пробиотические штаммы lactobacillus (варианты) и их применение

Формула изобретения

1. Штамм бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, обладающий свойствами пробиотика.

2. Штамм бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, обладающий свойствами пробиотика.

3. Штамм бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, обладающий свойствами пробиотика.

4. Штамм бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, обладающий свойствами пробиотика.

5. Штамм бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, обладающий свойствами пробиотика.

6. Штамм бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527, обладающий свойствами пробиотика.

7. Пробиотическая композиция, включающая один или несколько штаммов бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, или бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527, и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.

8. Пробиотическая композиция по п.7, отличающаяся тем, что композиция включает от 10⁵ до 10¹³ КОЕ Lactobacillus на грамм.

9. Пробиотическая композиция по п.7, отличающаяся тем, что композиция включает от 10 ⁶ до 10¹² КОЕ Lactobacillus на грамм.

10. Пробиотическая композиция по п.9, отличающаяся тем, что композиция представлена в виде суспензии, спрея, геля, крема, порошка, капсулы, раствора для орошения, овул, влагалищных свеч, таблеток или микроинкапсулированного продукта.

11. Пробиотическая композиция по п.10, отличающаяся тем, что композиция включает примерно до 10% слизистого адгезивного эксципиента.

12. Пробиотическая композиция по п.11, отличающаяся тем, что слизистый адгезивный эксципиент представляет собой гидроколлоид.

13. Пробиотическая композиция по п.12, отличающаяся тем, что гидроколлоид выбирают из группы, включающей ксантановую камедь, плоды рожкового дерева или альгинат.

14. Пробиотическая композиция по п.13, отличающаяся тем, что гидроколлоид представляет собой ксантановую камедь.

15. Фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения влагалищных инфекций, включающая один или несколько штаммов бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, или бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527, и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.

16. Фармацевтическая композиция по п.15, отличающаяся тем, что композиция является влагалищной композицией и включает субстрат.

17. Фармацевтическая композиция по п.16, отличающаяся тем, что субстрат не ферментирует Candida albicans или грам-отрицательной патогенной бактерией.

18. Фармацевтическая композиция по п.17, отличающаяся тем, что субстрат представляет собой олигосахарид.

19. Фармацевтическая композиция по п.18, отличающаяся тем, что субстрат представляет собой лактит и/или олигофруктозу, и/или лактулозу.

20. Фармацевтическая композиция по п.19, отличающаяся тем, что субстрат представляет собой лактит.

21. Поглощающий продукт, такой как женская гигиеническая прокладка, гигиеническая салфетка, пропитанный тампон, подгузники или защитные подгузники при недержании мочи, включающий поглотитель, где поглотитель содержит один или несколько штаммов бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, или бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527.

22. Поглощающий продукт по п.21, отличающийся тем, что поглотитель включает от 10 ⁵ до 10¹³ КОЕ Lactobacillus на грамм.

23. Поглощающий продукт по п.21, отличающийся тем, что поглотитель включает от 10⁶ до 10¹² КОЕ Lactobacillus на грамм.

24. Молочный продукт, включающий один или несколько штаммов бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, или бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527.

25. Пищевая добавка, включающая один или несколько штаммов бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, или бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527.

26. Продукт функционального питания, включающий один или несколько штаммов бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, или бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527.

27. Применение одного или нескольких штаммов бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, или бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527 для получения фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения влагалищных инфекций.

28. Применение одного или нескольких штаммов бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, или бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527 для получения фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения желудочно-кишечных заболеваний.

29. Применение одного или нескольких штаммов бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, или бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527 для получения фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения инфекций мочевыводящих путей.

30. Применение одного или нескольких штаммов бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, или бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527 для получения поглощающего продукта, такого как женская гигиеническая прокладка, гигиеническая салфетка, пропитанный тампон, подгузники или защитные подгузники при недержании мочи для профилактики и/или лечения влагалищных инфекций.

31. Применение одного или нескольких штаммов бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, или бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527 в качестве лечебного средства.

32. Применение одного или нескольких штаммов бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, или бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527 для получения молочного продукта для профилактики и/или лечения желудочно-кишечных заболеваний.

33. Применение одного или нескольких штаммов бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, или бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527 для получения продукта функционального питания для профилактики или лечения желудочно-кишечных заболеваний.

34. Применение одного или нескольких штаммов бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, или бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527 для получения пищевой добавки для профилактики или лечения желудочно-кишечных заболеваний.

35. Влагалищная композиция для профилактики и/или лечения инфекций мочеполовых путей, включающая один или несколько штаммов бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, или бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527 и субстрат, который не ферментируется Candida albicans или грам-отрицательной патогенной бактерией.

36. Влагалищная композиция по п.35, отличающаяся тем, что субстрат представляет собой олигосахарид.

37. Влагалищная композиция по п.36, отличающаяся тем, что субстрат представляет собой лактит и/или олигофруктозу, и/или лактулозу.

38. Влагалищная композиция по п.37, отличающаяся тем, что субстрат представляет собой лактит.

39. Применение одного или нескольких штаммов бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или бактерий Lactobacillus paracasei DSM 14870, или бактерий Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или бактерий Lactobacillus plantarum DSM 15524, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15526, или бактерий Lactobacillus sp. DSM 15527 и субстрата, который не ферментируется Candida albicans или грам-отрицательной патогенной бактерией, для получения влагалищной композиции.

40. Применение по п.39, где субстрат представляет собой олигосахарид.

41. Применение по п.40, где субстрат представляет собой лактит и/или олигофруктозу, и/или лактозу.

42. Применение по п.41, где субстрат представляет собой лактит.

43. Способ лечения или профилактики микробного дисбаланса у млекопитающих, при котором субъекту вводят эффективное количество бактерий одного или нескольких штаммов Lactobacillus acidophilus DSM 14869, или Lactobacillus paracasei DSM 14870, или Lactobacillus acidophilus DSM 15525, или Lactobacillus plantarum DSM 15524, или Lactobacillus sp. DSM 15526, или Lactobacillus sp. DSM 15527.

Описание изобретения к патенту

2420-230034 RU/012

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новым штаммам Lactobacilli , которые по отдельности или в сочетании могут использоваться в качестве пробиотиков или вместе с пребиотиками в качестве синбиотиков. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, молочным продуктам, функциональным продуктам питания, пищевым добавкам и средствам личной гигиены, включающим штаммы по отдельности или в комбинации, а также применение штамма для профилактики или лечения влагалищных инфекций, мочеполовых инфекций и желудочно-кишечных заболеваний.

Предпосылки создания изобретения

Пробиотики представляют собой живые микроорганизмы или смесь микроорганизмов, вводимых для улучшения микробного баланса пациента, в частности среды желудочно-кишечного тракта и влагалища. Штаммы Lactobacilli использовали для лечения влагалищных инфекций, профилактики диареи, а также для лечения инфекций мочевыводящих путей (Am.J.Health Syst. Pharm., 2001, 58(12); p.1101-1109).

Нормальная флора влагалища главным образом представлена видами Lactobacillus (молочнокислых) бактерий, которые продуцируют вещества, помогающие контролировать рост патогенов. Бактериальный вагиноз (BV) представляет собой клиническое состояние, которое отличается снижением видов Lactobacillus и повышенным ростом анаэробных и микоплазматических бактерий. Бактериальный вагиноз связан с развитием внутритазового воспалительного заболевания и преждевременными родами. В некоторых исследованиях предполагалось, что пациенты с бактериальным вагинозом могут иметь склонность к повышенному риску заражения заболеваниями, передаваемыми половым путем (STD), включая инфицирование вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) (Curr. Infect. Dis. Rep., 2001, Apr. 3(2), 152-155; J.Infect. Dis., 2002, Jan.1; 185(1); 69-73).

Путем введения пробиотических Lactobacilli можно регенерировать флору влагалища у женщин с рецидивными случаями бактериального вагиноза. Бактериальный вагиноз представляет собой одну из наиболее распространенных гинекологических проблем у женщин.

Инфекция влагалища, вызываемая Candida albicans, также является общей гинекологической проблемой у женщин.

Присутствие Lactobacilli важно для поддержания микробной экосистемы кишечника. Показано, что Lactobacilli обладают ингибирующей активностью в отношении роста патогенных бактерий, таких как Listeria monocytogenes, Esherichia coli, Salmonella spp. и других. Такое ингибирование может быть следствием продуцирования ингибирующих соединений, таких как органические кислоты, перекись водорода, бактериоцины или рейтерин, или конкурентного прилипания к эпителию (App.Environ. Microbiol., 1999, 65(11), p.494-4956).

Также было исследовано применение Lactobacilli для лечения инфекций мочевыводящих путей (Am. J. Health Syst.Pharm., 2001, 58(12): p.1101-1109). Например, введение молочнокислых бактерий и стимуляция местных организмов использовались для предотвращения рецидивов инфекций мочевыводящих путей (Microecol Ther.: 32-45). Также была исследована роль Lactobacilli в профилактике мочеполовых и желудочно-кишечных инфекций (Intl. Dairy J., 1998, 8:555-562).

Предшествующий уровень развития данной области

Важность Lactobacilli в качестве пробиотиков описана в литературе.

Jacobsen et al., Applied and Environmental Microbiology (1999), 65, 4949-4956, описали скрининг пробиотической активности среди сорока семи штаммов Lactobacillus spp., с использованием методов in vitro и оценку способности к колонизации у человека пяти выбранных штаммов. Штаммы исследовали на устойчивость к рН 2,5 и 0,3% бычьей желчи (Oxgall), прилипание к Сасо-2 клеткам и противомикробную активность против кишечных патогенных бактерий. Среднее число прилипающих Lactobacilli в 20 микроскопических областях составляло, например, 630±275 для L.Rhamnosus LGG и 713±188 для L.Rhamnosus 19070-2.

В патенте США 5032399 описаны терапевтически благоприятные штаммы L.acidophilus и, в частности, штамм, отличающийся тем, что, как было установлено, в среднем по меньшей мере 50 бактерий прилипает к одной маленькой слизистой клетке кишечника человека в результате пятиминутного инкубирования бактерии с клеткой. Штамм также был охарактеризован в отношении продуцирования молочной кислоты и энергичного роста.

В WO 99/45099 описан новый штамм L.plantarum LB 931. Штамм можно использовать для лечения или профилактики мочеполовых инфекций. Штамм способен хорошо прилипать к эпителиальным клеткам влагалища, а также ингибировать или предотвращать рост различных бактериальных штаммов.

Патент США 5645830 относится к молочнокислым бактериям, снятому молоку, фактору роста молочнокислых бактерий (LGF), композициям молочнокислых бактерий и способам использования композиций для профилактики мочеполовых инфекций. Более конкретно, данное изобретение относится к способности штаммов гидрофобных или гидрофильных молочнокислых бактерий прилипать к биоматериалам и эпителиальным клеткам кишечника, влагалища и мочевыводящих путей, устойчивости к действию некоторых противомикробных агентов и способности доминировать в мочеполовой флоре. Было установлено, что в случае L.caseivar rhamnosus GR-1 в среднем по меньшей мере 64 бактерии могут прилипать к одной эпителиальной клетке мочевыводящих путей, тогда как для L.fermentum B-54 в среднем по меньшей мере 39 бактерий могут прилипать к одной эпителиальной клетке мочевыводящих путей.

В патенте США 6-03394 (WO 98/46261) описаны новые штаммы, например, L.crispatus CTV-05, выделенные из влагалищных мазков. Штамм характеризуется повышенной способностью прилипать к влагалищным эпителиальным клеткам и продуцировать перекись водорода. Установлено, что L.crispatus CTV-05 имеет процентное значение когезии с эпителиальными клетками влагалища (VEC), превышающее 50%. Выражение «процентное значение когезии VEC» определяется как процент клеток VEC, к которым прилипает по крайней мере одна клетка молочнокислых бактерий, из общего числа клеток VEC в идентифицированной группе. Способность данных штаммов вновь образовывать колонию приписывается новой сохраняющей матрице, описанной в данном документе.

В ЕР 0956858 описано применение различных штаммов молочнокислых бактерий по отдельности или в сочетании. Штаммы были выбраны на основании их способности прилипать к клеткам HeLa и продуцировать перекись водорода.

В WO 97/29762 описаны композиции, включающие эффективное количество по крайней мере одного вида растений семейства Ericaceae или его экстракта и культуры по крайней мере одного вида микроинкапсулированных бактерий, выбранных из группы, состоящей из Lactobacillus, Bifidobacterium и их смесей. Композицию можно использовать для профилактики и/или лечения мочеполовых и кишечных нарушений.

В работе Ocana et al., Biocell (2001), 25(3), 265-273 исследована способность Lactobacilli прилипать к влагалищным эпителиальным клеткам (VEC). Lactobacilli, L. crispatus CRL 1266, L. salivarius подвид salivarius CRL 1328, L.acidophilus CRL 1259, L. acidophilus CRL 1294, были выделены из влагалищных мазков человека.

В публикации McLean N.W. et al., J.Med.Microbiol., 2000, 49(6), pp.543-552, были охарактеризованы различные Lactobacilli для того, чтобы оценить их потенциальное применение в качестве пробиотиков посредством исследования их способности прилипать к эпителиальным клеткам влагалища (VEC). Lactobacilli были выделены из влагалищных мазков человека.

Фармацевтические композиции Lactobacilli, известные в данной области, не достаточно эффективны в отношении повторного образования колоний in vivo, т.е. в микробных экосистемах млекопитающих, и, следовательно, сохраняется необходимость в выявлении Lactobacilli, обладающих способностью к реколонизации при введении Lactobacilli в виде фармацевтической композиции, пищевой добавки, молочного продукта, функционального продукта или поглощающего продукта. Lactobacilli, выделенные из человеческих источников, будут обладать лучшей способностью образовывать колонии in vivo после введения благодаря присущей им способности к выживанию в микробной экосистеме человека. Идентификация штаммов Lactobacilli с повышенной способностью к реколонизации при введении часто представляет собой громоздкий процесс, и поэтому важно выбрать лучшие тест-системы для предсказания их способности к повторному образованию колонии in vivo.

Было установлено, что способность Lactobacilli прилипать к эпителиальным клеткам влагалища (VEC), культивированным Сасо-2 клеткам или другим клеточным линиям является важным фактором и служит средством для оценки способности пробиотического штамма к повторной колонизации и участию в образовании барьера для предотвращения колонизации патогенных бактерий.

В литературе наблюдается значительный разброс публикуемых данных по прилипанию пробиотических штаммов. Такой разброс действительно отражает биологические различия между штаммами, но, безусловно, также зависит от экспериментальных условий. Кроме того, также, по-видимому, имеются различия в том каким образом измерять прилипание. В патенте США 6093394 прилипание Lactobacilli определяли посредством подсчета процентного значение когезии VEC. Выражение «процентное значение когезии VEC» определяется как процент клеток VEC, к которым прилипает по крайней мере одна клетка молочнокислых бактерий, из общего числа клеток VEC в идентифицированной группе. Другое измерение прилипания in vitro заключается в подсчете числа прилипших микробных клеток к предварительно определенному числу эпителиальных клеток в окрашенном препарате. С точки зрения авторов настоящего изобретения первый способ лучше, чем последний, поскольку он более близко отражает прилипание in vivo. Можно привести доводы, что эксперимент in vitro служит только средством оценки способности in vivo к колонизации за счет прилипания к эпителиальным клеткам, например клеткам влагалища. Таким образом, способ, с помощью которого рассчитывается прилипание, не является наиболее важным фактором, но скорее он очень важен для сравнения потенциальных пробиотических штаммов с хорошо охарактеризованными бактериальными штаммами, для которых известно прилипание к слизистой мембране. В патенте США 5032399 описан штамм Lactobacilli, отличающийся тем, что в среднем по меньшей мере 50 бактерий может прилипать к одной маленькой слизистой клетке кишечника человека, однако штамм Lactobacilli не сравнивается с хорошо охарактеризованными пробиотическими бактериями. Штамм Lactobacillus casei GG представляет собой пример коммерчески доступного, хорошо охарактеризованного пробиотического штамма, который важен при поиске эффективных пробиотических штаммов для использования при сравнении.

Помимо исследования прилипания Lactobacilli к отслоившимся эпителиальным клеткам влагалища (VEC), клеткам Сасо-2 или другим типам клеточных линий, также важно охарактеризовать in vitro ингибирующую активность Lactobacilli по отношению к бактериальным видам, например анаэробным или микоплазматическим бактериям, включенным в бактериальный вагиноз, продуцирование кислоты после роста Lactobacilli в жидкой культуре и продуцирование перекиси водорода (Н₂О₂ ). Важно измерить продуцирование перекиси водорода, поскольку in vivo перекись водорода будет помогать уничтожению бактерий и микоплазматических бактерий, не продуцирующих перекись водорода.

В итоге штаммы Lactobacilli с пробиотической способностью должны быть способны прилипать к эпителиальным клеткам влагалища (VEC) и другим подходящим клеткам, таким как клеточная линия Сасо-2. Кроме того, также желательно, чтобы штаммы Lactobacilli с пробиотическиим способностями демонстрировали in vitro ингибирующую активность против других видов бактерий, продуцировали кислоты после роста в жидкой культуре и/или продуцировали перекись водорода.

Краткое изложение сущности изобретения

Задача настоящего изобретения заключается в создании фармацевтических лекарственных форм или поглощающих продуктов с использованием подходящих пробиотических штаммов Lactobacilli с желательными свойствами, как обсуждалось выше. Более конкретно, настоящее изобретение относится к штамму Lactobacillus acidophilus Lba EB01 (ЕВ01), штамму Lactobacillus paracasei Lbp PB01 (РВ01), штамму Lactobacillus acidophilus Lba EB02 (ЕВ02), штамму Lactobacillus plantarum Lbpl PB02 (РВ02), штамму Lactobacillus Lbxx EB03 (ЕВ03) и штамму Lactobacillus Lbxx PB03 (РВ03) и к штаммам, обладающим по существу такими же преимущественными свойствами, например, способностью образовывать колонии путем прилипания к слизистым мембранам, которые таким образом являются пригодными для лечения или профилактики влагалищных инфекций, инфекций мочевыводящих путей и желудочно-кишечных заболеваний.

Другая задача настоящего изобретения заключается в создании фармацевтических лекарственных форм с повышенной способностью образовывать колонии посредством прилипания к слизистой мембране за счет использования слизистых адгезивных эксципиентов.

Следующая задача настоящего изобретения заключается в создании влагалищных лекарственных форм с повышенной способностью подавлять рост Candida albicans и грам-отрицательных патогенных бактерий.

Еще одной задачей настоящего изобретения является создание молочных продуктов, пищевых добавок и функциональных пищевых продуктов, включающих один или несколько из пробиотических штаммов - штамма Lactobacillus acidophilus Lba EB01, штамма Lactobacillus paracasei Lbp PB01, штамма Lactobacillus acidophilus Lba EB02, штамма Lactobacillus plantarum Lbpl PB02, штамма Lactobacillus Lbxx EB03, штамма Lactobacillus Lbxx PB03, или штаммов, обладающих по существу такими же свойствами, обладающих способностью образовывать колонии в слизистых мембранах и, таким образом, приспособленных для лечения или профилактики влагалищных инфекций, инфекций мочевыводящих путей и желудочно-кишечных заболеваний.

Чертежи

Фиг.1. Прилипание штамма Lactobacillus acidophilus EB01, штамма Lactobacillus paracasei PB01 и Lactobacillus casei GG к культивированным клеткам Сасо-2. Рассчитано число связанных бактерий и представлено как средний процент прилипания ± стандартное отклонение.

Фиг.2. Прилипание штамма Lactobacillus acidophilus EB01, штамма Lactobacillus paracasei PB01 и Lactobacillus casei GG к изолированным влагалищным эпителиальным клеткам (VEC). Рассчитано число связанных бактерий и представлено как число связанных бактерий на VEC клетку ± стандартное отклонение.

Фиг.3. Корреляция между прилипанием к клеткам VEC и Сасо-2. Фиг.3 основана на данных фиг.1 и фиг.2.

Определения

Под термином «эксципиент» подразумевается неактивный ингредиент, который добавляют для образования части конечной композиции.

Под термином «пробиотик» подразумевается жизнеспособная микробная добавка, которая оказывает благоприятное влияние на пациента посредством воздействия на пищеварительный тракт, мочевыводящие пути или влагалищный тракт.

Термин «пребиотик» используется в данном описании для обозначения субстрата, который оказывает благоприятное действие на пробиотик и, следовательно, на индивидуального пациента, принимающего пробиотик.

Выражение «пациент» используется в данном описании для описания персоны, страдающей от какого-либо клинического состояния, связанного с микробным дисбалансом, а также для персоны, использующей бактериальные препараты в профилактических целях.

Выражение «синбиотический продукт» означает сочетание пробиотика и пребиотика, которое в совокупности оказывает благоприятное влияние на пациента.

Выражение «сильный рост» означает, что бактерии демонстрируют превосходный рост.

Аббревиатура «КОЕ» означает «колониеобразующая единица».

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение, относящееся к пробиотическим штаммам Lactobacilli, способным регенерировать in vivo флору у человека, станет понятным из следующего подробного описания.

В соответствии с первым аспектом настоящее изобретение относится к штамму Lactobacillus acidophilus Lba EB01, штамму Lactobacillus paracasei Lbp PB01, штамму Lactobacillus acidophilus Lba EB02, штамму Lactobacillus plantarum Lbpl PB02, штамму Lactobacillus Lbxx EB03 и штамму Lactobacillus Lbxx PB03, а также к пробиотическим штаммам Lactobacillus , обладающим по существу такими же свойствами.

Конкретные примеры штамма Lactobacillus acidophilus Lba EB01 и штамма Lactobacillus paracasei Lbp PB01 были депонированы в DSMZ - Deutsche Sammlung Von Microorganismen und Zellkulturen Gmbh, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Германия, и им присвоены следующие депозитные номера: Lactobacillus acidophilus Lba EB01; DSM 14869, и Lactobacillus paracasei Lbp PB01; DSM 14870. Дата депонирования штамма Lactobacillus acidophilus Lba EB01 и штамма Lactobacillus paracasei Lbp PB01 18 марта 2002 г.

Конкретные примеры штамма Lactobacillus acidophilus Lba EB02, штамма Lactobacillus plantarum Lbpl PB02, штамма Lactobacillus Lbxx EB03 и штамма Lactobacillus Lbxx PB03 были депонированы в DSMZ - Deutsche Sammlung Von Microorganismen und Zellkulturen Gmbh, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Германия. Дата депонирования штамма Lactobacillus acidophilus Lba EB02, штамма Lactobacillus plantarum Lbpl PB02, штамма Lactobacillus Lbxx EB03 и штамма Lactobacillus Lbxx PB03 20 марта 2003 г. Штаммам присвоены следующие депозитные номера:

Lactobacillus acidophilus Lba EB02,

Lactobacillus plantarum Lbpl PB02,

Lactobacillus Lbxx EB03,

Lactobacillus Lbxx PB03.

Штаммы Lactobacillus имеют следующие свойства:

Штамм Lactobacillus acidophilus Lba EB01

По крайней мере 20% добавленных бактерий прилипает к культивированным клеткам Сасо-2 в течение часового периода инкубации.

Прилипание к влагалищным эпителиальным клеткам (VEC) составляет по крайней мере 15 бактерий на клетку.

Штамм продуцирует перекись водорода.

Штамм продуцирует молочную кислоту in vitro и демонстрирует сильный рост in vitro.

Штамм обладает стабильностью к желчи.

Штамм обладает стабильностью к кислотам.

Штамм продуцирует природное антибиотическое вещество в виде бактериоцина.

Штамм Lactobacillus paracasei Lbp PB01

По крайней мере 30% добавленных бактерий прилипает к культивированным клеткам Сасо-2 в течение часового периода инкубации.

Прилипание к влагалищным эпителиальным клеткам (VEC) составляет по крайней мере 20 бактерий на клетку.

Штамм продуцирует молочную кислоту in vitro и демонстрирует сильный рост in vitro.

Штамм обладает стабильностью к желчи.

Штамм обладает стабильностью к кислотам.

Штамм продуцирует природное антибиотическое вещество в виде бактериоцина.

Штамм демонстрирует сильную ингибирующую активность против Gardnerella.

Штамм Lactobacillus acidophilus Lba EB02

Бактерии прилипают к культивированным клеткам Сасо-2 в течение часового периода инкубации.

Бактерии прилипают к вагинальным эпителиальным клеткам (VEC).

Штамм продуцирует перекись водорода.

Штамм продуцирует молочную кислоту in vitro и демонстрирует сильный рост in vitro.

Штамм обладает стабильностью к желчи.

Штамм обладает стабильностью к кислотам.

Штамм продуцирует природное антибиотическое вещество в виде бактериоцина.

Штамм Lactobacillus plantarum Lbpl PB02

Бактерии прилипают к культивированным клеткам Сасо-2 в течение часового периода инкубации.

Бактерии прилипают к влагалищным эпителиальным клеткам (VEC).

Штамм продуцирует перекись водорода.

Штамм продуцирует молочную кислоту in vitro и демонстрирует сильный рост in vitro.

Штамм обладает стабильностью к желчи.

Штамм обладает стабильностью к кислотам.

Штамм продуцирует природное антибиотическое вещество в виде бактериоцина.

Штамм Lactobacillus Lbxx EB03

По крайней мере 12% добавленных бактерий прилипает к культивированным клеткам Сасо-2 в течение часового периода инкубации.

Бактерии прилипают к влагалищным эпителиальным клеткам (VEC).

Штамм продуцирует молочную кислоту in vitro и демонстрирует сильный рост in vitro.

Штамм обладает стабильностью к желчи.

Штамм обладает стабильностью к кислотам.

Штамм продуцирует природное антибиотическое вещество в виде бактериоцина.

Штамм Lactobacillus Lbxx PB03

По крайней мере 11% добавленных бактерий прилипает к культивированным клеткам Сасо-2 в течение часового периода инкубации.

Бактерии прилипают к влагалищным эпителиальным клеткам (VEC).

Штамм продуцирует молочную кислоту in vitro и демонстрирует сильный рост in vitro.

Штамм обладает стабильностью к желчи.

Штамм обладает стабильностью к кислотам.

Штамм продуцирует природное антибиотическое вещество в виде бактериоцина.

Выражение «пробиотический штамм Lactobacillus,обладающий по существу теми же свойствами», означает любой штамм, который обладает теми же свойствами прилипания, которые перечислены выше для штамма Lactobacillus acidophilus Lba EB01, штамма Lactobacillus paracasei Lbp PB01, штамма Lactobacillus acidophilus Lba EB02, штамма Lactobacillus plantarum Lbpl PB02, штамма Lactobacillus Lbxx EB03 и штамма Lactobacillus Lbxx PB03, предпочтительно для штамма Lactobacillus acidophilus Lba EB01, штамма Lactobacillus paracasei Lbp PB01, штамма Lactobacillus Lbxx EB03 и штамма Lactobacillus Lbxx PB03 и более предпочтительно для штамма Lactobacillus acidophilus Lba EB01 и штамма Lactobacillus paracasei Lbp PB01.

Для определения рода и вида описанных здесь штаммов использовали систему характеризации Riboprinter©Microbial. Количество и композиции штаммов были идентифицированы и определены методом газовой хроматографии. Кроме того, также была проведена API идентификация штаммов.

Свойства прилипания выделенных штаммов сравнивали со свойствами хорошо охарактеризованного пробиотического штамма Lactobacillus casei GG. Почти 30% добавленных бактерий штамма Lactobacillus paracasei РВ01 прилипают к культивированным клеткам Сасо-2 за время 1-часового периода инкубации, по сравнению с примерно 20% штамма Lactobacillus acidophilus Lba EB01 и примерно 10% штамма Lactobacillus GG. Штамм Lactobacillus paracasei РВ01 прилипает более прочно к VEC из расчета приблизительно 20 бактерий на клетку после 1-часового периода инкубирования. Lactobacillus GG показывает наиболее низкое число прилипших бактерий, тогда как для штамма ЕВ01 характерны промежуточные значения. Прилипание данных трех бактериальных штаммов к культивированным клеткам Сасо-2 хорошо коррелирует с прилипанием к VEC.

Было установлено, что штамм Lactobacillus acidophilus Lba EB02 и штамм Lactobacillus plantarum Lbpl PB02 прилипают к культивированным клеткам Сасо-2 во время 1-часового периода инкубации. По меньшей мере 12% добавленного штамма Lactobacillus Lbxx EB03 прилипают к культивированным клеткам Сасо-2 по время одночасового периода инкубации, тогда как 11% добавленного штамма Lactobacillus Lbxx EB03 прилипают к культивированным клеткам Сасо-2 по время одночасового периода инкубации.

Таким образом все штаммы способны прилипать к клеткам Сасо-2. Штаммы ЕВ03 и РВ03 обладают лучшими адгезионными свойствами, чем Lactobacillus casei GG.

Было установлено, что штаммы продуцируют молочную кислоту in vitro и показывают сильный рост in vitro, а также стабильность по отношению к кислоте и желчи, более того, оба штамма способны продуцировать природное антибиотическое вещество бактериоцин.

Штаммы ЕВ02 и РВ02 демонстрируют высокую способность продуцировать Н ₂О₂ и молочную кислоту. Lactobacillus paracasei, штамм РВ01 продемонстрировал высокую ингибирующую активность против BV-ассоциированного бактериального вида Gardnerella vaginalis. Штамм ЕВ01 продуцирует Н ₂О₂. Сочетание данных двух штаммов очень подходит для получения влагалищного пробиотического продукта благодаря их дополняющим эффектам. Это дополнительно поддержано тем открытием, что оба изолята продуцируют высококислую окружающую среду после роста в жидкой среде, и оба из них сильно прилипают к VEC и к культивированным клеткам Сасо-2. Результат также показывает, что Lactobacillus paracasei, штамм РВ01 или штамм ЕВ01 сами по себе, в сочетании друг с другом или вместе со штаммом Lactobacillus acidophilus Lba EB02, штаммом Lactobacillus plantarum Lbpl PB02, штаммом Lactobacillus Lbxx EB03 и штаммом Lactobacillus Lbxx РВ03 подходят для других путей введения.

В соответствии со вторым аспектом штаммы Lactobacillus по настоящему изобретению подходят для медицинского применения для профилактики или лечения влагалищных инфекций, мочеполовых инфекций или желудочно-кишечных инфекций.

В предпочтительном варианте осуществления целебное действие пробиотических штаммов Lactobacillus для лечения влагалищных инфекций оценено путем определения влагалищной флоры с применением системы характеризации Riboprinter©Microbial Characterization system. Система Riboprinter©Microbial Characterization system используется для определения рода и видов микроорганизмов. Пациент оценивается как выздоровевший, когда влагалищная флора оценивается как нормальная с использованием системы Riboprinter©Microbial Characterization system.

В другом предпочтительном варианте осуществления разработана фармацевтическая композиция, включающая один или несколько пробиотических штаммов Lactobacillus согласно изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем. Бактериальные штаммы вводят в состав фармацевтических лекарственных форм для того, чтобы обеспечить легкое введение пробиотических штаммов, и с использованием способов, известных специалистам в данной области.

Предпочтительно пробиотические бактерии, используемые в фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением, используются в бактериальных концентрациях от 10⁵ до 10¹³ КОЕ Lactobacillus на грамм, более предпочтительно от 10 ⁶ до 10¹² КОЕ Lactobacillus на грамм, где аббревиатура «КОЕ» означает «колониеобразующую единицу». Это может быть один из штаммов или их комбинация.

Предпочтительно пробиотические бактерии, используемые в соответствии с настоящим изобретением, используются непосредственно или, более предпочтительно, в лиофилизованной форме.

Для практического применения фармацевтические композиции по изобретению получают в виде суспензии, спрея, геля, крема, порошка, капсулы, раствора для орошения, овул, влагалищных свеч, таблеток или микроинкапсулированного продукта с использованием эксципиентов и методов получения фармацевтических рецептур, известных специалистам в данной области.

Для увеличения способности фармацевтической композиции прилипать к слизистой мембране могут быть добавлены слизистые адгезивные эксципиенты, так чтобы они составляли вплоть до 10% от фармацевтической композиции. Предпочтительным слизистым адгезивным эксципиентом является гидроколлоид, более предпочтительно гидроколлоид выбирают из группы, состоящей из ксантановой камеди, альгината камеди плодов рожкового дерева, и наиболее предпочтительно гидроколлоид представляет собой ксантановую камедь.

Candida albicans не способен ферментировать лактит, то же самое относится к случаю E.coli или других грам-отрицательных бактерий. Поэтому пребиотический субстрат, который не ферментируется Candida albicans или патогенными бактериями, используется во влагалищных лекарственных формах, включающих пробиотические штаммы Lactobacilli, используемые в соответствии с настоящим изобретением для подавления роста Candida albicans. Пребиотический субстрат предпочтительно представляет собой олигосахарид, более предпочтительно субстрат представляет собой лактит, олигофруктозу или лактулозу, наиболее предпочтительно субстрат представляет собой лактит.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения разработан поглощающий продукт, включающий один или несколько штаммов Lactobacilli. Бактериальные штаммы вводят в поглощающие продукты для того, чтобы иметь возможность удобного введения пробиотических штаммов во время использования поглощающего продукта.

Для практического применения поглощающий продукт по настоящему изобретению представляет собой женскую гигиеническую прокладку, гигиеническую салфетку, пропитанный тампон, подгузники или защитные подгузники при недержании мочи, включающие один или несколько штаммов молочнокислых бактерий. Предпочтительно пробиотические бактерии, применяемые в поглощающих продуктах, используются в бактериальных концентрациях от 10 ⁵ до 10¹³ КОЕ Lactobacillus , более предпочтительно от 10⁶ до 10 ¹² КОЕ Lactobacillus.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения разработаны молочные продукты, включающие один или несколько пробиотических штаммов молочнокислых бактерий; бактериальные штаммы вводят в молочные продукты, что дает возможность перорального введения пробиотических штаммов для лечения или профилактики желудочно-кишечных заболеваний. Не ограничивающими примерами молочного продукта являются питьевой йогурт, который является особенно подходящим для совместного использования со всеми новыми пробиотическими штаммами (ферментированное молоко), простокваша и цельное молоко.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения разработаны пищевые добавки, включающие один или несколько пробиотических штаммов молочнокислых бактерий; бактериальные штаммы вводят в пищевые добавки, что дает возможность перорального введения пробиотических штаммов для лечения или профилактики желудочно-кишечных заболеваний. Не ограничивающими примерами пищевых добавок являются продукты, используемые для дополнения питания с положительным действием на здоровье.

Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения разработаны функциональные пищевые продукты, включающие один или несколько пробиотических штаммов молочнокислых бактерий, бактериальные штаммы вводят в функциональные пищевые продукты, что дает возможность перорального введения пробиотических штаммов для лечения или профилактики желудочно-кишечных заболеваний. Неограничивающими примерами функциональных пищевых продуктов являются лиофильно высушенные и микроинкапсулированные продукты для легкого нанесения на пищевые продукты.

В следующем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения штаммы молочнокислых бактерий используются для получения фармацевтических композиций для профилактики и/или лечения влагалищных инфекций, желудочно-кишечных заболеваний или инфекций мочевыводящих путей.

Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения штаммы молочнокислых бактерий используются для получения поглощающего продукта, такого как женская гигиеническая салфетка, гигиеническая прокладка, подгузники или защитные подгузники при недержании мочи для профилактики и/или лечения влагалищных инфекций, желудочно-кишечных заболеваний или инфекций мочевыводящих путей.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения штаммы молочнокислых бактерий используются для получения молочных продуктов для профилактики и/или лечения желудочно-кишечных заболеваний.

Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения штаммы молочнокислых бактерий используются для получения функциональных пищевых продуктов для профилактики и/или лечения желудочно-кишечных заболеваний.

В следующем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения штаммы молочнокислых бактерий используются для получения пищевых добавок для профилактики и/или лечения желудочно-кишечных заболеваний.

Режим лечения с использованием данных различных продуктов будет зависеть от рассматриваемого продукта и пациента, что известно специалистам в данной области. Неограничивающим примером режима лечения для влагалищных капсул является одна влагалищная капсула дважды в день в течение семи дней.

Чтобы первоначально создать оптимальные условия для роста бактерий и предоставить таким образом возможность бактериям образовать колонию путем прилипания in vivo, важно ввести в лекарственную форму субстрат, т.е. специфическую питательную среду для бактерий. Субстрат будет выступать в качестве функционального пребиотика, который вместе с пробиотиком обладает синергистическим благоприятным действием на пациента, т.е. пребиотик и пробиотик действуют как симбиотик. Лактоза представляет собой пример такого субстрата; однако лактоза также служит субстратом для патогенных Candida albicans и грамотрицательных патогенных бактерий. Следовательно, может оказаться существенной разработка бактериальной лекарственной формы с субстратом, который не является субстратом для Candida albicans. В третьем аспекте данного изобретения таким образом разработаны влагалищные лекарственные формы, включающие бактериальные штаммы, обладающие способностью образовывать колонии во влагалище, и субстрат, который не ферментируется Candida albicans . Предпочтительно субстрат представляет собой олигосахарид, более предпочтительно субстрат представляет собой лактит, олигофруктозу и/или лактулозу, наиболее предпочтительно субстрат представляет собой лактит.

Было исследовано влияние лактита на in vitro прилипание штамма Lactobacillus acidophilus LbaEB01 и штамма Lactobacillus paracasei Lbp PB01 к клеточной линии Hep-2 и клеточной линии WEHI. Было установлено, что лактит не оказывает неблагоприятного действия на общую способность бактериальных штаммов прилипать к клеткам, и таким образом он не будет оказывать никакого отрицательного действия на in vivo прилипание.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения субстрат, который не ферментируется или ферментируется с трудом Candida albicans или грамотрицательными патогенными бактериями, используется для получения влагалищных лекарственных форм, включающих бактерии, для того, чтобы подавить рост Candida albicans , при этом субстрат предпочтительно представляет собой олигосахарид, более предпочтительно субстрат представляет собой лактит, олигофруктозу и/или лактулозу, и наиболее предпочтительно субстрат представляет собой лактит.

Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения бактериальные штаммы в виде, например, капсул, используются в качестве лечебного средства для получения стабильной микробной системы млекопитающих in vivo.

Примеры

Пример 1

Выделение бактериальных штаммов.

Два штамма Lactobacillus, обозначенные как Lactobacillus acidophilus Lba EB01 и Lactobacillus paracasei Lbp PB01, были выделены из влагалищных эпителиальных клеток, полученных от здоровых людей-доноров, и были депонированы в DSMZ. Lactobacillus acidophilus Lba EB01 был присвоен следующий депозитный номер: DSM 14869, а штамму Lactobacillus paracasei Lbp PB01 был присвоен следующий депозитный номер: DSM 14870. Дата депонирования 18 марта 2002 г.

Четыре штамма, обозначенные как штамм Lactobacillus acidophilus Lba EB02, штамм Lactobacillus plantarum Lbpl PB02, штамм Lactobacillus Lbxx EB03 и штамм Lactobacillus Lbxx PB03 были выделены из влагалищных эпителиальных клеток, полученных от здоровых людей-доноров, и были депонированы в DSMZ. Дата депонирования 20 марта 2003 г.

Lactobacillus casei GG, коммерчески доступный пробиотик, был получен от Valio (Финляндия). Данные штаммы культивировали анаэробным образом в бульоне Man, Rogosa и Sharpe (Merck) при 37°С.

Для введения радиоизотопной метки 40 мкл ³Н-аденина добавляли к 20 мл бульона и инкубировали в течение 16-18 часов и избыток радиоизотопной метки удаляли с помощью двухкратной промывки и центрифугирования бактерий. Бактерии, использованные в VEC-анализе, не были радиоактивно меченными, и учет проводился другим образом, как описано выше. Оптическую плотность при 600 нм бактериальных культур использовали для регулирования бактериальных концентраций, как указано в другом месте.

Пример 2

Прилипание пробиотических штаммов к VEC

С помощью данного теста исследовали прилипание пробиотических штаммов Lactobacillus к VEC.

VEC собирали во время гистологического исследования в стерильный забуференный фосфатом буферный раствор (PBS), рН 7,2. Приблизительно через 20 часов к клеткам добавляли гентамицин и фетальную телячью сыворотку. Конечная концентрация составляла 100 мкг/мл и 2% сыворотки. Затем клетки хранили еще в течение 24 часов при 4 °С. Перед анализом на прилипание клетки промывали дважды PBS буфером, содержащим 2 % сыворотки.

Промытые пробиотические штаммы суспендировали в 10 мМ лактата и 150 мМ NaCl буфера, рН 4,5, и оптическую плотность доводили до 1,00±0,03. Бактериальную суспензию смешивали в соотношении 1:1 с суспензией клеток VEC и инкубировали в течение 2 часов при 37°С. После инкубирования клетки промывали 4 раза PBS буфером, содержащим 2% фетальной телячьей сыворотки, и наконец промывали один раз чистым PBS. После последнего центрифугирования осадок клеток суспендировали в нескольких мкл буфера и переносили на предметные стекла для микроскопа. Клетки затем сушили при 90°С. Сухое пятно фиксировали метанолом и окрашивали 0,1% фиолетовым кристаллическим. Окрашенные препараты исследовали с использованием светового микроскопа с масляной иммерсией при увеличении 100х. Подсчитывали число бактерий на 30-70 произвольно выбранных клетках/донорах.

Результаты, представленные на фиг.2, показывают прилипание трех штаммов к клеткам VEC. Значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение для 5 доноров. Штамм РВ01 прилипает более прочно из расчета приблизительно 20 бактерий на клетку после инкубирования в течение 1 часа. Наименьшее число прилипших бактерий наблюдается для штамма Lactobacillus GC, тогда как штамм ЕВ01 имеет промежуточные значения.

Пример 3.

Прилипание пробиотических штаммов к культурам клеток Сасо-2.

С помощью данного теста исследовали прилипание пробиотических штаммов Lactobacillus к клеткам Сасо-2.

Клеточную линию Сасо-2 (CRL-2102, ATCC, США) культивировали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко, (Sigma-Aldrich) c 4 мМ глутамина, отрегулированной так, что она содержала 4,5 г/л глюкозы, 1,5 г/л бикарбоната натрия, 1,0 мМ пирувата натрия (Sigma-Aldrich), 10 % фетальной телячьей сыворотки (FBS) (Merck) и 1% пенициллин/стрептомицин (Merck), при 37°С в атмосфере, содержащей 5%СО₂/95% воздуха. Для анализа на прилипание клетки Сасо-2 высевали в концентрации 1,5х10 ⁵ в 96-луночных планшетах для микротитрования. Клеточные культуры выдерживали в течение 2 недель перед применением. Культуральную клеточную среду меняли ежедневно, и ее заменяли за 2 часа перед анализом на прилипание.

Прилипание бактериальных штаммов к культурам клеток Сасо-2 исследовали посредством добавления 200 мкл меченной радиоизотопом бактериальной суспензии в лунки. Перед добавлением бактерий лунки промывали дважды средой МЕМ-Игла (Sigma-Aldrich), дополненной 0,5% FBS, 1% L-глутамина и 0,1% синтетических аминокислот. После инкубирования в течение 1 часа клеточные культуры промывали 4 раза с использованием 250 мкл забуференного физиологического раствора в устройстве Multiwash Plus AR (Labsystems) и обрабатывали 150 мкл 2% SDS в 0,01 М NaOH в течение 20 минут для лизиса бактерий и проводили измерение с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика. Степень прилипания (%) рассчитывали путем сравнения радиоактивности с радиоактивностью первоначальной бактериальной суспензии.

Данные, представленные на фиг.1, показывают прилипание трех пробиотических штаммов к культивированным клеткам Сасо-2.

Почти 30% добавленных бактерий штамма Lactobacillus paracasei Lbp PB01 прилипает к культивированным клеткам в течение 1-часового инкубационного периода по сравнению с прилипанием примерно 20% для штамма Lactobacillus acidophilus Lba EB01 и примерно 10% для Lacobacillus GG.

Пример 4

Корреляция прилипания культивированных клеток Сасо-2 по сравнению с клетками VEC.

Как показано на фиг.3, имеется хорошая корреляция между прилипанием к культивированным клеткам Сасо-2 и клеткам VEC.

Пример 5

Композиция для влагалищных капсул

Ингредиенты	мг/капсула
Лактит	328,00
Глюкоза	20,00
Ксантановая камедь	25,00
Lactobacillus acidophilus Lba EB01	12,50
Lactobacilus paracasei Lbp PB01	12,50
Стеарат магния	2,00

Высушенную замораживанием кисломолочную культуру сохраняли от постороннего загрязнения до применения. Установлено, что оптимальной для молочнокислых бактерий является питательная среда для роста, состоящая из безводной глюкозы, безводного лактита и ксантановой камеди. Стеарат магния представляет собой гидрофобный антиадгезионный лубрикант, чтобы гарантировать текучесть порошка во время наполнения капсул.

Все эксципиенты просеивали с использованием сита Frewitt и смешивали с помощью смесителя Cubus. Затем наполняли капсулы гомогенным порошком.

Все процедуры проводили в соответствии с общей фармацевтической практикой.

Исходный материал культуры, эксципиенты и конечные продукты тщательно контролировали с использованием утвержденных аналитических методов для идентификации, чистоты, загрязнений и анализа.

Пример 6

Композиция жевательных таблеток

Ингредиенты	мг/капсула
Лактит	330,50
Ксилит	90,00
Мандариновый ароматизатор	3,50
Молочная кислота	9,00
Дважды покрытые оболочкой Lactobacilus paracasei Lbp PB01	6,25
Дважды покрытые оболочкой Lactobacillus acidophilus Lba EB01	6,25
Стеарат магния	4,50

Высушенную замораживанием кисломолочную культуру сохраняли от постороннего загрязнения до применения. Установлено, что оптимальной для молочнокислых бактерий является питательная среда для роста - лактит.

Стеарат магния представляет собой гидрофобный антиадгезионный лубрикант, чтобы гарантировать текучесть порошка во время прессования таблеток. Порошок мандаринового ароматизатора и порошок молочной кислоты добавляют для придания вкуса.

Все эксципиенты просеивали с использованием сита Frewitt и смешивали с помощью смесителя Cubus. Гомогенный порошок затем формовали в таблетки весом 450 мг.

Все процедуры проводили в соответствии с общей фармацевтической практикой.

Исходный материал культуры, эксципиенты и конечные продукты тщательно контролировали с использованием утвержденных аналитических методов для идентификации, чистоты, загрязнений и анализа.

Пример 7

Композиция для молочного продукта

Получение пробиотического штамма Lactobacilli acidophilus Lba EB01 и йогуртовых культур.

Снятое молоко пастеризуют при очень высокой температуре, приблизительно 98°С, в течение по меньшей мере 3 минут. Порошкообразное снятое молоко или порошкообразная сыворотка могут быть добавлены во время данного процесса для повышения процента сухого вещества.

Пастеризованное при высокой температуре снятое молоко затем стандартизируют по содержанию жира и белка до конечного процента жира 3,5-4,0 % и белка 3,8-4,0%.

Стандартизированное молоко затем гомогенизируют при температуре 60-70°С и давлении 200-220 бар (20-22 МПа).

Стандартизированное и гомогенизированное молоко затем пастеризуют при 90-98°С в течение 3-5 минут.

Молоко затем охлаждают и закачивают в ферментер для инкубации при постоянной температуре ферментации 35-40°С во время процесса ферментации.

Чистую йогуртовую заквасочную культуру, а также чистый заквасочный пробиотический штамм Lactobacilli Lba EB01 непосредственно выливают в молоко при интенсивном перемешивании. Ферментирующие культуры, «чистые закваски» обеспечивают, например, за счет замороженных культур (шарики, хранящиеся при -40°С до употребления) и непосредственно загружают в ферментер.

Процесс ферментации протекает до тех пор, пока уровень рН не составит 4,6-4,4.

Затем йогурт перемешивают и охлаждают до 20-25°С.

Затем йогурт охлаждают приблизительно до 20-24°С и перекачивают насосом непосредственно в буферную емкость, где он хранится при 20°С до заполнения им конечных упаковок (с добавлением или без добавления фруктового джема) и хранят при охлаждении при 2-5°С.

Пример 8

Пилотное исследование влагалищных капсул

Клиническое исследование: Действие и уровень удовлетворения потребностей пациента

Цели пилотного исследования:

1. Изучение клинического действия влагалищных капсул для женщин с диагнозом бактериального вагиноза (BV).

2. Изучение пригодности влагалищных капсул для использования пациентом.

Группа пациентов:

21 женщина с диагнозом BV.

Лечащий врач диагностировал BV в соответствии со следующими критериями:

Женщины с выделениями из влагалища с сильным неприятным запахом.

Избыточные серые и беловатые выделения

рН выше 4,5

Положительный тест на запах

Препаративная лекарственная форма

Влагалищные капсулы, полученные в соответствии с примером 5, содержали молочнокислые бактерии человека (Lba EB01 и Lbp PB01).

Лечение:

После установления диагноза женщин лечили в течение одной недели с помощью влагалищных капсул.

Через 2-3 недели после лечения женщины проходили клиническое обследование, а затем их опрашивали для заполнения «вопросника» пациента.

Место проведения исследования:

Исследование проводили в гинекологической клинике Драммена (Drammen), Норвегия.

Результаты:

Все пациенты страдали от дурно пахнущих выделений из влагалища, кроме того, 12 из них страдало от избыточных выделений, 5 страдало от незначительных кровотечений, тогда как 3 из них отмечали дискомфорт от зуда.

2/3 пациентов испытывали страдания в течение нескольких лет.

13 (62%) ранее пробовали самолечение: 8 использовали Канестен (Canesten) против грибков, 3 - суппозитории с молочной кислотой, 1 - лечение антибиотиками.

12 пациентов ранее консультировались со своим лечащим врачом, и 50% из них получали фунгицид, 25% Далацин (Dalacin), против BV, тогда как 25% вообще не получили какого-либо лечения.

90% женщин (19 из 21) обнаружили, что симптомы исчезли во время лечения, и большинство из симптомов исчезло в течение нескольких дней:

в течение 2 дней: 6 женщин

в течение 5 дней: 9 женщин

в течение 8 дней: 4 женщины.

Одна из женщин обнаружила, что влагалищные капсулы трудно использовать, тогда как остальные 20 женщин были очень довольны. Все женщины, за исключением одной из них (1 из 2, которые не сочли лечение эффективным), опять хотели бы использовать влагалищные капсулы в случае рецидива. О побочных действиях не сообщалось.

Вывод:

Влагалищные капсулы, содержащие бактериальные штаммы согласно изобретению, очевидно, оказывают положительное клиническое действие на женщин, страдающих от симптомов, связанных с BV, и 9 из 10 излечилось.

Большинство из пациентов использовало самолечение и консультировалось с лечащим врачом. Большинство из них опробовало фунгициды для преодоления дискомфорта.

Влагалищные капсулы рассматривались как очень удобные для использования.

Пример 9

Для того чтобы протестировать у женщин in vivo эффективность наличия лактита в пребиотической лекарственной форме согласно изобретению, были получены различные влагалищные лекарственные формы.

Композиция для влагалищных капсул (с лактитом)

Ингредиенты	мг/капсула
Лактит	328,0
Глюкоза	20,0
Ксантановая камедь	25,0
Lactobacillus acidophilus Lba EB01	12,5
Lactobacilus paracasei Lbp PB01	12,5
Стеарат магния	2,0

Композиция для влагалищных капсул (с лактозой)

Ингредиенты	мг/капсула
Лактоза	328,0
Глюкоза	20,0
Ксантановая камедь	25,0
Lactobacillus acidophilus Lba EB01	12,5
Lactobacilus paracasei Lbp PB01	12,5
Стеарат магния	2,0

Композиция для влагалищных капсул (без бактериальных штаммов)

Ингредиенты	мг/капсула
Лактит	353,0
Глюкоза	20,0
Ксантановая камедь	25,0
Стеарат магния	2,0

Влагалищные капсулы, содержащие бактериальные штаммы и лактит, являются предпочтительными препаративными лекарственными формами для лечения женщин с гинекологическими проблемами.

Пример 10

Рибопринт Lactobacillus acidophilus Lba EB01 (=1702 ВВВ Lactobacillus acidophilus) и Lactobacilus paracasei Lbp PB01 (=1704 ВВВ Lactobacilus paracasei )

Метка/ предполагаемый ID

Структура РибоПринта(R)

Lactobacilus paracasei ss paracasei <Не помеченный> <никакой> Lactobacilus paracasei ss paracasei <Не помеченный> <никакой> 1704 BBB Lactobacilus paracasei Lactobacilus rhamnosus <Не помеченный> <никакой> Lactobacilus rhamnosus <Не помеченный> <никакой> Lactobacilus acidophilus <Не помеченный> <никакой> Lactobacilus acidophilus <Не помеченный> <никакой> 1702 BBB Lactobacilus acidophilus Lactobacilus gasseri <Не помеченный> <никакой> Lactobacilus jhonsonii <Не помеченный> <никакой>

Пример 11

Состав жирных кислот Lactobacillus acidophilus Lba EB01 и Lactobacilus paracasei Lbp PB01

Ссылочные данные		Ссылочные данные		Исследование		Исследование
Lb. Acidophilus		Lb.Paracasei		Lb. Acidophilus Lba EB01		Lb.Paracasei Lbp PB01
Жирная кислота	Процент	Жирная кислота	Процент	Жирная кислота	Процент	Жирная кислота	Процент
14:0	4,09	14:0	5,25	14:0	9,79	14:0	6,22
16:0	7,91	16:0	16,17	16:0	34,64	16:0	37,32
17:1 w8c	1,24	17:1 w8c	0,6	17:1 w8c	0	17:1 w8c	0
18:1 w9c	63,03	18:1 w9c	44,07	18:1 w9c	32,79	18:1 w9c	37,45
18:1 w7c	6,17	18:1 w7c	13,18	18:1 w7c	0	18:1 w7c	5,56
18:0	0,9	18:0	1,05	18:0	8,17	18:0	7,04
Итог по признаку 3	5,71	Итог по признаку 3	9,47	Итог по признаку 3	0	Итог по признаку 3	0
Итог по признаку 5	2,16	Итог по признаку 5	0,56	Итог по признаку 5	14,6	Итог по признаку 5	6,41
Итог по признаку 7	7,09	Итог по признаку 7	8,3	Итог по признаку 7	0	Итог по признаку 7	0
Всего %	98,3		98,65		99,99		100

Пример 12

API Lactobacillus acidophilus Lba EB01 и Lactobacilus paracasei Lbp PB01, показывающий способность штаммов ферментировать различные сахара.

Номер 1 = Lactobacillus acidophilus Lba EB01 (DSM 14869)

Номер 2 = Lactobacilus paracasei Lbp PB01 (DSM 14870)

Общий вывод: Номер 1 = Lactobacillus acidophilus Lba EB01 (DSM 14869)

API 50 CHL дало очень хороший результат в отношении рода, который был установлен правильно (Lactobacilus spp), тогда как идентификация в отношении подвида (L.acidopfilus) не является точной.

Результаты

API 50 CHL	1.:-
Глицерин	Отрицательная
Эритрит	Отрицательная
D-арабиноза	Отрицательная
L-арабиноза	Отрицательная
Рибоза	Отрицательная
D-ксилоза	Отрицательная
L-ксилоза	Отрицательная
Адонитол	Отрицательная
-метил-D-ксилозид	Отрицательная
Галактоза	Положительная
Глюкоза	Положительная
Фруктоза	Положительная
Манноза	Отрицательная
Сорбоза	Отрицательная
Рамноза	Отрицательная
Дуицитол	Отрицательная
Инозитол	Отрицательная
Маннит	Отрицательная
Сорбит	Отрицательная
-метил-D-маннозид	Отрицательная
-метил-D-глюкозид	Отрицательная
N-ацетилглюкозамин	Отрицательная
Амигдалин	Отрицательная
Арбутин	Отрицательная
Эскулин	Положительная
Салицин	Отрицательная
Целлобиоза	Положительная
Мальтоза	Положительная
Лактоза	Отрицательная
Мелибиоза	Отрицательная
Сахароза	Положительная
Трегалоза	Отрицательная
Инулин	Отрицательная
Мелецитоза	Отрицательная
D-раффиноза	Отрицательная
Стивелза	Отрицательная
Гликоген	Отрицательная
Ксилит	Отрицательная
Гентиобиоза	Положительная
D-тураноза	Отрицательная
D-ликсоза	Отрицательная
D-тагатоза	Отрицательная
D-фукоза	Отрицательная
L-фукоза	Отрицательная
D-арабитол	Отрицательная
L-арабитол	Отрицательная
Глюконат	Отрицательная
2-кето-глюконат	Отрицательная
5-кето-глюконат	Отрицательная

Вывод	ID %	Т-значение (Полная идентичность с типом штамма =1,00)
Lacto.acidophilus	60,7	0,74
Lacto.delb.delb.	36,5	0,69
Lacto.acidophilus	2,5	0,59

Общий вывод: Номер 2 = Lactobacilus paracasei Lbp PB01 (DSM 14870)

API 50 CHL дало очень хороший результат в отношении рода, а также в отношении подвида, подтверждая таким образом, что штамм представляет собой Lactobacilus paracasei subsp. Paracasei.

API 50 CHL	1.:-
Глицерин	Отрицательная
Эритрит	Отрицательная
D-арабиноза	Отрицательная
L-арабиноза	Отрицательная
Рибоза	Положительная
D-ксилоза	Отрицательная
L-ксилоза	Отрицательная
Адонитол	Отрицательная
-метил-D-ксилозид	Отрицательная
Галактоза	Положительная
Глюкоза	Положительная
Фруктоза	Положительная
Манноза	Положительная
Сорбоза	Положительная
Рамноза	Отрицательная
Дуицитол	Положительная
Инозитол	Отрицательная
Маннит	Положительная
Сорбит	Положительная
-метил-D-маннозид	Отрицательная
-метил-D-глюкозид	Положительная
N-ацетилглюкозамин	Положительная
Амигдалин	Положительная
Арбутин	Положительная
Эскулин	Положительная
Салицин	Положительная
Целлобиоза	Положительная
Мальтоза	Отрицательная
Лактоза	Положительная
Мелибиоза	Отрицательная
Сахароза	Отрицательная
Трегалоза	Положительная
Инулин	Отрицательная
Мелецитоза	Положительная
D-раффиноза	Отрицательная
Стивелза	Отрицательная
Гликоген	Отрицательная
Ксилит	Отрицательная
Гентиобиоза	Отрицательная
D-тураноза	Отрицательная
D-ликсоза	Отрицательная
D-тагатоза	Положительная
D-фукоза	Отрицательная
L-фукоза	Отрицательная
D-арабитол	Отрицательная
L-арабитол	Отрицательная
Глюконат	Положительная
2-кето-глюконат	Отрицательная
5-кето-глюконат	Отрицательная
Вывод	(Полная идентичность с типом штамма =1,00): 0,52
Lacto.para.paracasei	ID%= 97,8

0-1	Бланк заявления РСТ/RO/134 (EASY) Сведения, касающиеся депонированного(ых) микроорганизма(ов) или другого биологического материала (РСТ Правило 13bis)
0-1-1	Подготовленный с использованием	PCT-EASY Версия 2.92 (обновление 01.01.2003)
0-2	Номер международной заявки
0-3	Номер дела заявителя или агента	Р200101852WO
1	Приведенные ниже сведения касаются депонированного(ых) микроорганизма(ов) или другого биологического материала, упомянутого в описании изобретения:
1-1	Страница	8
1-2	Строка	19
1-3	Идентификация депонирования
1-3-1	Наименование учреждения по депонированию	DSMZ - Deutsche Sammlung Von Microorganismen und Zellkulturen Gmbh,
1-3-2-	Адрес учреждения по депонированию	Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany
1-3-3	Дата депонирования	18 марта 2002 (18.03.2002)
1-3-4	Регистрационный номер	DSMZ 14869
1-4	Дополнительные указания	Нет
1-5	Указанные государства, в отношении которых приведены сведения	Всех указанных государств
1-6	Отдельное предоставление указаний Данные указания будут представлены на рассмотрение Международного бюро позднее	Нет
2	Приведенные ниже сведения касаются депонированного(ых) микроорганизма(ов) или другого биологического материала, упомянутого в описании изобретения:
2-1	страница	8
2-2	строка	20
2-3 2-3-1	Идентификация депонирования Наименование учреждения по депонированию	DSMZ - Deutsche Sammlung Von Microorganismen und Zellkulturen Gmbh,
2-3-2-	Адрес учреждения по депонированию	Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany
2-3-3	Дата депонирования	18 марта 2002 (18.03.2002)
2-3-4	Регистрационный номер	DSMZ 14870
2-4	Дополнительные указания	Нет
2-5	Указанные государства, в отношении которых приведены сведения	Всех указанных государств
2-6	Отдельное предоставление указаний Данные указания будут представлены на рассмотрение Международного бюро позднее	Нет
3	Приведенные ниже сведения касаются депонированного(ых) микроорганизма(ов) или другого биологического материала, упомянутого в описании изобретения:
3-1	Страница	8
3-2	Строка	23
3-3	Идентификация депонирования
3-3-1	Наименование учреждения по депонированию	DSMZ - Deutsche Sammlung Von Microorganismen und Zellkulturen Gmbh,
3-3-2-	Адрес учреждения по депонированию	Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany
3-3-3	Дата депонирования	20 марта 2003 (20.03.2003)
3-3-4	Регистрационный номер	DSMZ
3-4	Дополнительные указания	Нет
3-5	Указанные государства, в отношении которых приведены сведения	Всех указанных государств
3-6	Отдельное предоставление указаний Данные указания будут представлены на рассмотрение Международного бюро позднее	Регистрационный номер депонирования
4	Приведенные ниже сведения касаются депонированного(ых) микроорганизма(ов) или другого биологического материала, упомянутого в описании изобретения:
4-1	страница	8
4-2	строка	24
4-3	Идентификация депонирования
4-3-1	Наименование учреждения по депонированию	DSMZ - Deutsche Sammlung Von Microorganismen und Zellkulturen Gmbh,
4-3-2-	Адрес учреждения по депонированию	Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany
4-3-3	Дата депонирования	20 марта 2003 (20.03.2003)
4-3-4	Регистрационный номер	DSMZ
4-4	Дополнительные указания	Нет
4-5	Указанные государства, в отношении которых приведены сведения	Всех указанных государств
4-6	Отдельное предоставление указаний Данные указания будут представлены на рассмотрение Международного бюро позднее	Регистрационный номер депонирования
5	Приведенные ниже сведения касаются депонированного(ых) микроорганизма(ов) или другого биологического материала, упомянутого в описании изобретения:
5-1	страница	8
5-2	строка	24
5-3	Идентификация депонирования
5-3-1	Наименование учреждения по депонированию	DSMZ - Deutsche Sammlung Von Microorganismen und Zellkulturen Gmbh,
5-3-2-	Адрес учреждения по депонированию	Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany
5-3-3	Дата депонирования	20 марта 2003 (20.03.2003)
5-3-4	Регистрационный номер	DSMZ
5-4	Дополнительные указания	Нет
5-5	Указанные государства, в отношении которых приведены сведения	Всех указанных государств
5-6	Отдельное предоставление указаний Данные указания будут представлены на рассмотрение Международного бюро позднее	Регистрационный номер депонирования
6	Приведенные ниже сведения касаются депонированного(ых) микроорганизма(ов) или другого биологического материала, упомянутого в описании изобретения:
6-1	страница	8
6-2	строка	25
6-3	Идентификация депонирования
6-3-1	Наименование учреждения по депонированию	DSMZ - Deutsche Sammlung Von Microorganismen und Zellkulturen Gmbh,
6-3-2-	Адрес учреждения по депонированию	Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany
6-3-3	Дата депонирования	20 марта 2003 (20.03.2003)
6-3-4	Регистрационный номер	DSMZ
6-4	Дополнительные указания	Нет
6-5	Указанные государства, в отношении которых приведены сведения	Всех указанных государств
6-6	Отдельное предоставление указаний Данные указания будут представлены на рассмотрение Международного бюро позднее	Регистрационный номер депонирования
ТОЛЬКО ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПОЛУЧАЮЩИМ ВЕДОМСТВОМ
0-4	Этот бланк был получен вместе с международной заявкой: (да или нет)
0-4-1	Уполномоченное лицо
ТОЛЬКО ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕЖДУНАРОДНЫМ БЮРО
0-5	Этот бланк был получен Международным бюро
0-5-1	Уполномоченное лицо