)

Результат:

Содержание эндотоксина в 0,5%-ном тест-растворе, разбавленном в соотношении 1:5 с помощью воды-LAL: <0,03 эндотоксиновых единиц/мл.

2. тРНК

Эндотоксиновый стандарт ЕС 5

Амебоцитный лизат:

- декларированная чувствительность: 0,06 эндотоксиновых единиц/мл

- найденная чувствительность: 0,06 эндотоксиновых единиц/мл

тест-раствор: 100 мг РНК, растворенные в 20 мл воды-LAL (0,5%)

Результат:

Содержание эндотоксина в 0,5%-ном тест-растворе, разбавленном в соотношении 1:10 с помощью воды-LAL: < 0,03 эндотоксиновых единиц/мл.

Б. Тест in vivo на апирогенность согласно DAB/Ph. Eub., Stand 2000

1. Общая РНК

1%-ный Тест-раствор тестируемого вещества в апирогенной воде для инъекций

Доза: 1,0 мл/животное

Животные: 3 кролика, соответственно DAB/Ph. Eub., Stand 2000

Результат:

Сумма разностей температур трех кроликов составляла 1,05°С; пирогены таким образом нельзя обнаружить.

2. тРНК

1%-ный Тест-раствор тестируемого вещества в апирогенной воде для инъекций

Доза:	1,0 мл / животное
Животные:	2 раза по 6 кроликов, соответственно DAB / Ph. Eub., Stand 2000

Результат:

а. сумма разностей температур 6 кроликов: 1,02°С

b. сумма разностей температур 6 кроликов: 1,06°С

Пироген нельзя обнаружить.

Пример 2

Обнаружение активности в отношении опухолей веществ согласно настоящему изобретению

10 пациентов, которые страдали от различных карцином и были прооперированы, организм которых был поражен многочисленными метастазами и которые не обращались более к химиотерапии, срок жизни которых оценивался лечащим онкологом в несколько недель, подвергали лечению 2 раза в течение 14 дней с помощью конъюгата тРНК/опухолевые клетки (инкубация в течение примерно 30 минут, 6×10⁶ опухолевых клеток с 50-100 мг тРНК, системно).

Одну пациентку после этой терапии также поддерживающе подвергали лечению с помощью "легкого" химиотерапевтического средства в течение нескольких недель. Спустя почти 2 года она скончалась независимо от ее основного заболевания.

Все другие обработанные пациенты прожили в течение более 1-2 лет без химиотерапии при хорошем "качестве" жизни без побочных явлений.

Эти результаты оправдывают использование РНК в случае пациентов, особенно так как они не обращались более к химиотерапии, были in faust, и нельзя было наблюдать никаких побочных действий или токсических явлений во время увеличенной продолжительности жизни.