способ определения нитратов и нитритов в биологических средах малых объемов

Формула изобретения

Способ определения нитратов и нитритов в биологических средах, включающий осаждение белков, выделение нитратов и нитритов через кадмиевую колонку, проведение цветной реакции с добавлением N-нафтилэтилендиаминдигидрохлорида, фотометрирование, определение концентрации нитратов и нитритов по графику зависимости концентрации от оптической плотности и вычисление по формуле, отличающийся тем, что проводят определение нитратов и нитритов в слезной жидкости, при этом осаждение белков проводят 1,5 мл охлажденного до 4-8°С 96%-ного этанола и 0,1 мл дистиллированной воды при конечной концентрации 86,4%, затем прибавляют 2 мл аммиачно-хлоридного буфера рН 9,6±0,05 и дистиллированной водой доводят объем до 10 мл, а концентрацию нитратов и нитритов определяют по формуле

где C₁ - концентрация нитрит-ионов, найденная по калибровочному графику,

NO _x=NO₂ ^-/NO ₃ ^-.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии, и может быть использовано в крупных клинических центрах, имеющих свою биохимическую лабораторию для определения конечных стабильных метаболитов оксида азота в биологических средах малых объемов, например в слезе и камерной влаге.

В последнее десятилетие активно изучается роль оксида азота (NO) в развитии патологических процессов в тканях органа зрения.

Известно несколько биохимических методов адаптированных к малым объемам.

Виньковой Г.А. (1998) адаптирован метод определения интенсивности свободнорадикальных процессов Волчегорского И.А. с соавт. к малому объему биологического материала с соответствующей коррекцией расчетов. Экстракцию продуктов ПОЛ проводили в изопропаноловом спирте, для чего брали 0,05 мл слезной жидкости. После центрифугирования отсасывали надосадочную жидкость и измеряли против изопропилового спирта на спектрофотометре СФ-46 в микрокюветах при длинах волн 220 нм, 232 нм, 278 нм и 400 нм. Экстинция 220 нм отражает содержание изолированных двойных связей в экстрагированных липидах и используется для расчета относительного содержания продуктов липидной пероксидации.

Виньковой Г.А. (1994) адаптирован к малому объему метод определения ТБК-ап (МДА) Стальной И.Д. и Гаришвили Т.Г. (1977): к 0,05 мл слезы или гомогената тканей добавляли 0,1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты и 0,1 мл дистиллированной воды, через 10 минут центрифугировали в течение 15 минут при 2500 об/мин. К надосадочной жидкости добавляли 0,5 мл 0,8% раствора ТБК. Затем пробирки плотно закрывали пробкой, помещали в баню при температуре 100°С на 1 час. Интенсивность окрашивания раствора замеряли на спектрофотометре СФ-46 в микрокювете при длине волны 535 и 580 нм против контрольной пробы. Концентрацию МДА рассчитывали по формуле: А=(EVсм 20 10):(К Vcл), где А - концентрация МДА в нмоль/мл, Е=Е535-Е580, Vсм - объем смеси, К - молярный коэффициент (1,56·10-5 моль), Vcл - объем слезы, влаги передней камеры или гомогената тканей.

Прототипом изобретения является метод определения нитратов и нитритов (Емченко Н.Л. Универсальный метод определения нитратов в биосредах организма / Емченко Н.Л., Цыганенко О.И., Ковалевская Т.В. // Клиническая лабораторная диагностика. - 1994. - №6. - С.19-20.). Однако данная методика неприменима к биологическим средам малого объема.

Технический результат - получение метода определения нитратов и нитритов, адаптированного к малым объемам.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Слезную жидкость (камерную влагу) в объеме 0,05 мл отмеряют мерной пипеткой в центрифужную пробирку, проводят осаждение белков, для чего добавляют 0,1 мл дистиллированной воды и 1,5 мл охлажденного до+4 - 8°С 96% этанола (конечная концентрация 86,4%). Затем прибавляют 2 мл аммиачно-хлоридного буфера (рН 9,6±0,05) и дистиллированной водой доводят общий объем до 10 мл (Гисак С.Н. Модификация метода определения среднемолекулярных пептидов и его использование в детской хирургии / Гисак С.Н., Сидельникова В.И., Лифшиц В.М., Исайкин О.А., Мясоедов С. В. // Хирургия. - 1998. - №12. - С.53-54.).

Полученную смесь перемешивают и центрифугируют в течение 20 минут при 2500 об/мин. Параллельно проводят холостой опыт. Затем 5 мл надосадочной жидкости приливают в колбу с 2,5 мл аммиачно-хлоридного буфера (рН 9,6±0,05) и 2,5 мл дистиллированной воды, перемешивают и пропускают через колонку с губчатым кадмием высотой в 7-8 см со скоростью 15-20 кап/мин.

Объем раствора в колбе доводят до 40 мл дистиллированной водой, затем проводят цветную реакцию, удобную для фотометрической регистрации нитритов/нитратов. Для этого в колбу прибавляют 5 мл 0,25% раствора стрептоцида, 1 мл HCl (разбавленного дистиллированной водой в соотношении 1:2) и через 5 минут добавляют 1 мл 0,1% раствора N-нафтилэтилендиаминдигидрохлорида (НЭДА), объем раствора доводят до 50 мл дистиллированной водой. По истечении 10 мин пробу фотометрируют на КФК-2 при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр) в кювете с длиной оптического пути 5 см против холостой пробы. Концентрацию нитритов определяют по калибровочному графику и затем рассчитывают по формуле:

где:

V₁ - объем безбелкового экстракта (10 мл);

C₁ - концентрация нитрит-ионов, найденная по калибровочному графику;

V ₂ - общий объем фотометрируемого раствора (50,075 мл);

V₃ - объем образца, взятый для анализа (0,05 мл);

V₄ - объем безбелкового экстракта, взятый для анализа (5 мл).

Учитывая малый объем слезной жидкости (влаги передней камеры) 0,05 мл, проводят перерасчет формулы с учетом разведения в 20 раз:

Перерасчет в мкмоль/л проводят по формуле:

, где

0,054 - средняя масса нитрит/нитратов 0,01 мкМ.

Таким образом, концентрацию нитратов и нитритов в слезной жидкости определяют по формуле:

NO_X=NO₂ ^-/NO₃ ^-.

Каждый раз колонку промывают последовательно 5 мл 1н. HCl, затем 50 мл дистиллированной водой и 25 мл аммиачно-хлоридным буфером, разбавленным дистиллированной водой в соотношении 1:9.

Нормальные значения NO₂ ^-/NO₃ ^- в слезной жидкости составили 2,39±0,2 мкмоль/л. Методика была апробирована на 300 образцах слезной жидкости.

На чертеже изображен градуировочный график для определения концентрации нитратов по оптической плотности.

Пример 1. Больной С. находился на стационарном лечении по поводу проникающего ранения глазного яблока без выпадения оболочек. Во время проведения отсроченной первичной хирургической обработки через 14 часов после травмы шприцом с изогнутой канюлей была собрана камерная влага и слезная жидкость. Содержание конечных стабильных метаболитов NO в слезе составило 7,88 мкмоль/л, а во влаге передней камеры - 26,49 мкмоль/л. Больному проводилось последующее консервативное лечение противовоспалительными и антибактериальными средствами. Был выставлен диагноз: проникающее ранение глазного яблока, острый кератоувеит. На 3-и сутки заболевания явления острого кератоувеита сохранялись. Повторно собрана слезная жидкость в объеме 0,08 мл. Содержание NO₂ ^-/NO₃ ^- составило 1,88 мкмоль/л. Больной находился на стационарном лечении 14 дней, выписан в удовлетворительном состоянии, острый процесс купировался, зрение частично восстановилось. На 14 сутки вновь взята слезная жидкость, показатели NO составили 5, 75 мкмоль/л:

C₁ - концентрация нитрит-ионов, найденная по калибровочному графику,

Пример 2. Больная М. находилась на стационарном лечении по поводу посттравматической субатрофии глазного яблока II стадии. Меланжером была собрана слезная жидкость. Содержание NO₂ ^-/NO ₃ ^- в слезной жидкости составило 0, 86 мкмоль/л. Для лечения субатрофии глаза во Всероссийском центре глазной и пластической хирургии провели операцию бандаж глазного яблока с применением биоматериала «Аллотрансплантат» и последующим консервативным лечением противовоспалительными и антибактериальными средствами. На 3 сутки после операции была взята слезная жидкость, содержание конечных стабильных метаболитов NO составило 6,49 мкмоль/л.

Полученные результаты наших исследований по предлагаемой методике согласуются с данными отечественных и зарубежных авторов, использовавших для своих исследований другие методы определения оксида азота.