вакцинный штамм вируса гриппа а/17/калифорния/ 04/6 (н3n2) и донор аттенуации а/ленинград/134/17/к7/57 (н2n2) для его получения

Формула изобретения

1. Штамм вируса гриппа А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) ГИСК №146 (Государственный институт стандартизации и контроля имени Л.А.Тарасевича), используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.

2. Штамм вируса гриппа А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2), представляющий собой клон вируса гриппа штамма А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), имеющий семь значащих мутаций во внутренних генах: РВ2 (Val-478-Leu), РВ1 (Lys-265-Asn и Val-591-Ile), PA (Leu-28-Pro и Val-341-Leu), M1 (Ile-15-Val) и NS2 (Met-100-Ile), являющийся донором аттенуации для производства вакцинного штамма по п.1

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди взрослых и детей живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма А/17/Калифорния/04/6 (H3N2). Этот вакцинный штамм был получен с помощью созданного для этой цели донора аттенуации А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2).

Известный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Панама/99/242 (H3N2) - прототип [Патент РФ №2248395 от 11.07.2003. - Опубл. БИ 2005. - №8] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной штаммом вируса гриппа, аналогичным вирусу А/Калифорния/7/04 (H3N2).

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма для взрослых и детей актуальной антигенной разновидности на основе современного эпидемического вируса А/Калифорния/7/04 (H3N2).

Такой штамм создан - это вакцинный штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2). Он получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Калифорния/7/04 (H3N2) с холодоадаптированным температурочувствительным донором аттенуации с последующей селекцией при пониженной до 25°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации.

Для получения вакцинного штамма в качестве донора аттенуации был использован новый, созданный методом клонирования штамм А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2).

Известен донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.]. Указанный штамм А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) является прототипом созданного нами штамма А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2).

Прототип А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) представляет собой гетерогенную популяцию клонов, отличающихся по набору мутаций в генах, кодирующих внутренние белки вируса [Youil R., Kiseleva I., Kwan W-S., Szymkowiak C., Toner T.J., Su Q., Klimov A., Rudenko L, Shaw A.R. Phenotypic and genetic analyses of the heterogeneous population present in the cold-adapted master donor strain: A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) // Virus Research, 2004. - Vol.102. - P.165-176]. Причиной создания нового донора было следующее.

Одним из этапов подготовки вакцинного штамма является клонирование смеси реассортантов в куриных эмбрионах методом предельных разведений, и вакцинный реассортант наследует гены, кодирующие внутренние белки вируса, от какого-то одного клона, содержащегося в гетерогенной популяции донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Некоторые клоны из этой популяции близки по набору мутаций к гиператтенуированному донору аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2), ранее используемому при подготовке живой гриппозной вакцины для детей [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.]. Так как "детские" вакцинные штаммы, подготовленные на этом доноре, являлись низкоиммуногенными для взрослых людей, то существует вероятность того, что вакцинный штамм, унаследовавший внутренние гены от клона из популяции донора А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), который близок по набору мутаций донору А/Ленинград/134/47/57 (H2N2), также окажется низкоиммуногенным. Таким образом, используя в качестве донора аттенуации гетерогенный А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), невозможно заранее предугадать, какой из клонов передаст в геном вакцинного штамма гены, кодирующие внутренние белки вируса. Поэтому для получения вакцинного штамма А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) необходимо было иметь в качестве донора аттенуации чистый клон из популяции донора А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Клон А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) был получен с помощью клонирования донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) в развивающихся куриных эмбрионах и содержит 7 мутаций во внутренних генах: РВ2 (Val-478-Leu), РВ1 (Lys-265-Asn и Val-591-Ile), PA (Leu-28-Pro и Val-341-Leu), M1 (Ile-15-Val) и NS2 (Met-100-Ile). У клона А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) отсутствует мутация в гене М2 (Ala-86-Thr), свойственная части популяции донора А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Клон А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) был изолирован из популяции донора А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), который является аттенуированным для людей, так как обладает свойствами температурочувствительности и холодоадаптированности. Полученный нами клонированный донор аттенуации А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) также обладает признаками температурочувствительности и холодоадаптированности. Поэтому клонированный донор также должен быть аттенуированным для человека.

Пример выполнения

Клон А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) был получен в результате двукратного клонирования донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) предельными разведениями от 10 ^-7 до 10^-10 в развивающихся куриных эмбрионах. Каждым разведением вируса было заражено по 20 куриных эмбрионов. Аллантоисную жидкость единственного положительного в реакции гемагглютинации эмбриона, зараженного разведением вируса 10^-9, использовали для второго раунда клонирования. После второго раунда клонирования был выбран клон К7, также полученный из разведения 10^-9.

Клонированный донор аттенуации А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) характеризовался признаками температурочувствительности и холодоадаптированности, характерными для неклонированного донора А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Он обладал пониженным уровнем репродукции в куриных эмбрионах при 40°С (RCT₄₀, разница в активностях репродукции клона при 33 и 40°С составляла 7,7 Ig ЭИД ₅₀/0,2 мл) и активно размножался при температуре 25°С (RCT₂₅, разница в репродукциях при 32 и 25°С составляла 2,9 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл). Таким образом по этим двум признакам клонированный вирус не отличался от неклонированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (таблица 1).

Аттенуацию клонированного донора оценивали по интенсивности его репродукции в респираторном тракте (носовых ходах и легких) хорьков в сравнении с неклонированным донором А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и вирусом «дикого» типа А/Ленинград/134/57 (H2N2). Репродукция в носовых ходах хорьков всех исследованных вирусов колебалась в пределах 3,2-5,6 Ig ЭИД₅₀ /мл/г. «Дикий» вирус активно репродуцировался в легких. Отмечен сниженный уровень репродукции в легких хорьков неклонированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) по сравнению с «диким» вирусом (1,7-1,8 Ig ЭИД₅₀/мл/г против 3,9-4,1 Ig ЭИД₅₀/мл/г соответственно). Клонированный донор А/Ленинград/134/17/К757 (H2N2) из легких хорьков не выделялся вообще, что свидетельствовало о его высокой аттенуации для хорьков (таблица 1).

На фиг.1 представлен ПЦР-рестрикционный анализ ДНК-фрагментов М2 гена А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) и его «дикого» предшественника - вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2). 1-я дорожка - ДНК маркер молекулярного веса IX; 2-я, 4-я и 6-я дорожки - А/Ленинград/134/57 (H2N2); 3-я, 5-я и 7-я дорожки - клон А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2); 8-я дорожка - неклонированный донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), 9-я дорожка-донор аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2). Видно, что обработанная рестриктазой Fok I ДНК-копия М2 гена вируса А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) имеет дополнительную полосу, характерную для «дикого» вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2) (8-я дорожка), что подтверждает данные литературы о гетерогенности неклонированного донора в этой позиции М2 гена.

В таблице 2 представлены результаты анализа всех значащих мутаций в геноме нового клонированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) в сравнении с неклонированными донорами А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) и их «диким» предшественником - вирусом А/Ленинград/134/57 (H2N2).

Таким образом, установлено, что заявляемый донор аттенуации имеет семь значащих мутаций во внутренних генах: РВ2 (Val-478-Leu), РВ1 (Lys-265-Asn и Val-591-Ile), PA (Leu-28-Pro и Val-341-Leu), M1 (Ile-15-Val) и NS2 (Met-100-Ile).

Вакцинный штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Калифорния/7/04 (H3N2) с клонированным холодоадаптированным температурочувствительным донором аттенуации А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) с последующей селекцией при пониженной до 25°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации.

Вакцинный штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33 и 40°С составляет 7,5 Ig ЭИД ₅₀/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33 и 25°С равна 3,5 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл).

Ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА идентичен вирусу А/Калифорния/7/04 (H3N2), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется.

Методом рестрикционного анализа ДНК копий генов установлено, что вакцинный штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) унаследовал семь генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, NA, M, NS) и поверхностный белок нейраминидазу (NA), - от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2). Рестрикционный метод основан на ДНК амплификации участков РНК длиной около 150-300 нуклеотидов, включающих уникальные нуклеотидные последовательности, характерные только для донора аттенуации, но не для современных эпидемических вирусов гриппа [Киселева И.В., Климов А.И. Анализ мутаций в геноме холодоадаптированных штаммов вируса гриппа А с использованием расширенной модификации ПЦР-рестрикционного метода // Вопросы вирусологии. - 2002. - №6. - С.24-26]. Обработка амплифицированных фрагментов ДНК специфическими рестриктазами с последующим электрофорезом обработанных рестриктазами фрагментов ДНК в 1,7%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидиума бромида, позволяет четко дифференцировать принадлежность генов исследуемых реассортантных штаммов к эпидемическому вирусу или донору аттенуации.

На фиг.2 в качестве примера представлена рестрикция ДНК-копии фрагмента гена РВ2 эндонуклеазой Mse I. 1-я дорожка - ДНК маркер молекулярного веса; 2-я, 5-я и 8-я дорожки - донор аттенуации; 3-я и 7-я дорожки - эпидемический вирус А/Калифорния/7/04 (H3N2); 4-я и 6-я дорожки - кандидат в вакцинные штаммы А/17/Калифорния/04/6 (H3N2). В РВ2 гене донора аттенуации в позиции нуклеотида 1459 имеется замена G T по сравнению с современными эпидемическими штаммами, приведшая к аминокислотной замене валина эпидемических вирусов на лейцин у донора аттенуации. Донор аттенуации имеет на этом участке сайт рестрикции для экзогенной рестриктазы Mse I. У эпидемических вирусов этот рестрикционный сайт отсутствует. Таким образом, обработка всех исследуемых фрагментов ДНК данным ферментом приводит к разрезанию амплифицированного участка гена РВ2 длиной 240 нуклеотидов на два более мелких фрагмента (85 и 155 нуклеотидов), если он происходит от донора аттенуации. В случае РВ2 гена от эпидемического вируса расщепления не происходит.

Результаты рестрикционного анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) представлены в таблице 3.

Таким образом, представленный вакцинный штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Калифорния/7/04 (H3N2), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33-34°С в течение 48 часов - 8,0 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:1024.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Пример получения вакцинного штамма А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) представлен в прилагаемом паспорте.

ПАСПОРТ ШТАММА

1. Название штамма - А/17/Калифорния/04/6 (H3N2).

2. Серия - серия 1.

3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:

а) эпидемический вирус - А/Калифорния/7/04 (H3N2);

б) донор аттенуации - А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2);

4. Количество пассажей - 5 в процессе реассортации.

5. Характеристика штамма:

а) оптимальные условия репродукции - 33°С, 48 часов;

б) гемагглютинирующая активность - 1:1024;

в) инфекционная активность - 8,0 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл;

г) чувствительность к ингибиторам - ингибиторочувствительный в РТГА с нормальной лошадиной сывороткой;

д) разность в показателях инфекционной активности при 33 и 40°С - 7,5 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл;

е) разность в показателях инфекционной активности при 33 и 25°С - 3,5 Ig ЭИД ₅₀/0,2 мл;

ж) структура генома реассортанта:

- гены от эпидемического вируса - НА;

- гены от донора аттенуации - РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS, NA.

6) Характеристика штамма после лиофилизации:

а) дата лиофилизации - 11.04.2005;

б) объем материала в ампуле - 1,0 мл;

в) количество доз в ампуле - 4;

г) инфекционная активность - 7,5 Ig ЭИД ₅₀/0,2 мл;

д) гемагглютинирующая активность - 1:256.

7. Рекомендуемое разведение при вакцинации - 1:2.

8. Антигенная специфичность:

а) гемагглютинина - идентичен вирусу А/Калифорния/7/04 (H3N2) по данным РТГА с иммунной крысиной антисывороткой;

б) нейраминидазы - идентична вирусу А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) по данным ПЦР-рестрикционного анализа ДНК-копий генов.

9. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении - безвреден.

10. Бактериологический контроль:

дата проведения - 04.04.2005 г.;

результат - стерилен.

11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов - посторонние вирусы отсутствуют.

ШТАММ А/17/КАЛИФОРНИЯ/04/6 (H3N2) АРЕАКТОГЕНЕН И ИММУНОГЕНЕН ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ ЛИЦ

Пример 1. При вакцинации 51 взрослого человека интраназально реассортантным вакцинным штаммом А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) с инфекционной активностью 7,5 Ig ЭИД₅₀/0,2 мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°С не наблюдалось. Слабые температурные реакции (до 37,5°С) наблюдались в 1,96% случаев. Средние температурные реакции с кратковременным повышением температуры в диапозоне 37,6-38,5°С наблюдались также в 1,96% случаев. Катаральные явления отмечены в 7,84% случаев. Результаты обследования приведены в таблице 4.

В получившей плацебо группе из 48 лиц температурные реакции не наблюдались. Катаральные явления отмечены в 2,08% случаев.

Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 1,96%.

При изучении в реакции РТГА сывороток крови 26 серонегативных вакцинированных лиц был обнаружен 4-кратный и более прирост сывороточных антител к эпидемическому штамму А/Калифорния/7/04 (H3N2) в 50% случаев. Средние геометрические титры антител во вторых сыворотках у лиц с 4-кратными и более приростами антител составили 1:34,09. Результаты серологического исследования приведены в таблице 5.

Таким образом, испытания на волонтерах подтвердили, что вакцинный штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) по показателям реактогенности и иммуногенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 от 26.03.2003 г. на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.

ШТАММ А/17/КАЛИФОРНИЯ/04/6 (H3N2) АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ДЕТЕЙ 3-14 ЛЕТ

До 2004 г. реассортантные вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для детей и для взрослых готовили на двух разных донорах аттенуации. Вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для взрослых готовили на доноре аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.], а вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для детей - на более аттенуированном доноре А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.]. В 2003 г. Комитет медицинских иммунобиологических препаратов счел целесообразным рекомендовать «Вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую для взрослых» для иммунизации детей в возрасте 3-6 лет с внесением соответствующих изменений в «Инструкцию по применению» препарата [Инструкция по применению вакцины гриппозной аллантоисной интраназальной живой сухой. - Утверждена Главным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 16.06.2004 г.].

В этой связи нами была изучена реактогенность вакцинного штамма А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) на детях.

Пример 2. Группу из 67 детей в возрасте 3-14 лет вакцинировали интраназально в объеме 0,5 мл реассортантным вакцинным штаммом А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) с инфекционной активностью 7,5 Ig ЭИД₅₀/мл в разведении 1:2. Группа детей того же возраста из 30 человек получила плацебо. Результаты исследований приведены в таблице 6.

В группе вакцинированных детей сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С не наблюдались. Средние реакции с кратковременным повышением температуры до 37,6-38,5°С наблюдались в 1,5% случаев. Слабые температурные реакции в диапазоне до 37,5°С также были отмечены в 1,5% случаев. Признаки интоксикации (головная боль) наблюдались у 3,0% привитых. Катаральные явления отмечены в 4,5% случаев.

В группе детей, получивших плацебо, отмечены слабые температурные реакции (до 37,5°С) в 3,3% случаев. Признаки интоксикации (головная боль) наблюдались в 3,3% случаев. Катаральные явления отмечены у 6,7%.

Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 1,5%.

Испытания на волонтерах подтвердили, что вакцинный штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) по показателям реактогенности и иммуногенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 от 26.03.2003 г. на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.

На основе вышесказанного предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста, что подтверждают результаты изучения его реактогенности для разных возрастных групп.

Таблица 1. Фенотипическая характеристика неклонированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Лен/17) и клонированного донора А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) (К7) в сравнении с вирусом «дикого» типа А/Ленинград/134/57 (H2N2) (Лен/wt)
Вирусы	Показатели репродукции в РКЭ (Ig ЭИД 50/мл)		Титр вируса (Ig ЭИД 50/мл/г) в органах респираторного тракта хорьков 1		Фенотип
	RCT25	RCT 40	носовые ходы	легкие
Лен/wt	7,7	3,0	3,2; 4,0	3,9; 4,1	non-ca, non-ts, non-att
Лен/17	2,9	7,9	3,3; 4,0	1,7; 1,8	ca, ts, att
К7	2,9	7,7	5,6; 5,3	0	ca, ts, att
1 Представлены результаты, полученные при заражении двух хорьков.

Таблица 2. Кодирующие мутации во внутренних генах неклонированных доноров аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Н2N2) (Лен/17) и А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) (Лен/47) и клонированного нового донора А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2) (К7) в сравнении с вирусом «дикого» типа А/Ленинград/134/57 (H2N2) (Лен/wt)
Гены	Нуклеотидные замены					Аминокислотные замены
	Лен/wt	Лен/17	К7	Лен/47	Позиция	Лен/wt	Лен/17	K7	Лен/47
РВ2	GTA	ТТА	ТТА	ТТА	1459	Val	Val-478-Leu	Val-478-Leu	Val-478-Leu
	AGC	AGC	AGC	АСА	1497	Ser	Ser	Ser	Ser-490-Arg
РВ1	AAG	ААТ	ААТ	ААТ	819	Lys	Lys-265-Asn	Lys-265-Asn	Lys-265-Asn
	ATG	ATG/АТТ	ATG	АТТ	*975	Met	Met/Met-317-Ile	Met	Met-317-Ile
	GTT	АТТ	АТТ	АТТ	1795	Val	Val-591-Ile	Val-591-Ile	Val-591-Ile
РА	СТС	CCG	CCG	CCG	107	Leu	Leu-28-Pro	Leu-28-Pro	Leu-28-Pro
	GTA	ТТА	ТТА	ТТА	1045	Val	Val-341-Leu	Val-341-Leu	Val-341-Leu
NP	СТА	СТА/АТА	СТА	АТА	*1056	Leu	Leu/Leu-341-Ile	Leu	Leu-341-lie
М1	АТС	GTC	GTC	GTC	68	Ile	Ile-15-Val	Ile-15-Val	Ile-15-Val
М2	GCT	ACT/GCT	GCT	ACT	*969	Ala	Ala-86-Thr/Ala	Ala	Ala-86-Thr
NS2	ATG	АТА	АТА	АТА	798	Met	Met-100-Ile	Met-100-Ile	Met-100-Ile
* Популяция донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) гетерогенна в этой позиции нуклеотида.

Таблица 3. Перечень праймеров и рестриктаз, использованных для изучения состава генома реассортантного вакцинного штамма А/17/Калифорния/04/6 (H3N2), полученного на основе эпидемического вируса А/Калифорния/7/04 (H3N2) и клонированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2)
Ген	Рестриктаза	Длина амплифицированного участка ДНК и его фрагментов, разрезанных соответствующей рестриктазой	Название и нуклеотидная последовательность праймеров (F - прямой праймер; R - обратный праймер)		Рестрикция
					ЭВ	ДО	ВШ
РВ2	Mse I	240 (85, 155)	PB2F-1374 PB2R-1614	5' GGGAATTGAACATATCGA	нет	да	да
				5' TATTGTCAGTTTCTCTGT
РВ1	Hind III	304 (77, 227)	PB1F-740 PB1R-1044	5' GAGCAATTGCAACACCCG	да	нет	нет
				5' TGCGATGCTCAGGACGTT
РА	Vsp I	177 (33, 144)	PAF-900 PAR-1077а	5' TGAGGACCCAAGTCACGA	нет	да	да
				5' CTCATTCTCAATGTCCTGCAGTTCTGCCATTA
NP	Eco R I	314 (27, 287)	NPF-886 NPR-1200	5' TATGGACCTGCCGTAGCC	нет	да	да
				5' GTACCTGCTTCTCAGTTC
NA	Mse I	761 (115,281,365)	NAF-14 NAR-775	5' AAGATGAATCCAAATCAA	нет	да	да
				5' AGTATCGGCTCTTCCTGATGC
М	Tsp 509 I	216(79,137)	MF-785 MR-1001	5' CCCTCTTGTTGTTGCCGC	нет	да	да
				5' CAGCTCTATGCTGACAAA
NS	Cac 8 I	217 (92, 125)	NSF-673 NSR-890	5' CAAAACAGAAACGGAAAA	да	нет	нет
				5' AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTATCATTAA
Обозначения: ЭВ - эпидемический вирус А/Калифорния/7/04 (H3N2), ДО - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/К7/57 (H2N2), ВШ - вакцинный штамм А/17/Калифорния/04/6 (H3N2); «да» - амплифицированная ДНК копия фрагмента РНК режется, «нет» - не режется соответствующим ферментом.

Таблица 6. Реактогенность вакцинного штамма А/17/Калифорния/04/6 (H3N2) для детей 3-14 лет
Препарат	Число обследуемых	Показатель	Температурные реакции				Интоксикация (головная боль)	Катаральные явления в носоглотке	*Показатель реактогенности, %
			Слабые (37,1-37,5°С)	Средние (37,6-38,4°С)	Сильные ( 38,5°С)	ВСЕГО
Вакцина	67	абс.ч. %	1	1	0	2	2	3	1,5
			1,5	1,5	0	3,0	3,0	4,5
Плацебо	30	абс.ч. %	1	0	0	1	1	2
			3,3	0	0	3,3	3,3	6,7
* Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо).