штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых протеаз и ксиланазы

Формула изобретения

Штамм гриба Aspergillus oryzae 12, ВКПМ F-932 - продуцент кислых протеаз и ксиланазы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению нового штамма Aspergillus oryzae 12 - продуцента комплекса кислых протеаз и ксиланаз с высокой общей активностью в культуральной жидкости. Штамм получен из известного штамма Aspergillus oryzae 387 (ВКПМ F-683) путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза. Изобретение обеспечивает высокий уровень синтеза комплекса кислых протеаз и ксиланазы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию нового штамма, используемого для получения комплекса ферментов, - кислых и слабокислых протеаз, ксиланазы. Протеолитические и ксиланолитические ферменты широко применяются в различных отраслях промышленности: спиртовой, пивоваренной, винодельческой, кормовой и других. Это обусловлено тем, что перерабатываемое сельскохозяйственное сырье содержит высокомолекулярные белковые полимеры и растительные волокна. Наиболее характерное практическое применение комплексных препаратов кислых и слабокислых протеаз и ксиланаз связано с интенсификацией биотехнологических процессов в бродильных отраслях при производстве спирта, пива, с обработкой растительного сырья с высоким содержанием белковых веществ и ксиланов при производстве кормов и в др. областях АПК. В связи с этим селекция новых грибных штаммов для получения кислых протеаз и ксиланаз актуальна.

Известны штаммы - продуценты грибных протеаз из рода Aspergillus oryzae 251-90, 824-32 (1, 2), при глубинном культивировании которых синтезируются кислые и слабокислые протеазы. Недостатком этих продуцентов является их низкая продуктивность по протеазам и отсутствие биосинтетической способности по отношению к ксиланазе.

Наиболее близким к заявляемому объекту является штамм Aspergillus oryzae 387, регистрационный номер ВКПМ F-683 (3), один из наиболее активных продуцентов протеаз. В глубинной культуре известного штамма Asp.oryzae 387 на 42 часа роста протеолитическая активность достигает 8,7-11,8 ед. ПС/см³ в зависимости от состава питательной среды; кроме того, синтезируется ксиланаза с активностью 3,4-4,3 ед. КС/см³.

Недостатком этого штамма является низкий уровень протеолитической и ксиланолитической активности культуральной жидкости (к.ж.).

Задачей, поставленной настоящим изобретением, является получение штамма гриба Aspergillus oryzae, обладающего высокой способностью к образованию комплекса протеаз, проявляющих максимальную активность в кислой и слабокислой зоне рН, а также к синтезу ксиланазы.

Технический результат, получаемый от использования нового штамма, заключается в получении ферментативного комплекса с высокой протеолитической и ксиланолитической активностью в культуральной жидкости, уровень которых превышает аналог в 2,5-2,8 раза.

Задача решается созданием нового штамма путем селекции и мутагенеза из известного штамма Aspergillus oryzae 387 (4), способного к быстрому росту на простых по составу питательных средах и активному синтезу внеклеточных протеаз и ксиланазы.

Заявляемый штамм Aspergillus oryzae 12 получен путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза, депонирован в ВКПМ под №F-932.

В результате мутагенеза после неоднократного отбора и рассева вариантов был получен штамм Aspergillus oryzae 12 - продуцент кислых и слабокислых протеаз и ксиланазы, а также сопутствующего фермента - -амилазы.

Изучали уровни продукции протеаз и ксиланазы в культуральной жидкости, полученной путем выращивания заявляемого штамма и известных штаммов в жидкой питательной среде с аэрацией и перемешиванием. Общую протеолитическую активность определяли модифицированным методом Ансона с использованием в качестве субстрата бычьего гемоглобина при оптимальных условиях действия протеаз, ксиланазную - по Шомоди-Нельсона, амилолитическую - по ГОСТ 20264.4-89. Сравнительные показатели уровней протеолитических активностей культуральной жидкости штамма Asp. oryzae 12 с прототипами представлены в табл.1 и 2.

Таким образом, в результате селекции и мутагенеза получен новый штамм Aspergillus oryzae 12, обладающий высоким уровнем синтеза протеаз и ксиланазы, а также -амилазы, что позволяет повысить технологичность процесса получения комплекса ферментов кислых и слабокислых протеаз и ксиланазы с высоким уровнем их активности в культуральной жидкости. Штамм отличается от известного и по культурально-морфологическим признакам.

Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры и на косаках с сусло-агаром в отделе биотехнологии ферментных препаратов в пищевой промышленности государственного научного учреждения ВНИИ пищевой биотехнологии г. Москвы.

Штамм Aspergillus oryzae 12 характеризуется следующими свойствами.

Культуральные признаки. Через 6 суток роста на сусло-агаре образуются колонии диаметром 60×65 мм, поверхность колонии шероховатая с концентрическими окружностями, профиль колонии плоский, форма колонии неправильная, края волнистые, цвет - зеленый, края светло-желтые, с возрастом цвет колонии темнеет. Цвет с обратной стороны - серый.

При росте на агаризованной среде Чапека размер колонии через 6 суток 25×25 мм, цвет колонии оливковый, форма колоний округлая, края ровные, светло-желтые.

На всех средах наблюдается обильное спорообразование, пигменты в среду не выделяются, эксудата нет, слабый запах плесени.

Морфология штамма. Мицелий гриба септированный, разветвленный, со вздутиями, конидии формируются экзогенно; поверхность конидий гладкая, форма, в основном, округлая; толщина гиф 3-5 мкм.

Физиолого-биохимическая характеристика. Тип катаболизма - дыхание. Отношение к кислороду - аэроб. Оптимальная температура роста 30-34°С, максимальная - 50°С, минимальная - 18°С. Оптимальное значение рН среды для роста гриба и биосинтеза ферментов 5,4; рост продуцента имеет место в зоне рН от 2,5 до 10,0. Продуцент растет на средах с содержанием сухих веществ от 0,5 до 18%.

В качестве источника углерода гриб использует крахмал, глюкозу, сахарозу, ксилозу, мальтозу, маннит, глицерин, галактозу. Продуцент ассимилирует нитраты, аммонийный и аминный азот, белки.

Штамм непатогенный.

Штамм Aspergillus oryzae 12 использовали для получения кислых и слабокислых протеаз и ксиланазы, а также сопутствующего фермента - -амилазы.

При глубинном культивировании штамма Aspergillus oryzae 12 в зависимости от состава питательной среды протеолитическая активность составляет 21,0-24,6 ед. ПС/см³ , ксиланолитическая - 7,5-9,8 ед. КС/см³ , амилолитическая - 13,5-14,4 ед. АС/см³ .

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Aspergillus oryzae 12 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; КН₂PO₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода (среда 1), рН - естественный. Ферментационную питательную среду засевают вегетативным посевным материалом в количестве 4%, выращенным при 30°С в течение 18 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 50 см ³, на круговой качалке (220-240 об/мин) при температуре 30-32°С в течение 40 часов. Активность внеклеточных протеаз составляет 21,2 ед. ПС/см³, ксиланазы - 9,5 ед. КС/ см³, -амилазы - 13,5 ед. АС/см³.

Пример №2. Штамм Aspergillus oryzae 12 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; Д-ксилоза - 0,5; КН₂PO ₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода (среда 2), рН - естественный. Культивирование проводят, как указано в примере 1. Активность внеклеточных протеаз составляет 23,0 ед. ПС/см ³, ксиланазы - 10,8 ед. КС/см³, -амилазы - 13,0 ед. АС/см³.

Пример №3. Штамм Aspergillus oryzae 12 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; ксилан - 0,1; КН₂PO ₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода (среда 3), рН - естественный. Культивирование проводят, как указано в примере 1. Активность внеклеточных протеаз составляет 24,6 ед. ПС/см ³, ксиланазы - 11,8 ед. КС/см³, -амилазы - 14,4 ед. АС/см³.

Таблица 1 Сравнительная оценка физиологической активности грибов Aspergillus oryzae - продуцентов протеаз
Штамм		Длительность культивирования, ч			Ферментативная активность, ед./см 3
					ПС		КС			AC
251-90		72			5,0		0			8,7
387		42			11,8		4,0			10,8
12		38			24,2		10,2			13,6
Таблица 2 Влияние питательных сред на ферментативную активность гриба Aspergillus oryzae шт.387 и шт.12
Штамм	№ питательной среды		Ферментативная активность
			ПС			КС			AC
			ед./см3	% увеличения		ед./см 3		% увеличения	ед./см3		% увеличения
387	1		8,7	-		3,4		-	12,5		-
	2		9,8	-		3,8		-	12,3		-
	3		9,6	-		4,4		-	13,2		-
12	1		21,2	143		9,5		179	13,5		8
	2		23,0	145		10,8		184	13,0		6
	3		24,6	156		11,8		168	14,4		9

Источники литературы

1. Зуева Р.В. Физиолого-биохимические исследования экспериментально полученного мутанта Aspergillus oryzae - активного продуцента кислой протеиназы. Автореферат канд. диссертации. - М.: 1971.

2. А.С. СССР №1440922, кл. С12N 1/14, 1988.

3. Патент РФ 2208633, кл. 12 N 1/20, 2001.

4. Патент РФ 2070921, кл. 12 N 1/14, 1993.