иммобилизованный биокатализатор для биологической очистки жиросодержащих сточных вод и способ его получения

Формула изобретения

1. Иммобилизованный биокатализатор для очистки жиросодержащих сточных вод, содержащий биомассу микроорганизмов-продуцентов внеклеточных липаз, полимерный носитель на основе поливинилового спирта (ПВС) и водную фазу, отличающийся тем, что в качестве биомассы иммобилизованный биокатализатор содержит клетки мицелиального гриба, а в качестве полимерного носителя - криогель ПВС при следующем соотношении компонентов, мас.%:

клетки мицелиального гриба	3,3-17,0 (по сухой массе)
криогель ПВС	0,9-6,7 (в расчете на сухой ПВС)
водная фаза	до 100

2. Способ получения иммобилизованного биокатализатора по п.1, характеризующийся тем, что смешивают суспензию мицелиального гриба-продуцента внеклеточных липаз в концентрации 4·10 ⁶ - 4·10⁷спор/мл с раствором поливинилового спирта, получают на их основе криогель ПВС с последующим формированием активного биокатализатора путем проращивания спор в массе полимерного носителя в течение 10-100 ч в питательной среде, содержащей индуктор(ы) биосинтеза секретируемых липаз в концентрации 0,05-25 г/л, до конечного соотношения компонентов, мас.%:

клетки мицелиального гриба	3,3-17,0 (по сухой массе)
криогель ПВС	0,9-6,7 (в расчете на сухой ПВС)
водная фаза	до 100

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к иммобилизованным биокатализаторам на основе клеток грибов, включенных в матрицу гелевого носителя, с помощью которых осуществляют биологическую очистку жиросодержащих сточных вод предприятий пищевой промышленности.

Проблема очистки масло- и жиросодержащих сточных вод предприятий пищевой промышленности (мясоперерабатывающих заводов, молокозаводов, жирокомбинатов, а также предприятий общественного питания) стоит весьма остро, так как сточные воды целого ряда производств в зависимости от технологических стадий содержат в своем составе значительные количества жировых примесей (до 21 г/л) [В.Х.Паронян, Ф.И.Мазняк, Н.М.Кафиев, И.Б.Чекмарева. Технология жиров и жирозаменителей // М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1982, 352 с.].

Для очистки жиросодержащих сточных вод широко применяются комбинированные физико-химические способы, основанные на последовательном использовании методов физического отделения всплывающих (флотирующих) жиросодержащих примесей и химической (реагентной) обработки сточных вод. В качестве реагентов применяют соли металлов, известь, гидроокись натрия, азотную кислоту и др., а также коагулянты, способствующие образованию осадка, который отделяют от сточных вод [Патент РФ №2042642 (1995). Способ очистки сточных вод меховой и мясомолочной промышленности; Патент РФ №2228301 (2001). Способ очистки масло- и жиросодержащих сточных вод; Патент РФ №2093476 (1996). Способ очистки сточных вод, содержащих масла и жиры; JP 2005066502 (2005) Waste liquid treating agent].

Несмотря на эффективное удаление жиров (до 95%), эти способы очистки жиросодержащих сточных вод характеризуются большими расходами дорогостоящих, дефицитных и химически агрессивных реагентов, сложностью их дозировки, образованием осадка с высокой влажностью, который подлежит удалению из реактора, не всегда поддается последующей биологической деградации из-за высокого содержания солей металлов (алюминия, железа, хрома) и требует дополнительной стадии обезвоживания перед захоронением, что создает серьезные технологические и экологические проблемы. К тому же, все эти способы рассчитаны на очистку сточных вод, содержащих максимально 1 г/л жиров, хотя в реальных условиях концентрации жиров в стоках пищевых предприятий существенно выше.

Наиболее эффективным способом очистки сточных вод является биологический, основанный на использовании биокатализаторов, способных осуществлять разложение присутствующих в сточных водах эмульгированных жиров, отделение которых физическими методами невозможно или малоэффективно.

Так, для очистки жиросодержащих сточных вод предприятий пищевой промышленности разработаны биокатализаторы на основе липаз различных микроорганизмов (бактерий, дрожжей, грибов), иммобилизованных на разных носителях ковалентным методом [JP 2005137979 (2005) Oil and fatcontaining waste water treatment apparatus for grease trap, and grease trap; V.M.Balcao, A.L.Paova, F.X.Malcata, Bioreactors with immobilized lipases: state of the art. II Enzyme Microb. Technol., 1996, V.18, p.392-416; W.Kaewthong, S.Sirisansaneeyakul, P.Prasertsan, A.H.Kittikun, Continuous production of monoacylglycerols by glycerolysis of palm olein with immobilized lipase. // Process Biochem., 2005, V.40, p.1525-1530]. У всех этих биокатализаторов есть общие недостатки, которые состоят в том, что:

- требуются выделение и очистка фермента перед его иммобилизацией, что увеличивает стоимость самого биокатализатора;

- регенерация такого биокатализатора не возможна;

- биокатализаторы обладают низкой эффективностью действия (гидролиз ˜20,7% жиров при 45°С за 24 ч), обусловленной серьезными диффузионными проблемами для гидрофобного субстрата и его недоступностью для фермента в матрице носителя.

Наиболее перспективными для обработки сточных вод являются биокатализаторы на основе клеток микроорганизмов, которые могут осуществлять гидролиз эмульгированных жиров за счет секретируемых ими липаз и одновременно утилизировать продукты гидролиза в качестве основного источника углерода и энергии, обеспечивающего высокий уровень жизнеспособности клеток [R.Lanciotti, A.Gianotti, D.Baldi, R.Angrisani, G.Suzzi, D.Mastrocola, M.E.Guerzoni, Use of Yarrowia lipolytica strains for the treatment of olive mill wastewater. // Bioresource Technology, 2005, V.96, p.317-322; P.Becker, D.Köster, M.N.Popov, S.Markossian, G.Antranikian, H.Märkl, The biodegradation of olive oil and the treatment of lipid-rich wool scouring wastewater under aerobic thermophilic conditions. // Water Research, 1999, V.33, p.653-660]. Таким образом, биокатализаторами для очистки жиросодержащих сточных вод являются продуценты липаз - клетки микроорганизмов, которые вносят в сточные воды и осуществляют обычный процесс культивирования клеток, используя сточные воды в качестве среды культивирования. При этом с помощью подобных биокатализаторов из сточных вод могут быть удалены не только жиры, но и продукты их гидролиза, в частности жирные кислоты.

Так, с помощью биокатализатора, представляющего собой дрожжи Yarrowia lipolytica, уровень химического потребления кислорода (ХПК), характеризующего содержание всех органических загрязнений в жиросодержащих сточных водах, может быть снижен максимально на 41,2% при 25°С в течение 72 ч, а использование биокатализатора в виде свободных клеток Acinetobacter sp. обеспечивает 60-65% удаление жиров и продуктов их гидролиза при их исходной концентрации 8 г/л за 48 ч [N.G.Wakelin, C.F.Forster, An investigation into microbial removal of fats, oils and greases. // Bioresource Technology, 1997, V.59, p.37-43].

Недостатками таких биокатализаторов является активный рост и постоянно накапливающаяся биомасса клеток, которую необходимо постоянно отделять от сточных вод, применяя различные дополнительные технологические стадии и специальное оборудование (фильтрующие установки с высокопрочными полимерными пористыми (2 нм ÷ 2 мкм) мембранами и решая вопросы утилизации отсепарированной биомассы [JP 2004358372 (2004) Method of treating grease-trap waste solution].

В том случае, когда биокатализатор представляет собой смешанную культуру, приготовленную на основе разных штаммов бактерий [Патент РФ №216195 (2001) Биотехнологический способ очистки сточных вод от пищевых масел и жиров; W.Mongkolthanaruk, S.Dharmsthiti, Biodegradation of lipid-rich wastewater by a mixed bacterial consortium. // Intern. Biodeterioration & Biodegradation, 2002, V.50, p.101-105], возникает дополнительная серьезная проблема, связанная с необходимостью контроля и поддержания постоянного состава такой ассоциации клеток в процессе использования подобного биокатализатора. При этом существенной проблемой в этом случае (как и в случае использования индивидуальных культур для очистки жиросодержащих сточных вод) является недостаточная продолжительность активного функционирования свободных клеток и их лизис после нескольких рабочих циклов. К тому же, требования к условиям проведения гидролиза жиров в составе сточных вод, как правило, довольно жесткие, например, рН только 7,0, тогда как рН реальных сточных вод может варьироваться в широких пределах (рН 5,5-8,0). В этом случае требуется дополнительное введение агентов, например 6%-ного раствора аммиака, для поддержания постоянного значения рН сточных вод.

Иммобилизация микробных клеток способствует повышению их стабильности к воздействию различных факторов и увеличению длительности использования биомассы для очистки жиросодержащих сточных вод. При этом используются разные способы получения иммобилизованных биокатализаторов.

Известны иммобилизованные биокатализаторы для биологической очистки жиросодержащих сточных вод, основанные на использовании адсорбционно закрепленного на твердом носителе (щебне, гравии, керамзите, пластмассе, асбестоцементе и др.) активного ила, представляющего собой сложную по составу биологическую систему [Л.Ю.Кошкина, Ф.С.Сироткин, Ю.М.Куликов, А.Н.Набаткин, Т.А.Важарова, Г.И.Шагинурова. Комплексная технология очистки промышленных сточных вод, содержащих жиры и СПАВ. // Хим. пром., 2001, №7, С.5-8; G.Nakhla, V.Liu, A.Bassi, Kinetic modeling of aerobic biodegradation of high oil and grease rendering wastewater. // Bioresource Technol., 2006, V.97, p.131-139]. Способ получения такого рода иммобилизованных биокатализаторов предусматривает загрузку твердого носителя в реактор и пропускание через него суспензии клеток. В результате на поверхности частиц носителя нарастает биологическая пленка, представляющая собой ассоциацию микроорганизмов, простейших и более высокоорганизованных животных (активный ил). Очистка сточных вод, протекающих через реактор, происходит в результате их контакта с пленкой и диффузии жиросодержащих загрязнений из сточной воды в биопленку.

Основным недостатком подобных иммобилизованных биокатализаторов на основе активного ила является крайне низкая скорость биодеградации жиросодержащих загрязнений сточных вод (удаление 6-8 г/л жировых включений за 4-5 сут), обусловленная низкими скоростями диффузии субстрата к иммобилизованным клеткам, а также низкими скоростями конверсии жиров под действием самих клеток.

Известен иммобилизованный биокатализатор для очистки жиросодержащих сточных вод, основанный на использовании активного ила и пенополиуретанового носителя [T.Matsui, A.Miura, T.Iiyama, N.Shinzato, H.Matsuda, K.Fuhashi, Effect of fatty oil dispersion on oil-containing wastewater treatment. // J. Hazardous Materials B, 2005, V.118, p.255-258]. Способ получения такого иммобилизованного биокатализатора включает пропускание суспензии клеток активного ила в течение 7 сут в замкнутом цикле через реактор с пенополиуретановым носителем. В результате активный ил внедряется (иммобилизуется) в поры носителя и далее используется для биодеградации жировых компонентов сточных вод (концентрация жиров в среднем 0,8 г/л).

Несмотря на возможность использования такого иммобилизованного биокатализатора в течение длительного времени (до 100 суток), главным его недостатком является необходимость постоянного введения в сточные воды эмульгаторов (анионных детергентов) в концентрации 10 г/л, способствующих образованию именно мелкодисперсных эмульсий жиров с размером частиц не более 100 мкм и их проникновению в поры носителя к поверхности клеток. Увеличение размера жировых частиц, по данным самих разработчиков, приводит к тому, что поры носителя забиваются и эффективность процесса резко падает.

Использование индивидуальных микроорганизмов, секретирующих внеклеточные липазы, при получении иммобилизованных биокатализаторов, предназначенных для очистки жиросодержащих сточных вод, является наиболее целесообразным, так как в этом случае отпадает необходимость контроля сложного микробного состава биокатализатора, как, например, в случае активного ила.

В частности, известен иммобилизованный биокатализатор на основе клеток активного термофильного продуцента внеклеточных липаз - мицелиального гриба Mucor miehei [Т.Ш.Мирзаев, А.С.Саттаров, К.Д.Давранов. Получение и применение иммобилизованных клеток гриба Mucor miehei. // Хим. природн. соед., 2000. №4, с.329-330], закрепленного в пленке из поливинилового спирта (ПВС). Способ получения такого биокатализатора предусматривает следующие стадии: а) покрытие внутренней поверхности колонного реактора пленкой, которая служит далее сорбентом для иммобилизации мицелия гриба; б) пропускание суспензии спор микроорганизма через реактор с пленочным носителем, при этом споры адсорбируются на поверхности полимерной пленки; в) подачу в реактор питательной среды для проращивания спор и роста мицелия на поверхности адсорбента при 40-42°С и постоянной аэрации в течение 4 суток, что завершает операции по формированию иммобилизованного биокатализатора. Очистку сточных вод осуществляют путем прокачивания стоков с жиросодержащими отходами при 40°С через реактор с иммобилизованным биокатализатором, при этом в сточные воды вводится органоминеральная подпитка следующего состава (г/л): экстракт солодовых ростков - 7,0; хлопковое масло - 0,7; (NH₄)₂SO ₄ - 0,3; СаСО₃ - 0,1. Такой иммобилизованный биокатализатор в условиях постоянной минеральной подпитки остается функционально активным в течение 30 суток и способен осуществлять гидролиз жиров в сточных водах при их концентрации 1,0-1,5 г/л (степень гидролиза не указывается).

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по типу используемого микроорганизма (мицелиальный гриб), по химической природе полимерной основы носителя (ПВС) и по последовательности операций при формировании биокатализатора принято за прототип.

Указанный иммобилизованный биокатализатор и способ его получения обладают рядом недостатков:

- иммобилизация клеток мицелиального гриба адсорбцией на полимерной пленке приводит к тому, что мицелий, непрочно закрепленный на поверхности носителя, частично смывается в процессе обработки сточных вод и выносится потоком из реактора, загрязняя тем самым сами сточные воды биомассой;

- для поддержания жизнеспособности иммобилизованных клеток требуется дополнительное введение в сточные воды органоминеральных компонентов, что удорожает процесс очистки и дополнительно загрязняет соответствующие сточные воды (жиры удаляются, а солевые компоненты добавляются);

- для эффективной работы иммобилизованного биоктализатора необходимо использование повышенной температуры (40-42°С), что увеличивает энергозатраты процесса в целом;

- биокатализатор обеспечивает очистку сточных вод лишь с достаточно низким содержанием жиров (не более 1,5 г/л).

Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного иммобилизованного биокатализатора для очистки жиросодержащих сточных вод и способа получения такого биокатализатора.

Поставленная задача решается тем, что иммобилизованный биокатализатор для обработки жиросодержащих сточных вод содержит биомассу микроорганизмов - продуцентов внеклеточных липаз, полимерный носитель на основе поливинилового спирта (ПВС) и водную фазу, причем в качестве биомассы иммобилизованный биокатализатор содержит клетки мицелиального гриба, а в качестве полимерного носителя - криогель ПВС при следующем соотношении компонентов (мас.%): клетки мицелиального гриба - 3,3-17,0 (по сухой массе), криогель ПВС - 0,9-6,7 (в расчете на сухой ПВС), водную фазу - до 100 (к общей массе иммобилизованного биокатализатора).

Способ получения такого иммобилизованного биокатализатора предусматривает включение спор мицелиального гриба - продуцента внеклеточных липаз в криогель поливинилового спирта с последующим формированием активного биокатализатора вышеуказанного состава путем проращивания спор в массе полимерного носителя в питательной среде, содержащей индуктор(ы) биосинтеза секретируемых липаз в концентрации от 0,5 до 25 г/л.

Применение полимерного криогеля - гелевого материала, формируемого при замораживании-оттаивании раствора полимерного гелеобразователя [В.И.Лозинский. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Успехи химии, Т.71 (6), с.559-585 (2002)] обусловлено высокой пористостью гелевой матрицы, обеспечивающей незатрудненную диффузию субстратов и продуктов к и от иммобилизованных клеток, а также хорошими эксплуатационными характеристиками материала. Предлагаемое изобретение предусматривает формирование криогеля ПВС с одновременной иммобилизацией спор с последующим формированием активного иммобилизованного биокатализатора в результате проращивания спор и накопления мицелия в массе носителя. При этом концентрации компонентов такого иммобилизованного биокатализатора найдены на основании экспериментальных исследований. Согласно предлагаемому техническому решению, иммобилизованный биокатализатор содержит клетки мицелиального гриба в количестве 3,3-17,0% (по сухой массе), ПВС в количестве 0,9-6,7 мас.% в расчете на сухой вес полимера, а также водную фазу в количестве до 100 мас.% к общей массе биокатализатора.

То, что в состав заявляемого иммобилизованного биокатализатора входит биомасса мицелиальных грибов, способных осуществлять секрецию липолитических ферментов, позволяет проводить гидролиз жиров, присутствующих в сточных водах, а также дает возможность удалять из сточных вод продукты гидролиза - моноглицериды и жирные кислоты, которые используются иммобилизованными клетками гриба в качестве единственного источника углерода. При этом присутствующие в сточных водах жиры служат не только субстратами, гидролизуемыми внеклеточными липазами гриба, но также являются и индукторами синтеза внеклеточных липолитических ферментов. Усваиваемые грибом из сточных вод продукты ферментативного гидролиза позволяют ему длительное время поддерживать активное жизнеспособное состояние.

Способ получения иммобилизованного биокатализатора предполагает первоначальную иммобилизацию спорового материала, получение которого проводится известными микробологическими приемами. Условия достижения стадии споруляции зависят от частных свойств каждого вида мицелиального гриба, используемого для получения биокатализатора. После выращивания проводят смыв спор с поверхности мицелия, используя традиционные микробиологические методы, для получения суспензии спор и ее диспергирования в растворе полимерного гелеобразователя с последующей криогенной обработкой (замораживанием, выдерживанием в замороженном состоянии и оттаиванием) полученной суспензии, что приводит к формированию полимерного криогеля, содержащего включенные в его матрицу споры гриба. Используется известный способ включения микроорганизмов в полимерный носитель на основе криогеля ПВС [Способ получения иммобилизованных клеток микроорганизмов. // А.с. СССР №1400071 (1986); БИ №20 (1988); V.I.Lozinsky, F.M.Plieva. Poly(vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments. // Enzyme Microb. Technol., V.23 (3/4), p.227-242 (1998)], но рабочие режимы для каждого конкретного микроорганизма выбираются на основе экспериментов.

Для получения иммобилизованного биокатализатора в виде гранул могут быть использованы известные криогрануляционные установки [Пат. РФ №2036095 (1992) Устройство для формирования сферических гранул из материала на основе водных систем; Пат. РФ №2104866 (1996). Устройство для формирования гранул].

Формирование активного иммобилизованного биокатализатора осуществляют путем культивирования спор, включенных в полимерный носитель, в среде, содержащей индуктор(ы) внеклеточных липаз. Согласно предлагаемому изобретению, концентрация индуктора(ов) в питательной среде при формировании активного биокатализатора лежит в пределах от 0,5 до 25 г/л. Это позволяет провести проращивание иммобилизованных спор и образование мицелия, активно секретирующего липолитические ферменты и пронизывающего полимерную матрицу по всему ее объему. Состав среды культивирования определяется особенностями микроорганизма, выбранного для получения иммобилизованного биокатализатора, и находится с помощью предварительных экспериментов.

Для проведения очистки жиросодержащих стоков иммобилизованный биокатализатор вносится в реактор с принудительным перемешиванием, где в течение 24 ч при 15-30°С проводится обработка сточных вод.

Такое сочетание признаков, как мицелиальные грибы, обладающие липолитической активностью, и их включение в матрицу полимерного криогеля с целью получения иммобилизованного биокатализатора для очистки жиросодержащих сред, ранее известно не было, что позволяет характеризовать предлагаемое техническое решение как новое.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Иммобилизованный биокатализатор для очистки жиросодержащих сточных вод на основе клеток Rhizopus oryzae, включенных в криогель ПВС.

1000 г 10%-ного раствора ПВС смешивают с 100 мл суспензии спор гриба Rhizopus oryzae с концентрацией 4×10⁶ спор/мл до получения однородной массы, которую используют для получения гранул. Гранулирование проводят с помощью криогрануляционной установки по Пат. РФ №2036095 известным методом: замораживание осуществляют при -20°С, продолжительность выдерживания гранул в замороженном состоянии - 16 ч, оттаивание - при 4°С. Для формирования иммобилизованного мицелия полученные полимерные гранулы с включенными в них спорами переносят в среду, содержащую индуктор биосинтеза секретируемых липаз - оливковое масло (5 г/л), а также кукурузный экстракт (10 г/л), пептон (10 г/л), КН₂PO ₄ (14 г/л), К₂HPO ₄ (2,4 г/л), MgSO₄ (0,4 г/л), и проводят их культивирование при 28°С в течение 100 ч до получения готового биокатализатора, обладающего внеклеточной липолитической активностью (10000 ед/л) и имеющего следующий состав (мас.%): биомасса грибного мицелия - 17% (по сух массе), ПВС - 1%, водная фаза - до 100%.

Гранулы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в реактор (300 г/л), снабженный термостатирующей рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры и заполненный жиросодержащими стоками молокоперерабатывающего производства, содержащими преимущественно сливочное масло в качестве источника жиров, имеющими ХПК, равное 11 г/л, и следующий основной состав (г/л): жиры - 0,2; белки - 0,01; MgCl₂ × 6Н₂O - 0,53; CaSO ₄ × 2Н₂О - 0,17; NH ₄Cl - 1,7; FeCl₃ × 6Н ₂O - 0,25 (рН 5,5). Через 24 ч обработки сточных вод при 28°С в присутствии биокатализатора содержание жиров в сточных водах снижается на 98%, а ХПК - на 77%. Период полуинактивации биокатализатора, то есть период времени, в течение которого уровень внеклеточной липолитической активности иммобилизованных клеток гриба снижается на 50%, составляет 42 сут при его непрерывном использовании в периодических условиях для обработки указанных сточных вод.

Пример 2. Иммобилизованный биокатализатор для очистки жиросодержащих сточных вод на основе клеток Penicillium roqueforti, включенных в криогель ПВС.

1600 г 20%-ного раствора ПВС смешивают с 200 мл суспензии спор гриба Penicillium roqueforti с концентрацией 1×10⁷ спор/мл до получения однородной массы, которую используют для получения гелевых блоков. Криогенную обработку проводят известным методом: замораживание осуществляют при -18°С, продолжительность выдерживания блоков в замороженном состоянии - 20 ч, оттаивание - при 4°С. Для формирования иммобилизованного мицелия полученные полимерные блоки с включенными в них спорами переносят в среду, содержащую индуктор биосинтеза внеклеточных липаз - подсолнечное масло (10 г/л), а также кукурузный экстракт (5 г/л), пептон (12 г/л), KH₂PO₄ (14 г/л), К₂HPO₄ (2,4 г/л), MgSO₄ (0,4 г/л), и проводят их культивирование при 28°С в течение 40 ч до получения готового биокатализатора, обладающего внеклеточной липолитической активностью (6000 ед/л) и имеющего следующий состав (мас.%): биомасса грибного мицелия - 16,4% (по сухой массе), ПВС - 3,6%, водная фаза - до 100%.

Полученный иммобилизованный биокатализатор помещают в реактор (300 г/л), снабженный термостатирующей рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры и заполненный жиросодержащими стоками мясоперерабатывающего производства, содержащими преимущественно свиной жир в качестве источника жиров, имеющими ХПК, равное 3,3 г/л, и следующий общий состав (г/л): жиры - 0,51, белки - 0,9; MgCl₂ × 6H₂O - 0,5, CaSO₄ × 2H₂ O - 0,5, NH₄Cl - 1,7, FeCl ₃ × 6H₂O - 0,25 (pH 6,75). Через 24 ч обработки сточных вод при 20°С в присутствии биокатализатора содержание жиров в сточных водах снижается на 98%, а ХПК - на 67%. Период полуинактивации биокатализатора составляет 53 сут при его непрерывном использовании в периодических условиях для обработки указанных сточных вод.

Пример 3. Получение иммобилизованного биокатализатора для очистки жиросодержащих сточных вод на основе клеток Rhizopus delemar, включенных в криогель ПВС.

1200 г 15%-ного раствора ПВС смешивают с 150 мл суспензии спор гриба Rhizopus delemar с концентрацией 7×10⁶ спор/мл до получения однородной массы, которую используют для получения гелевых листов, для чего суспензию выливают ровным слоем на противень с высотой бортов 3 см. Криогенную обработку проводят известным методом: замораживание осуществляют при -18°С, продолжительность выдерживания гранул в замороженном состоянии - 24 ч, оттаивание - при 4°С. Для формирования иммобилизованного мицелия гелевый лист с включенными спорами сворачивают в трубку и помещают в колоночный реактор, снабженный термостатирующей рубашкой, системами барботажа и заполненный средой, содержащей индуктор биосинтеза секретируемых липаз - кукурузное масло (7 г/л), а также кукурузный экстракт (40 г/л), твин 80 (10 г/л), пептон (5 г/л), КН₂РО₄ (14 г/л), К₂HPO₄ (2,4 г/л), MgSO₄ (0,4 г/л), и проводят культивирование при 28°С в течение 40 ч до получения готового биокатализатора, обладающего внеклеточной липолитической активностью (6500 ед/л) и имеющего следующий состав (мас.%): биомасса грибного мицелия - 11,2% (по сухой массе), ПВС - 1,8%, водная фаза - до 100%.

Полученный иммобилизованный биокатализатор помещают в реактор (300 г/л), снабженный термостатирующей рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры и заполненный жиросодержащими стоками майонезного производства, содержащими преимущественно майонез в качестве источника жиров, имеющими ХПК, равное 9,6 г/л, и следующий общий состав (г/л): жиры - 21,0, белки - 0,23; MgCl₂ × 6H₂O - 5,1; CaSO₄ × 2Н₂ О - 3,2; NH₄Cl - 2,0; FeCl ₃ × 6Н₂О - 0,2 (рН 5,7). Через 24 ч обработки сточных вод при 30°С в присутствии биокатализатора содержание жиров в сточных водах снижается на 92%, а ХПК - на 74%. Период полуинактивации биокатализатора составляет 48 сут при его непрерывном использовании в периодических условиях для обработки указанных сточных вод.

Пример 4. Иммобилизованный биокатализатор для очистки жиросодержащих сточных вод на основе клеток Mucor lipolyticus, включенных в криогель ПВС.

1200 г 12%-ного раствора ПВС смешивают с 600 мл суспензии спор гриба Mucor lipolyticus с концентрацией 4×10⁷ спор/мл до получения однородной массы, которую используют для получения сферических гранул. Гранулирование проводят с помощью криогрануляционной установки по Пат. РФ №2036095 известным методом: замораживание осуществляют при -18°С, продолжительность выдерживания гранул в замороженном состоянии - 24 ч, оттаивание - при 4°С. Для формирования иммобилизованного мицелия полученные полимерные гранулы с включенными в них спорами переносят в среду, содержащую индуктор биосинтеза секретируемых липаз - рапсовое масло (8 г/л), а также кукурузный экстракт (10 г/л), твин 20 (10 г/л), пептон (10 г/л), КН₂PO ₄ (11 г/л), К₂HPO ₄ (2,5 г/л), MgSO₄ (0,4 г/л), и проводят их культивирование при 28°С в течение 10 ч до получения готового биокатализатора, обладающего внеклеточной липолитической активностью (1300 ед/л) и имеющего следующий состав (мас.%): биомасса грибного мицелия - 3,3% (по сух массе), ПВС - 6,7%, водная фаза - до 100%.

Гранулы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в реактор (300 г/л), снабженный термостатирующей рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры и заполненный жиросодержащими стоками маргаринового производства, содержащими преимущественно маргарин в качестве источника жиров, имеющими ХПК, равное 2,7 г/л, и следующий общий состав (г/л): жиры (в том числе маргарин) - 2,0; белки - 0,001; MgCl ₂ × 6Н₂О - 0,1; CaSO ₄ × 2Н₂O - 0,2; NH ₄Cl - 1,8, FeCl₃ × 6Н ₂О - 0,25 (рН 6,6). Через 24 ч обработки сточных вод при 15°С в присутствии биокатализатора содержание жиров в сточных водах снижается на 95%, а ХПК - на 70,4%. Период полуинактивации биокатализатора составляет 60 сут при его непрерывном использовании в периодических условиях для обработки указанных сточных вод.

Пример 5. Иммобилизованный биокатализатор для очистки жиросодержащих сточных вод на основе клеток Aspergillus niger, включенных в криогель ПВС.

1290 г 14%-ного раствора ПВС смешивают с 110 мл суспензии спор гриба Aspergillus niger с концентрацией 9×10⁵ спор/мл до получения однородной массы, которую используют для получения гранул. Гранулирование проводят с помощью криогрануляционной установки по пат. РФ №2036095 известным методом: замораживание осуществляют при -16°С, продолжительность выдерживания гранул в замороженном состоянии - 48 ч, оттаивание - при 4°С. Для формирования иммобилизованного мицелия полученные полимерные гранулы с включенными в них спорами переносят в среду, содержащую индукторы биосинтеза секретируемых липаз - маргарин (15 г/л) и фосфолипиды (10 г/л), а также кукурузный экстракт (2 г/л), твин 20 (5 г/л), пептон (12 г/л), КН ₂РО₄ (14 г/л), К₂ HPO₄ (2,4 г/л), MgSO₄ (0,4 г/л), и проводят их культивирование при 28°С в течение 45 ч до получения готового биокатализатора, обладающего внеклеточной липолитической активностью (9000 ед/л) и имеющего следующий состав (мас.%): биомасса грибного мицелия - 10,7% (по сухой массе), ПВС - 2,3%, водная фаза - до 100%.

Гранулы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в реактор (300 г/л), снабженный термостатирующей рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры и заполненный жиросодержащими стоками молокоперерабатывающего производства, содержащими преимущественно сметану в качестве источника жиров, имеющими ХПК, равное 8,2 г/л, и следующий общий состав (г/л): жиры - 21,0; белки - 0,49; MgCl₂ × 6H₂O - 5,0; CaSO₄ × 2H₂ O - 3,3; NH₄Cl - 1,5, FeCl ₃ × 6Н₂О - 0,2 (рН 5,8). Через 24 ч обработки сточных вод при 28°С в присутствии биокатализатора содержание жиров в сточных водах снижается на 92%, а ХПК - на 61%. Период полуинактивации биокатализатора составляет 41 сут при его непрерывном использовании в периодических условиях для обработки указанных сточных вод.

Пример 6. Иммобилизованный биокатализатор для очистки жиросодержащих сточных вод на основе клеток Rhizopus arrhizus, включенных в криогель ПВС.

1000 г 11,7%-ного раствора ПВС смешивают с 300 мл суспензии спор гриба Rhizopus arrhizus с концентрацией 4×10⁶ спор/мл до получения однородной массы, которую используют для получения гранул цилиндрической формы, которую получают при заливке приготовленной суспензии в лунки 96-луночных иммунологических плашек с объемом 0,5 мл. Криогенную обработку проводят известным методом: замораживание осуществляют при -22°С, продолжительность выдерживания гранул в замороженном состоянии - 36 ч, оттаивание - при 4°С. Для формирования иммобилизованного мицелия полученные полимерные гранулы с включенными в них спорами переносят в среду, содержащую индуктор биосинтеза секретируемых липаз - маргарин (0,5 г/л), а также кукурузный экстракт (0,5 г/л), твин 80 (10 г/л), пептон (8 г/л), КН₂PO ₄ (12 г/л), К₂HPO ₄ (2,3 г/л), MgSO₄ (0,25 г/л), и проводят их культивирование при 28°С в течение 40 ч до получения готового биокатализатора, обладающего внеклеточной липолитической активностью (11000 ед/л) и имеющего следующий состав (мас.%); биомасса грибного мицелия - 8,1% (по сух массе), ПВС - 0,9%, водная фаза - до 100%.

Гранулы полученного иммобилизованного биокатализатора помещают в реактор (300 г/л), снабженный термостатирующей рубашкой, системами перемешивания, контроля рН и температуры и заполненный жиросодержащими стоками мясоперерабатывающего производства, содержащими преимущественно говяжий жир в качестве основного источника жиров, имеющими ХПК, равное 3,3 г/л, и следующий общий состав (г/л): жиры - 10,5; белки - 1,5; MgCl₂ × 6H₂O - 56,5; CaSO ₄ × H₂O - 6,0; NH ₄Cl - 1,5, FeCl₃ × 6Н ₂O - 0,25 (рН 6,75). Через 24 ч обработки сточных вод при 20°С в присутствии биокатализатора содержание жиров в сточных водах снижается на 94%, а ХПК - на 68%. Период полуинактивации биокатализатора составляет 38 сут при его непрерывном использовании в периодических условиях для обработки указанных сточных вод.

Пример 7. Свойства заявляемых иммобилизованных биокатализаторов для очистки жиросодержащих сточных вод.

На фиг.1 представлены фотографии гранул биокатализатора на основе иммобилизованных клеток гриба R. oryzae, продуцирующего внеклеточные липазы (Пример №1), иллюстрирующие различные стадии получения и использования биокатализатора для обработки жиросодержащих сточных вод.

На фиг.2 представлены результаты испытаний заявляемого иммобилизованного биокатализатора в процессе продолжительной обработки жиросодержащих сточных вод, которые свидетельствуют о том, что длительное время биокатализатор сохраняет способность синтеза и секреции внеклеточных липаз, необходимых для гидролиза жиров при сохранении целостности иммобилизованных клеток.

Данные табл.1, в которой представлены результаты мониторинга внутриклеточной концентрации АТФ, проведенного с помощью люциферин-люциферазного метода, подтверждают высокий уровень жизнеспособности иммобилизованных клеток мицелиальных грибов в процессе их длительного использования для обработки сточных вод. Эти данные подтверждают, что клетки, иммобилизованные согласно заявляемому способу, могут длительное время сохранять высокий уровень метаболической активности без внесения каких-либо минеральных или субстратных добавок в состав сточных вод и использовать при этом для своей жизнедеятельности только компоненты самих сточных вод.

Таким образом, заявляемые иммобилизованный биокатализатор и способ его получения имеют следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом:

1. Заявляемый иммобилизованный биокатализатор содержит мицелий гриба, надежно удерживаемый матрицей носителя, сводя, тем самым, к минимуму вымывание клеток из носителя и загрязнение ими обрабатываемых сточных вод. Кроме того, использование клеток гриба в иммобилизованном состоянии в заявляемом техническом решении позволяет существенно снизить прирост биомассы, как правило, сопровождающий аэробную биодеградацию органических соединений с участием жизнеспособных клеток, и использовать многократно одни и те же клетки микроорганизмов для обработки стоков. В этом случае решение проблемы постоянной утилизации накапливающейся биомассы существенно упрощается.

2. Заявляемый иммобилизованный биокатализатор обладает целевой функциональной активностью без введения каких-либо дополнительных минеральных подпиток в состав сточных вод для длительного сохранения жизнеспособного состояния иммобилизованных клеток и высокоэффективной работы биокатализатора; также не требуется введения в стоки эмульгаторов и флоккулянтов, что свидетельствует о том, что изобретение улучшает экономику и экологию процесса, проводимого с участием биокатализатора.

3. Заявляемый биокатализатор, обладая высокой липолитической активностью, позволяет существенно сократить время, требуемое на высокоэффективное удаление жиров из сточных вод (24 ч против 48 и 72 ч, известных для аналогов), а также увеличить процент снижения ХПК. Биокатализатор может быть применен для обработки сточных вод пищевых предприятий самых разных отраслей пищевой промышленности, в которых содержание жиров может достигать 21 г/л. При этом обработка сточных вод не требует таких повышенных температур, как в прототипе (40°С), и может быть осуществлена при 15-30°С. Период полуинактивации биокатализатора достигает 60 суток, что почти в 2 раза превышает сроки функционирования биокатализаторов-аналогов и прототипа.

Подписи к чертежам:

Фиг.1. Фотографии гранул биокатализатора с иммобилизованными клетками гриба R. oryzae (Пример №1) на разных стадиях его получения: (а) полимерные гранулы с включенными спорами; (б) готовый биокатализатор с иммобилизованным мицелием; (в) биокатализатор после использования в течение 30 сут для обработки жиросодержащих сточных вод молокоперерабатывающего производства.

Фиг.2. Динамика изменения концентрации биомассы иммобилизованных клеток гриба (а) и липолитической активности в среде (б) в процессе обработки жиросодержащих сточных вод предприятий пищевой промышленности: - Пример №1, - Пример №2, - Пример №3, - Пример №4, - Пример №5. Стрелками указано время замены сточных вод в периодическом реакторе с биокатализатором.