конъюгаты, состоящие из полимера и пептидов, происходящих от gp41 вич, и их применение в терапии

Формула изобретения

1. Конъюгат, состоящий из водорастворимого полимера, который имеет молекулярную массу от 200 до 20000 дальтон и представляет собой полиэтиленгликоль или алкильную цепь, к которому посредством реакционноспособной функциональной группы функционально присоединены не менее двух молекул синтетических пептидов, где каждый синтетический пептид, содержит аминокислотную последовательность, происходящую от области HR1 или HR2 gp41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), где каждый синтетический пептид содержит аминокислотную последовательность, состоящую не менее чем из 16 аминокислот и не более чем из 60 аминокислот, и где указанный конъюгат обладает противовирусной активностью, направленной против штаммов ВИЧ, резистентных к отдельно взятому синтетическому пептиду.

2. Конъюгат по п.1, где указанный полимер включает полиэтиленгликоль, содержащий определенное число этиленовых звеньев.

3. Конъюгат по п.1, где каждый синтетический пептид указанного конъюгата содержит аминокислотную последовательность, происходящую от области HR1 gp41 ВИЧ.

4. Конъюгат по п.3, где каждый синтетический пептид указанного конъюгата содержит идентичную аминокислотную последовательность.

5. Конъюгат по п.1, где каждый синтетический пептид указанного конъюгата содержит аминокислотную последовательность, происходящую от области HR2 gp41 ВИЧ.

6. Конъюгат по п.5, где каждый синтетический пептид указанного конъюгата содержит идентичную аминокислотную последовательность.

7. Конъюгат по п.1, где по крайней мере одна молекула синтетического пептида указанного конъюгата содержит аминокислотную последовательность, происходящую от области HR1 gp41 ВИЧ, и где по крайней мере одна молекула синтетического пептида указанного конъюгата содержит аминокислотную последовательность, происходящую от области HR2 gp41 ВИЧ.

8. Конъюгат по п.1, где указанные молекулы синтетического пептида функционально присоединены к полимеру посредством части каждого синтетического пептида, выбранной из группы, состоящей из N-конца, С-конца и внутреннего лизина.

9. Способ получения конъюгата по п.1, включающий стадии: (а) проведения реакции первой молекулы синтетического пептида с полимером с образованием промежуточного продукта, где указанная первая молекула синтетического пептида функционально присоединена к первой реакционноспособной функциональной группе полимера; и (b) проведения реакции указанного промежуточного продукта со второй молекулой синтетического пептида с образованием конъюгата по п.1, где указанная вторая молекула синтетического пептида функционально присоединена к промежуточному продукту посредством второй реакционноспособной функциональной группы полимера.

10. Способ по п.9, где указанный полимер включает полиэтиленгликоль, содержащий определенное число этиленовых звеньев.

11. Способ по п.9, где каждый синтетический пептид указанного конъюгата содержит аминокислотную последовательность, происходящую от области HR1 gp41 ВИЧ.

12. Способ по п.11, где каждый синтетический пептид указанного конъюгата содержит идентичную аминокислотную последовательность.

13. Способ по п.9, где каждый синтетический пептид указанного конъюгата содержит аминокислотную последовательность, происходящую от области HR2 gp41 ВИЧ.

14. Способ по п.13, где каждый синтетический пептид указанного конъюгата содержит идентичную аминокислотную последовательность.

15. Способ по п.9, где по крайней мере одна молекула синтетического пептида указанного конъюгата содержит аминокислотную последовательность, происходящую от области HR1 gp41 ВИЧ, и где по крайней мере одна молекула синтетического пептида указанного конъюгата содержит аминокислотную последовательность, происходящую от области HR2 gp41 ВИЧ.

16. Способ по п.9, где указанные молекулы синтетического пептида функционально присоединены к полимеру посредством части каждого синтетического пептида, выбранной из группы, состоящей из N-конца, С-конца и внутреннего лизина.

17. Способ ингибирования передачи ВИЧ клетке-мишени, где указанный способ включает введение в вирус и в клетку конъюгата по п.1 в количестве, эффективном для ингибирования инфицирования клетки указанным вирусом.

18. Способ ингибирования передачи ВИЧ клетке-мишени, где указанный способ включает введение в вирус и в клетку конъюгата по п.3 в количестве, эффективном для ингибирования инфицирования клетки указанным вирусом.

19. Способ ингибирования передачи ВИЧ клетке-мишени, где указанный способ включает введение в вирус и в клетку конъюгата по п.4 в количестве, эффективном для ингибирования инфицирования клетки указанным вирусом.

20. Способ ингибирования передачи ВИЧ клетке-мишени, где указанный способ включает введение в вирус и в клетку конъюгата по п.5 в количестве, эффективном для ингибирования инфицирования клетки указанным вирусом.

21. Способ ингибирования передачи ВИЧ клетке-мишени, где указанный способ включает введение в вирус и в клетку конъюгата по п.6 в количестве, эффективном для ингибирования инфицирования клетки указанным вирусом.

22. Способ ингибирования передачи ВИЧ клетке-мишени, где указанный способ включает введение в вирус и в клетку конъюгата по п.7 в количестве, эффективном для ингибирования инфицирования клетки указанным вирусом.

23. Способ ингибирования передачи ВИЧ клетке-мишени, где указанный способ включает введение в вирус и в клетку конъюгата по п.8 в количестве, эффективном для ингибирования инфицирования клетки указанным вирусом.

24. Способ ингибирования передачи ВИЧ клетке-мишени, где указанный способ включает введение в вирус и в клетку конъюгата по п.9 в количестве, эффективном для ингибирования инфицирования клетки указанным вирусом.

25. Способ по п.17, где указанный конъюгат ингибирует слияние вируса и клетки-мишени, предотвращая инфицирование клетки указанным вирусом.

26. Способ по п.17, где указанный конъюгат дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

27. Способ по п.26, где указанный конъюгат вводят ВИЧ-инфицированному индивидууму.

Описание изобретения к патенту

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к конъюгатам, состоящим из полимера и синтетических пептидов, происходящих от gp41 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Более конкретно настоящее изобретение относится к конъюгату, образованному путем функционального присоединения к полимеру не менее двух молекул синтетического пептида, содержащего аминокислотную последовательность, происходящую либо от области HR1, либо от области HR2 gp41 ВИЧ-1.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время хорошо известно, что клетки могут быть инфицированы ВИЧ в соответствии с механизмом, при котором происходит слияние клеточной мембраны и вирусной мембраны. Общепринятая модель такого механизма заключается в том, что гликопротеиновый комплекс вирусной оболочки (gp120/gp41) взаимодействует с рецепторами клеточной поверхности на мембранах клеток-мишеней. После связывания gp120 с клеточными рецепторами (например, CD4 в комбинации с хемокиновым ко-рецептором, таким как CCR-5 или CXCR-4), индуцируется конформационное изменение в комплексе gp120/gp41, которое способствует внедрению gp41 в мембрану клетки-мишени и опосредует слияние мембран.

Аминокислотная последовательность gp41 и ее варианты в различных штаммах ВИЧ хорошо известны. На фиг.1 схематически представлены общеизвестные функциональные домены gp41 (следует отметить, что число аминокислотных последовательностей может слегка варьировать в зависимости от штамма ВИЧ). Очевидно, что гибридный пептид (фузогенный домен) участвует во внедрении вируса в мембрану клетки-мишени и ее дизрупции. Трансмембранный домен, содержащий трансмембранную якорную последовательность, расположен на С-конце этого белка. Между гибридным пептидом и трансмембранным якорем находятся две различных области, известные как области гептадных повторов (HR), каждая из которых имеет множество гептад. Область HR1, которая ближе расположена к N-концу белка, чем область HR2, в основном описана как область, содержащая аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:1. Однако из-за природного полиморфизма аминокислотная последовательность (а также нумерация остатков) области HR1 gp41 ВИЧ-1 может варьировать в зависимости от вирусного штамма, от которого происходит эта аминокислотная последовательность. Другая область, HR2, также представленная на фиг.1 и в SEQ ID NO:2, может варьировать также вследствие полиморфизма. Каждая аминокислотная последовательность, содержащая область HR1, и аминокислотная последовательность, содержащая область HR2, представляет собой одну из наиболее высококонсервативных областей в белке оболочки ВИЧ-1 (Shu et al., 1999, Biochemistry, 38:5378-5385; Hanna et al., 2002, AIDS 16:1603-8). Области HR имеют множество участков, состоящих из 7 аминокислотных остатков, или "гептад" (7 аминокислот в каждой гептаде обозначены "а"-"g"), где аминокислоты в положении "а" и в положении "d" являются в основном гидрофобными. В каждой области HR также присутствует один или несколько мотивов типа "лейциновой молнии" (называемых также повторами типа "лейциновой молнии"), содержащих 8 аминокислотных последовательностей, начинающихся с изолейцина или лейцина и заканчивающихся ими. В большинстве случаев область HR2 имеет только один мотив типа "лейциновой молнии", тогда как область HR1 имеет пять мотивов типа "лейциновой молнии". Гептады и мотивы типа "лейциновой молнии" участвуют в образовании суперспирализованной структуры gp41 и суперспирализованной структуры пептидов, происходящих от областей HR. В общих чертах известно, что суперспирали состоят из двух или более спиралей, которые закручены друг относительно друга, образуя олигомеры, причем характерным признаком таких суперспиралей является гептадный повтор, состоящий из аминокислот с преобладанием гидрофобных остатков в первом ("а") и в четвертом ("d") положениях, и заряженных остатков, чаще всего локализованных в пятом ("е") и в седьмом ("g") положениях, где аминокислоты в положении "а" и в положении "d" представляют собой детерминанты, влияющие на статус олигомера и ориентацию цепи (см., например, Akey et al., 2001, Biochemistry, 40:6352-60).

Было обнаружено, что синтетические пептиды, происходящие либо от области HR1 ("пептиды HR1"), либо от области HR2 ("пептиды HR2") gp41 ВИЧ, ингибируют передачу ВИЧ клеткам-хозяевам в in vitro-анализах и в клинических in vivo-исследованиях (см. например, Wild et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9770-9774; патенты США № 5464933 и 5656480, и Kilby et al., 1998, Nature Med. 4:1302-1306). Более конкретно пептиды HR1, представленные DP107 (также известные как Т-21; SEQ ID NO:3), блокируют инфицирование Т-клеток при 50%-ной эффективной концентрации (ЕС50), составляющей 1 мкг/мл (см. например, Lawless et al., 1996, Biochemistry, 35:13697-13708). Пептиды HR2, представленные DP178 (также известные как Т-20; SEQ ID NO:4), обычно блокируют инфицирование Т-клеток при 50%-ной эффективной концентрации (ЕС50) в масштабе нг/мл. Первые упоминания о высокоэффективных синтетических пептидах, которые включают одну или несколько энхансерных последовательностей, присоединенных к аминокислотной последовательности корового gp41 ВИЧ, и ингибируют слияние мембраны ВИЧ с клеточной мембраной, предотвращая тем самым передачу вируса клетке-хозяину, уже встречались в литературе (см. например, патенты США №№ 6258782 и 6348568). Однако синтетические пептиды, происходящие от gp41 ВИЧ, имеют относительно низкую молекулярную массу. Для достижения и поддержания в кровотоке уровня, достаточного для продуцирования терапевтического эффекта, эти синтетические пептиды подобно другим известным пептидам, которые являются эффективными терапевтическими агентами, требуют частого введения (например, ежедневных инъекций). Для решения этой проблемы исследователями были предприняты попытки химически модифицировать терапевтический агент, такой как пептид или пептидомиметик, например, путем присоединения этого терапевтического агента к водорастворимому полимеру, такому как полиэтиленгликоль (ПЭГ), так чтобы обеспечивалось более длительное присутствие этого терапевтического агента in vivo (например, увеличение его времени полужизни в кровотоке и/или ингибирование разложения терапевтического агента в кровотоке). Однако как известно специалистам (см., например, патенты США 6258774 и 6113906), такие модификации терапевтического агента имеют естественные ограничения, то есть такие модификации обычно ограничивают биологическую доступность терапевтического агента. Более конкретно присоединение водорастворимого полимера к терапевтическому агенту, а в частности к небольшому пептиду, часто приводит к негативной модуляции биологической активности терапевтического агента. Такая потеря активности и терапевтической эффективности часто происходит у пептидов с более низкой молекулярной массой (например, менее 4000 дальтон), у которых имеется мало сайтов связывания, не ассоциированных с биоактивностью. Хотя в предшествующих работах могло быть описано конъюгирование терапевтических агентов с водорастворимым полимером, однако в этих работах нет каких-либо упоминаний о конъюгате, который содержал бы полимер, присоединенный к двум или более молекулам синтетического пептида и который сохранял бы значительную биоактивность (например, сохранял бы значительную биологическую активность по сравнению с активностью отдельно взятого синтетического пептида) и усиленное действие (значительную биологическую активность против штамма ВИЧ-1, резистентного к синтетическому пептиду, взятому отдельно, то есть не форме конъюгата, по сравнению с биологической активностью синтетического пептида).

Таким образом, необходимо получить такие конъюгаты, которые могли бы предотвращать взаимодействие вирусных доменов gp41, участвующих в процессе слияния вируса, а более предпочтительно предотвращать конформационные изменения в gp41, необходимые для такого слияния, и которые обеспечивали бы ингибирование слияния gp41 ВИЧ с мембраной клетки-мишени. Кроме того, необходимо получить конъюгаты, которые могли бы ингибировать передачу ВИЧ клетке-мишени и в то же самое время сохраняли бы значительную биологическую активность и имели бы более сильное действие. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этих требований.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к конъюгату, включающему полимер, к которому присоединены два или несколько синтетических пептидов, происходящих от области HR gp41 (области HR1, области HR2 или их комбинаций), где указанный конъюгат имеет то преимущество, что он сохраняет значительный уровень биологической активности (то есть активности против ВИЧ) и обладает усиленным действием (по сравнению с синтетическим пептидом, взятым отдельно (например, без полимерной части конъюгата)). Другие отличительные признаки, такие как увеличение биологической полужизни синтетического пептида, который является частью конъюгата (например, способствующее увеличению времени полужизни синтетического пептида in vivo перед его разложением в кровотоке и/или удалением из кровотока по сравнению с отдельно взятым синтетическим пептидом), будут очевидны специалистам из нижеследующего описания изобретения. Конъюгат согласно настоящему изобретению, кроме того, может содержать фармацевтически приемлемый носитель.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу применения конъюгата согласно настоящему изобретению для ингибирования передачи ВИЧ клетке-мишени, где указанный способ предусматривает введение в вирус и в клетку определенного количества конъюгата согласно настоящему изобретению, эффективного для ингибирования инфицирования клетки указанным вирусом. Этот способ может быть использован для лечения ВИЧ-инфицированных индивидуумов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ингибирование передачи ВИЧ клетке-мишени предусматривает ингибирование gp41-опосредованного слияния ВИЧ-1 с клеткой-мишенью.

Настоящее изобретение также относится к способам получения конъюгатов в соответствии с настоящим изобретением. Один из таких описанных здесь способов включает стадии: (а) проведения реакции первой молекулы синтетического пептида с полимером с образованием интермедиата, включающего первый интермедиат, где первая молекула синтетического пептида функционально присоединена к первой реакционноспособной функциональной группе полимера; (b) проведения реакции указанного интермедиата, включающего первый интермедиат, со второй молекулой синтетического пептида с образованием конъюгата, где вторая молекула синтетического пептида функционально присоединена к интермедиату, включающему первый интермедиат, посредством второй реакционноспособной функциональной группы данного полимера. Для специалиста очевидно, что такой способ может также предусматривать одновременное присоединение множества молекул синтетического пептида к полимеру, где более чем одна молекула синтетического пептида функционально присоединяется к полимеру с образованием конъюгата, где каждая молекула синтетического пептида, которая становится функционально присоединенной, функционально связывается с реакционноспособной функциональной группой полимера.

Вышеуказанные и другие цели, отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения со ссылками на прилагаемый графический материал.

Краткое описание графического материала

На фиг.1 схематически представлен gp41 ВИЧ-1, где показана область 1 гептадного повтора (HR1) и область 2 гептадного повтора (HR2) вместе с другими функциональными областями gp41. Примеры аминокислотных последовательностей, соответствующих HR1 и HR2, и нумерация положений аминокислот приводятся лишь в целях иллюстрации, и относятся к gp160, штамму ВИЧ_IIIB.

На фиг.2 схематически проиллюстрирован вариант синтеза конъюгата согласно настоящему изобретению.

Подробное описание изобретения

Определения:

В настоящем описании термины "первый", "второй", "третий" и т.д. могут быть использованы для: (а) указания порядка; или (b) для идентификации этих молекул (например, синтетических пептидов, интермедиатов или конъюгатов, которые по своему составу отличаются друг от друга); либо (с) для той и другой цели ((а) и (b)). Однако термины "первый", "второй", "третий" и т.д. не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения.

Термин "функционально присоединенный" (и его грамматические формы), используемый в описании и формуле изобретения, относится к гибриду, связи или к ассоциации, обладающих стабильностью, достаточной для того, чтобы полимер независимо от условий, имеющихся in vivo, оставался присоединенным к двум или более молекулам синтетического пептида в течение определенного периода времени, достаточного для увеличения биологического времени полужизни синтетического пептида, который является частью конъюгата согласно настоящему изобретению (по сравнению с отдельно взятым синтетическим пептидом). Как известно специалистам, указанная связь может включать одну или несколько ковалентных, ионных, водородных, ван-дер-ваальсовых, электростатических связей и т.п. Как известно специалистам и как будет более очевидно из нижеследующего описания вариантов изобретения, существует несколько методов и композиций, в которых две или более молекулы могут быть функционально связаны с использованием реакционноспособных функциональных групп. Как будет подробно описано в настоящем изобретении, такими реакционноспособными группами являются, но не ограничиваются ими, свободные химические группы (например, тио, карбоксил, гидроксил, амин, сульфо и т.п.) и реакционноспособные химические группы (реагирующие со свободными химическими группами).

Термин "индивидуум", используемый в описании и в формуле изобретения, относится к млекопитающему, а предпочтительно к человеку.

Термин "клетка-мишень", используемый в описании и формуле изобретения, означает клетку, которая может подвергаться ВИЧ-инфицированию. Такой клеткой предпочтительно является клетка или клетки человека, а более предпочтительно клетки человека, которые могут подвергаться ВИЧ-инфицированию по определенному механизму, включая мембранное слияние.

Термин "фармацевтически приемлемый носитель", используемый в описании и формуле изобретения, означает среду-носитель, которая не оказывает значительного влияния на биологическую активность активного ингредиента (например, конъюгата по изобретению или соединения, полученного способом по изобретению), при его добавлении в эту среду. Как известно специалистам, подходящий фармацевтически приемлемый носитель может содержать одно или несколько веществ, включая, но не ограничиваясь ими, воду, забуференную воду, физиологический раствор, 0,3% глицин, водные спирты, изотонический водный буфер; и, кроме того, он может включать одно или несколько веществ, таких как глицерин, масла, соли, такие как соли натрия, калия, магния и аммония, фосфонаты, сложные эфиры карбоновых кислот, жирные кислоты, сахариды, полисахариды, гликопротеины (для повышения стабильности), наполнители, консерванты и/или стабилизаторы (предназначенные для увеличения срока хранения, если это необходимо, и подходящие для изготовления и коммерческого распределения этой композиции). Предпочтительно, чтобы носитель был подходящим для внутривенного, внутримышечного, подкожного или парентерального введения (например, путем инъекции).

Термин "аминокислота", используемый в описании и в формуле изобретения и относящийся к синтетическим пептидам по изобретению, означает молекулу, которая имеет по крайней мере одну свободную аминогруппу и по крайней мере одну свободную карбоксильную группу. Такая аминокислота может иметь более чем одну свободную аминогруппу или более чем одну свободную карбоксильную группу либо, кроме того, она может содержать одну или несколько свободных химических реакционноспособных групп, не являющихся аминогруппой или карбоксильной группой (например, гидроксил, сульфгидрил и т.п.). Такой аминокислотой может быть природная аминокислота (например, L-аминокислота), неприродная аминокислота (например, D-аминокислота), синтетическая аминокислота, модифицированная аминокислота, аминокислотное производное, предшественник аминокислоты и ее консервативная замена. Специалисту известно, что выбор аминокислот, включаемых в пептид, отчасти зависит от конкретных физических, химических или биологических свойств, необходимых для противовирусного пептида. Так, например, из описания изобретения специалисту будет очевидно, что аминокислоты в синтетическом пептиде могут представлять собой одну или несколько природных (L)-аминокислот и неприродных (D)-аминокислот. Аминокислоты, не являющиеся предпочтительными, могут быть заменены предпочтительными аминокислотами.

Термин "аминокислотная замена", относящийся к аминокислотной последовательности синтетического пептида, полученного в соответствии с настоящим изобретением, и используемый в описании и в формуле изобретения, означает одну или несколько аминокислотных замен в последовательности синтетического пептида, а именно таких замен, при которых способность пептида связываться с областью HR gp41 ВИЧ и ингибировать gp41-опосредованное слияние остается в основном неизменной (как может быть определено по противовирусной активности, выраженной в IC ₅₀ в пределах величин нг/мл или мкг/мл, как более подробно проиллюстрировано ниже). Обычно число аминокислотных замен составляет примерно от 1 аминокислоты до 10 аминокислот в синтетическом пептиде, а более предпочтительно от 1 аминокислоты до 5 аминокислот в синтетическом пептиде. Как известно специалистам, аминокислотная замена может включать "консервативную замену", которая определяется вышеупомянутыми функциями, и предусматривает замены аминокислот, имеющих в основном тот же самый заряд и размер и такую же гидрофильность и/или ароматичность, как и удаленная аминокислота. Такими консервативными заменами, известными специалистам, являются, но не ограничиваются ими, замены: глицин-аланин-валин; изолейцин-лейцин; триптофан-тирозин; аспарагиновая кислота-глутаминовая кислота; аргинин-лизин; аспарагин-глутамин и серин-треонин. Аминокислотная замена может включать полиморфизм в различных положениях аминокислот в области HR1 или в области HR2 в зависимости от области, от которой происходит синтетический пептид, имеющийся в лабораторных и/или в клинических изолятах ВИЧ. Такие последовательности с полиморфизмом имеются в доступной базе данных генов, такой как GenBank, и в других доступных базах данных аминокислотных последовательностей ВИЧ.

Термин "реакционноспособная функциональная группа", используемый в описании и в формуле изобретения, означает химическую группу или химическую молекулу, способную образовывать ковалентную связь или связь для функционального присоединения полимера к синтетическому пептиду. Что касается химических групп, то реакционноспособными функциональными группами, известными специалистам, являются, но не ограничиваются ими, малеимидная группа, тиоловая группа, карбоксигруппа, фосфорильная группа, ацильная группа, гидроксильная группа, ацетильная группа, гидрофобная группа, амидогруппа, дансильная группа, сульфогруппа, сукцинимидная группа, группа, реагирующая с тиолом, группа, реагирующая с амином, группа, реагирующая с карбоксилом и т.п. Химическая молекула может содержать линкер. Известно, что линкер представляет собой соединение или группу, которая действует как молекулярный мостик, функционально связывающий две различные молекулы (например, одна часть линкера связывается с синтетическим пептидом, а другая часть линкера связывается с полимером с образованием конъюгата настоящего изобретения). Эти две различных молекулы могут быть присоединены к линкеру постадийно. Конкретный размер или состав линкера не имеет ограничений при условии, что он может быть использован в качестве молекулярного мостика. Линкерами, известными специалистам, являются, но не ограничиваются ими, химические цепи, химические соединения (например, реагенты), аминокислоты и т.п. Такими линкерами могут быть, но не ограничиваются ими, гомобифункциональные линкеры, гетеробифунциональные линкеры, биологически стабильные линкеры и биологически разлагаемые линкеры, также известные специалистам. Если используется линкер, то предпочтительным является непланарный линкер (например, такой линкер, который действует так, чтобы функционально присоединенный синтетический пептид не был жестко связан с полимером). Гетеробифункциональные линкеры, хорошо известные специалистам, содержат один конец, имеющий первую реакционноспособную функциональную группу, специфически связанную с первой молекулой, и противоположный конец, имеющий вторую реакционноспособную функциональную группу, специфически связанную со второй молекулой. Для специалиста очевидно, что различные бифункциональные или полифункциональные реагенты, такие как гомо- и гетерофункциональные реагенты (например, реагенты, описанные в каталоге Pierce Chemical Co., Rockford, III), могут быть использованы в качестве линкера по изобретению. Для оптимизации таких свойств, как сохранение стабильности биологических функций, резистентности к некоторым химическим и/или температурным параметрам и достаточной стереоселективности или размера, длина и состав линкера может варьировать в зависимости от таких факторов, как связываемые молекулы и условия, в которых происходит такое связывание. Так, например, линкер не должен оказывать значительного влияния на способность синтетического пептида (с которым он связан) функционировать как ингибитор слияния ВИЧ с клеткой-мишенью и передачи ВИЧ клетке-мишени, или того и другого. В соответствии с настоящим изобретением реакционноспособная функциональная группа, не являющаяся предпочтительной, может быть заменена предпочтительной реакционноспособной функциональной группой.

Термин "полимер", используемый в описании и в формуле изобретения, включает гомополимеры и сополимеры, а также полимеры, которые могут иметь структуру, включая разветвленную или линейную структуру, известную специалистам. Предпочтительным полимером является водорастворимый полимер, а более предпочтительно водорастворимый полимер, который является в основном нетоксичным при его in vivo введении индивидуумам. Иллюстративными примерами таких водорастворимых полимеров являются, но не ограничиваются ими, полиолы, полиэтиленгликоль ("ПЭГ"), полипропиленгликоль ("ППГ"), декстран, карбоксиметилцеллюлоза, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, полиаминокислоты (гомополимеры, например, полилизины или гетерополимеры, например, поли(D-L-аланин)-поли(L-лизин)), поли(алкиленоксид), сополимеры этиленгликоля и ППГ, сополимеры ПЭГ и аминокислоты, сополимеры ПЭГ и тиояблочной кислоты, и сополимеры полипропиленоксида и этиленоксида. Предпочтительно, чтобы используемый полимер представлял собой дискретную молекулу, т.е. молекулу, состоящую из одинакового числа полимерных звеньев (например, 6 этиленовых звеньев в ПЭГ), но не смесь полимерных молекул, где каждые из этих молекул по своему размеру отличаются друг от друга. Используемый в настоящем изобретении термин "полимер" может также включать алкил с разветвленной или прямой цепью (как будет видно ниже, например, из таблицы 5). Полимер, используемый для получения конъюгата по изобретению, может иметь молекулярную массу в очень широком интервале, при этом в предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный полимер имеет молекулярную массу в пределах примерно от 200 дальтон до 100000 дальтон, а в более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный полимер имеет молекулярную массу в пределах примерно от 300 дальтон до 20000 дальтон. Многочисленные реакционноспособные функциональные группы могут быть присоединены к полимеру или составлять часть полимера, к которому функционально присоединен синтетический пептид, и на этом полимере могут присутствовать реакционноспособные функциональные группы более чем одного типа для селективного связывания с синтетическими пептидами (например, реакционноспособная функциональная группа каждого типа является доступной для функционального связывания с молекулой синтетического пептида, где каждая молекула синтетического пептида может иметь последовательность, аналогичную или отличающуюся от последовательности другой(их) молекулы (молекул) присоединяемого синтетического пептида). Примерами реакционноспособных функциональных групп, описанных выше, и других групп могут быть, но не ограничиваются ими, кетоны, сложные эфиры, карбоновые кислоты, альдегиды, спирты, амины и т.п. В этой связи, для создания или представления реакционноспособных функциональных групп полимера, который может быть использован для функционального связывания двух или более молекул синтетического пептида с образованием конъюгата по изобретению, этот полимер может быть соответствующим образом сконструирован, модифицирован или соответствующим образом функционализирован стандартными методами органического химического синтеза. Поскольку в настоящем изобретении могут быть использованы многие водорастворимые полимеры и множество реакционноспособных функциональных групп, то метод химического синтеза для создания или присоединения реакционноспособной функциональной группы будет зависеть от полимера и реакционноспособной функциональной группы, которую желательно присоединить к полимеру. Полимер, используемый в настоящем изобретении, предпочтительно имеет следующие характеристики: (а) он является водорастворимым и предпочтительно растворимым в водных системах, которые обычно присутствуют in vivo; (b) он имеет более чем одну реакционноспособную функциональную группу (либо одного и того же типа, либо различных типов, например, по химическому составу), где две или более молекул синтетического пептида могут быть функционально присоединены к полимеру посредством более чем одной реакционноспособной функциональной группы полимера (предпочтительно, чтобы каждая реакционноспособная функциональная группа полимера, подходящая для функционального связывания с синтетическим пептидом, была функционально присоединена к реакционноспособной функциональной группе одной молекулы синтетического пептида); и (с) при функциональном связывании с синтетическим пептидом с образованием конъюгата по изобретению он не оказывает значительного влияния на биологическую активность (например, противовирусную активность) синтетического пептида, как можно определить методами оценки противовирусной активности in vitro и/или in vivo и как будет более подробно описано ниже. Полимер, предпочтительный для использования в настоящем изобретении, включает полиол, а более предпочтительно ПЭГ. В соответствии с настоящим изобретением полимер, не являющийся предпочтительным, может быть заменен предпочтительным полимером.

Термин "усиленное действие", относящийся к конъюгату по изобретению и используемый в описании и в формуле изобретения, означает, что этот конъюгат обладает более сильной противовирусной активностью против штаммов ВИЧ-1, резистентных к одному или нескольким отдельно взятым синтетическим пептидам (мономеру, который не связан с полимером) по сравнению с противовирусной активностью отдельно взятого синтетического пептида (как будет более очевидно из нижеследующего описания). Предпочтительно, чтобы такое "усиленное действие" конъюгата означало противовирусную активность против резистентных штаммов ВИЧ-1, измеренную как IC50 или EС50 и составляющую менее (например, в нг/мл) или равную 1 мкг/мл (по отношению к активности синтетического пептида) (см., например, таблицу 5).

Термин "синтетический пептид", относящийся к пептиду по изобретению и используемый в описании и в формуле изобретения, означает пептид, (а) полученный методами химического синтеза, рекомбинантной экспрессии, биохимической или ферментативной фрагментации более крупной молекулы, химического расщепления более крупной молекулы, или их комбинацией, либо, в общих чертах, полученный другими известными методами и выделенный; (b) имеющий аминокислотную последовательность, включающую не менее чем примерно 16 аминокислотных остатков и не более чем примерно 60 аминокислотных остатков, и состоящую из не менее чем 14 смежных аминокислот, принадлежащих либо к области HR1, либо к области HR2 gp41 ВИЧ (которые могут включать одну или несколько аминокислотных замен); и (с) способный ингибировать передачу ВИЧ клетке-мишени (предпочтительно путем образования комплекса с любой из областей HR gp41 ВИЧ и/или предотвращения слияния между ВИЧ-1 и клеткой-мишенью), как может быть определено путем оценки противовирусной активности in vitro и/или in vivo, и как будет более подробно описано ниже. Термин "выделенный", относящийся к пептиду, означает, что синтетический пептид в основном не содержит компонентов, которые не являются частью целой структуры самого пептида, например в основном не содержит клеточного материала или культуральную среду, используемых при продуцировании рекомбинантными методами, или в основном не содержит химических предшественников или других химических веществ, используемых при химическом синтезе или продуцированных в биохимических или химических реакциях. Аминокислотная последовательность синтетического пептида может включать одну или несколько аминокислотных замен и/или одну или несколько модификаций, образующихся в результате полиморфизма и присутствующих в последовательности в релевантной области gp41 ВИЧ, либо она может включать одну или несколько аминокислотных замен, которые вводят для стабилизации спиральной структуры и/или для воздействия на олигомеризацию так, чтобы происходила самосборка пептидов в тример. Кроме того, аминокислотная последовательность помимо того, что она имеет коровый пептид, происходящий от gp41 ВИЧ, может содержать один или несколько энхансерных пептидов, присоединенных к коровому пептиду, например, у N-конца, у С-конца или у обоих N- и С-концов, либо она может содержать коровый пептид, происходящий от одного или нескольких ВИЧ-1, ВИЧ-2 и SIV (см, например, патент США № 6258782; см. также синтетический пептид, содержащий аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:5 и 46-59). В зависимости от используемого синтетического пептида синтетический пептид, функционально присоединенный в полимеру, может присутствовать в виде мономера или в олигомерной форме, такой как тример. В примере, где синтетический пептид присутствует в качестве тримера, только одна молекула может быть функционально присоединена к полимеру, тогда как остальная часть молекулы синтетического пептида, содержащего тример, подвергается самосборке вокруг функционально присоединенной молекулы синтетического пептида. Так, например, иллюстративные синтетические пептиды, содержащие пептиды HR1, имеющие аминокислотные замены (по сравнению с SEQ ID NO:1) и предпочтительно подвергающиеся самосборке в тримеры (например, в тример, состоящий из трех молекул синтетического пептида), содержат аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NN:61-74.

Предпочтительно синтетический пептид по изобретению может содержать последовательность длиной примерно не менее 16 аминокислотных остатков и примерно не более 60 аминокислотных остатков, предпочтительно не менее 36 аминокислот и примерно не более 52 аминокислот, а более предпочтительно примерно не менее 41 аминокислоты и примерно не более 51 аминокислоты. Предпочтительно, чтобы синтетический пептид, содержащий последовательность, происходящую от области HR1 gp41 ВИЧ, включал непрерывную последовательность, состоящую, по крайней мере, из смежных аминокислотных остатков 18-54 SEQ ID NO:1 (обозначенных однобуквенными кодами, NNLLRAIEAQQHLLQL TVWGIKQLQARILAVERYL KD), или ее вариант, образованный в результате полиморфизма, поскольку было обнаружено, что ключевые детерминанты в этой части области HR1 влияют на биохимические и противовирусные свойства, описанные в настоящем изобретении. Репрезентативными синтетическими пептидами, происходящими от области HR1, являются, но не ограничиваются ими, пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:3 и 6-31. Предпочтительный синтетический пептид, происходящий от области HR1, может быть использован для продуцирования конъюгата по изобретению вместо пептида HR1, не являющегося предпочтительным синтетическим пептидом. Предпочтительно, чтобы последовательность синтетического пептида, происходящего от области HR2 gp41 ВИЧ, включала непрерывную последовательность, состоящую, по крайней мере, из аминокислотных остатков 43-51 SEQ ID NO:2 (например, QQEKNEQEL), поскольку было обнаружено, что ключевые детерминанты в этой части области HR2 влияют на биохимические и противовирусные свойства, описанные в настоящем изобретении. Репрезентативными синтетическими пептидами, происходящими от области HR2, являются, но не ограничиваются ими, пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:4, 32, 75-99 и 114. Предпочтительный синтетический пептид, происходящий от области HR2, может быть использован для продуцирования конъюгата по изобретению вместо пептида HR2, не являющегося предпочтительным синтетическим пептидом. Большое число таких синтетических пептидов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, были описаны ранее (например, в патентах США № 5656480, 6133418 и 6258782, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Термин "отдельно взятый синтетический пептид", используемый в описании и в формуле изобретения, означает синтетический пептид, который функционально не связан с полимером, то есть пептид, который имеет неконъюгированную форму, не содержащую полимера.

Настоящее изобретение проиллюстрировано на нижеследующих примерах, которые не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения.

Пример 1

В одном из вариантов осуществления изобретения проиллюстрирован способ получения конъюгатов по изобретению. Один из описанных здесь способов включает стадии: (а) проведения реакции первой молекулы синтетического пептида с полимером с получением интермедиата, включающего первый интермедиат, где первая молекула синтетического пептида функционально присоединена к первой реакционноспособной функциональной группе полимера; (b) проведения реакции указанного интермедиата, включающего первый интермедиат, со второй молекулой синтетического пептида с получением конъюгата, где вторая молекула синтетического пептида функционально присоединена к интермедиату, включающему первый интермедиат, посредством второй реакционноспособной функциональной группы данного полимера. Для специалиста очевидно, что такой способ может также предусматривать одновременное присоединение множества молекул синтетического пептида к полимеру, где более чем одна молекула синтетического пептида функционально связывается с полимером с образованием конъюгата и где каждая молекула синтетического пептида, которая становится функционально присоединенной, функционально связана с реакционноспособной функциональной группой полимера.

Пептиды синтезировали на пептидном синтезаторе стандартными методами твердофазного синтеза и стандартными методами пептидной химии с использованием FMOC (см. также патент США № 6015881, переуступленный настоящему правоприемнику). В этом примере синтетические пептиды, кроме того, включали реакционноспособные функциональные группы, то есть были блокированы по N-концу ацетильной группой, а по С-концу - амидной группой. После отщепления от смолы пептиды осаждали и осадок лиофилизовали. Затем пептиды очищали обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией и идентичность пептидов подтверждали с помощью масс-спектрометрии электрораспылением. В этом примере Т20 (SEQ ID NO:4) использовали для функционального присоединения к полимеру, в результате чего получали конъюгат по изобретению. Как было подробно описано ранее, конъюгаты, состоящие из синтетических пептидов, не являющихся Т20 (SEQ ID NO:4), независимо от того, происходят ли они от области HR1 или от области HR2 gp41 ВИЧ-1, должны быть функционально сходными с различными конъюгатами, состоящими из проиллюстрированной здесь последовательности Т20 (SEQ ID NO:4), поскольку они имеют в основном одинаковый механизм действия (в ингибировании слияния), сконструированы в основном из аналогичных звеньев (гептад и мотивов типа "лейциновой молнии") и имеют аналогичную конформационную структуру (альфа-спирали и суперспиралям). Другими синтетическими пептидами являются, но не ограничиваются ими, аминокислотные последовательности, содержащие SEQ ID NO:3, 5-99 и 114. Аналогичным образом те же самые или подобные способы могут быть использованы для функционального присоединения любого синтетического пептида к полимеру. Хотя в этом примере показан только один тип синтетического пептида (например, с той же самой аминокислотной последовательностью), происходящего от области HR2 gp41 ВИЧ, однако из нижеследующего описания будет очевидно, что с той же самой молекулой полимера может быть функционально связан синтетический пептид более чем одного типа. Так, например, при получении конъюгата, содержащего не менее чем две молекулы синтетического пептида, функционально присоединенного к молекуле полимера, могут быть использованы различные другие комбинации, которыми являются, но не ограничиваются ими, комбинации, где: каждая молекула синтетического пептида происходит от области HR1 gp41 ВИЧ и содержит ту же самую (идентичную) аминокислотную последовательность, в отличие от другого синтетического пептида, содержащегося в конъюгате; каждая молекула синтетического пептида происходит от области HR1 gp41 ВИЧ и по крайней мере одна из молекул синтетического пептида отличается по своей аминокислотной последовательности в отличие от другого синтетического пептида, содержащегося в конъюгате (например, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:27, в том случае если конъюгат содержит две молекулы синтетического пептида, функционально присоединенные к полимеру); каждая молекула синтетического пептида происходит от области HR2 gp41 ВИЧ и содержит ту же самую (идентичную) аминокислотную последовательность в отличие от другого синтетического пептида, содержащегося в конъюгате; каждая молекула синтетического пептида происходит от области HR2 gp41 ВИЧ, и по крайней мере одна из молекул синтетического пептида отличается по своей аминокислотной последовательности в отличие от другого синтетического пептида, содержащегося в конъюгате (например, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, в том случае если конъюгат содержит две молекулы синтетического пептида, функционально присоединенные к полимеру); или по крайней мере одна из молекул синтетического пептида содержит аминокислотную последовательность, происходящую от области HR1, которая подвергается самосборке в растворе с образованием тримеров (например, SEQ ID NO:63), и по крайней мере одна из молекул синтетического пептида содержит аминокислотную последовательность, происходящую от области HR2 gp41 ВИЧ (например, SEQ ID NO:4) (поскольку незначительное число тримеров преимущественно связывается лишь с определенными синтетическими пептидами, происходящими от HR2, и с меньшей преимущественностью - с другими синтетическими пептидами, происходящими от HR2). Как очевидно из описания настоящего изобретения, различные комбинации синтетических пептидов могут быть также использованы в том случае, если более чем две молекулы синтетического пептида функционально присоединены к молекуле полимера. Число молекул синтетического пептида, функционально присоединенных к молекуле полимера, зависит от нескольких факторов, которыми могут быть, но не ограничиваются ими, размер полимера, состав полимера, состав синтетического пептида и число реакционноспособных функциональных групп полимера, доступных для функционального присоединения к синтетическому пептиду. Предпочтительно, чтобы число молекул синтетического пептида, функционально присоединенных к молекуле полимера, составляло примерно от 2 до 20, а более предпочтительно примерно от 2 до 5. Кроме того, как очевидно для специалиста, и в зависимости от реакционноспособных функциональных групп, используемых для функционального присоединения синтетического пептида к полимеру, не менее чем две молекулы синтетического пептида могут быть функционально присоединены к полимеру посредством части синтетического пептида, выбранного из группы, состоящей из карбокси-конца (С-конца), амино-конца (N-конца), внутреннего лизина и их комбинации (например, где одна молекула синтетического пептида функционально связана посредством своего С-конца, а другая молекула синтетического пептида функционально связана посредством своего N-конца, и т.п.).

В одном иллюстративном варианте осуществления изобретения, и как показано на фиг.2, конъюгат по изобретению получали путем функционального связывания двух молекул Т20 (SEQ ID NO:4) посредством N-конца синтетического пептида с реакционноспособными функциональными группами полимера, ПЭГ. Более конкретно молекула Т20 (SEQ ID NO:4) была функционально связана амидной связью с ПЭГ-кислотой, тогда как другая молекула Т20 (SEQ ID NO:4) была функционально связана амидной связью со второй ПЭГ-кислотой, в результате чего был получен конъюгат, содержащий димер Т20-ПЭГ. Так, например, двухосновную ПЭГ-кислоту (приблизительно 300 дальтон, 11,4 мг, 0,0339 ммоль), 7-аза-1-гидроксибензотриазол (НОАТ, 10 мг, 0,0746 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (DIEA, 13,1 мг, 0,102 ммоль) растворяли в диметилформамиде (ДМФ) (5 мл), а затем добавляли тетрафторборат О-бензотриазол-1-ил-N,N,N'N'-тетраметилурония (TBTU, 21,8 мг, 0,0678 ммоль). Раствор перемешивали в течение 5 минут при комнатной температуре и добавляли Т20, защищенный по боковой цепи (500 мг, 0,0678 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Для осаждения пептида добавляли воду (15 мл). Твердое вещество собирали вакуумной фильтрацией, промывали водой (2 × 5 мл) и сушили, в результате чего получали димер "защищенный по боковой цепи Т20 - ПЭГ" (487 мг) с выходом 96%. Этот димер "защищенный по боковой цепи Т20 - ПЭГ" (485 мг) растворяли в трифторуксусной кислоте (TFA, 6,3 мл), содержащей воду (0,35 мл) и дитиотрейтол (DTT, 0,35 г) в качестве акцепторов катионов. Раствор перемешивали при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 4 часов. Для осаждения неочищенного димера Т20-ПЭГ добавляли метил-трет-бутиловый эфир (МТВЕ). Твердое вещество центрифугировали в центрифуге и МТВЕ декантировали в отходы. Цикл МТВЕ-промывок повторяли два раза. Твердое вещество растворяли в смеси вода/ACN, 3:1 (ацетонитрил, 40 мл), и рН доводили до 6-7 добавлением гидроксида аммония. Затем рН раствора снижали до 4-5 добавлением уксусной кислоты (0,5 мл). Полученный мутный раствор оставляли на ночь при комнатной температуре для снятия защиты с боковой цепи. Полученную взвесь доводили до рН 7-8, и все твердые вещества снова вводили в раствор, а затем замораживали и лиофилизовали с получением неочищенного димера Т20-ПЭГ (375 мг). Неочищенный димер Т20-ПЭГ очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с использованием обращенной фазы С18, 5 микрон, упакованной в качестве стационарной фазы, и с использованием смеси ацетонитрил/вода с 0,1% TFA в качестве подвижной фазы (40-50% органических веществ в течение 90 минут). Фракции, содержащие чистый продукт, собирали, замораживали и лиофилизовали с получением 40 мг конъюгата (89,8% по площади, ВЭЖХ, МС: найдено 9196,545, вычислено 9196,489).

Хотя в этом иллюстративном примере описано функциональное присоединение N-конца синтетического пептида к полимеру, однако специалисту очевидно, что для функционального присоединения синтетического пептида к полимеру могут быть использованы и другие методы. Так, например, карбокси-конец синтетического пептида может быть функционально присоединен к полимеру стандартными методами, известными специалистам (например, карбокси-конец синтетического пептида, имеющего концевой амин, может быть функционально связан с ПЭГ-карбоновой кислотой). В другом примере внутренний лизин синтетического пептида функционально присоединяют (через аминную реакционноспособную функциональную группу) к полимеру хорошо известными методами (например, путем активации ПЭГ с использованием активного сложного эфира и N-гидроксисукцинимида, которая приводит к модификации аминогруппы боковой цепи лизинового остатка, расположенного внутри аминокислотной последовательности синтетического пептида).

Так, например, синтетический пептид был функционально присоединен к полимеру своим С-концом с образованием конъюгата по изобретению. Более конкретно две молекулы синтетического пептида (Т20, SEQ ID NO:4) были функционально присоединены через их соответствующие реакционноспособные функциональные группы к ПЭГ₆-диамину в несколько последовательных стадий синтеза.

Стадия 1. Получение ПЭГ ₆-(NH-Phe-Z)₂

В 50-миллилитровую круглодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой, загружали Z-Phe-ОН (0,43 г, 1,43 ммоль, 2 экв.), 6-CI-HOBT (0,27 г, 1,57 ммоль, 2,2 экв.), ацетонитрил (6 мл) и DIEA (0,37 мл, 2,14 ммоль, 3 экв.). Полученный желтый раствор охлаждали в ледяной бане при 0-5°С, а затем добавляли HBTU (0,60 г, 1,57 ммоль, 2,2 экв.). К полученному раствору добавляли ПЭГ ₆-диамин (0,20 г, 0,714 ммоль, 1,0 экв.), а затем добавляли СН₂Cl₂ (2 мл × 2). Реакционную смесь перемешивали при 0-5°С в течение 15 минут, а затем нагревали до комнатной температуры и перемешивали еще 1,5 часа. Реакционную смесь переносили в 125-миллилитровую делительную воронку, а затем добавляли СН₂ Cl₂ (10 мл × 3) и промывали раствором NaHCO₃ (0,33М, 15 мл × 3) и раствором NaCl (15 мл). Органическую фазу сушили над MgSO ₄ и фильтровали. Остаток, полученный после удаления растворителя, наносили на колонку с силикагелем, которую дезактивировали 10%-ным Et₃N в гексане. Нужный продукт элюировали смесью СН₂Cl₂-МеОН (20:1). После удаления растворителя получали соединение 1, ПЭГ ₆-(NH-Phe-Z)₂, в виде бесцветного масла (0,23 г, 40%).

Стадия 2. Получение ПЭГ ₆-(NH-Phe-Н) ₂

В 50-миллилитровую круглодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой, загружали соединение 1, ПЭГ ₆-(NH-Phe-Z)₂ (0,20 г, 0,24 ммоль), 10% Pd-C (сухой, 50 мг) и МеОН (10 мл). Реактор дегазировали путем двойной обработки смесью N₂/H ₂, а затем гидрировали при комнатной температуре баллонным Н₂ в течение ночи. Pd-C отфильтровывали и растворитель удаляли с получением соединения 2, ПЭГ ₆-(NH-Phe-Н)₂, в виде бесцветного масла (0,13 г, 95%).

Стадия 3. Получение ПЭГ ₆-(NH-АА(36-27)-Fmoc) ₂

Следует отметить, что AA(36-27) означает аминокислоты 36-27 SEQ ID NO:4. В 100-миллилитровую круглодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой, загружали соединение 2, ПЭГ ₆-(NH-Phe-Н)₂ (0,44 г, 0,76 ммоль, 1 экв.), Fmoc-AA(27-35)-OH (3,34 г, 1,53 ммоль, 2 экв.), HOAT (0,31 г, 2,3 ммоль, 3,0 экв.), DIEA (0,53 мл, 3,1 ммоль, 4 экв.) и ДМФ (20 мл). Полученный желтый раствор охлаждали в ледяной бане при 0-5°С, а затем добавляли HBTU (0,61 г, 1,61 ммоль, 2,1 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 0-5°С в течение 10 минут, а затем нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 часов. В реакционную смесь, помещенную в ледяную баню, добавляли H₂O (30 мл), и полученную белую взвесь перемешивали в течение 30 минут, а затем подвергали вакуумной фильтрации. Белое твердое вещество промывали H ₂O (30 мл) и сушили в вакуумной печи (35°С) в течение ночи (3,85 г, неочищенное соединение 3, ПЭГ₆ -(NH-AA(36-27)-Fmoc)₂).

Стадия 4. Получение ПЭГ₆-(NH-АА(36-27)-Н) ₂

К раствору неочищенного соединения 3, ПЭГ₆-(NH-AA(36-27)-Fmoc) ₂ (3,30 г, 0,67 ммоль) в ДМФ (10 мл) добавляли пиперидин (0,53 мл, 5,4 ммоль, 8 экв.). После перемешивания при комнатной температуре в течение 4 часов реакционную смесь охлаждали в ледяной бане и добавляли H₂O (15 мл). Полученную белую взвесь перемешивали 20 минут, а затем фильтровали. Белое твердое вещество промывали смесью МТВЕ-гептан (1:1, 25 мл × 2), а затем снова переносили в 100-миллилитровую колбу и растирали с EtOH-H₂O (1:1, 10 мл). Твердое вещество собирали вакуумной фильтрацией и промывали EtOH-H ₂O (1:1, 20 мл). Фильтрацию и промывку EtOH-H ₂O повторяли еще раз. Неочищенное соединение 4, ПЭГ ₆-(NH-AA(36-27)-Н)₂ сушили в вакуумной печи (35°С) в течение ночи (2,53 г).

Стадия 5. Получение ПЭГ₆-(NH-АА(36-17)-Fmoc) ₂

Следует отметить, что на этой стадии добавляли аминокислоты 26-17 SEQ ID NO:4. В 100-миллилитровую круглодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой, загружали соединение 4, ПЭГ₆-(NH-AA(36-27)-Н) ₂ (1,82 г, 0,41 ммоль, 1 экв.), Fmoc-AA(17-26)-OH (1,87 г, 0,82 ммоль, 2 экв.), HOAT (0,17 г, 1,23 ммоль, 3,0 экв.), DIEA (0,31 мл, 1,64 ммоль, 4 экв.) и ДМФ (25 мл). Полученный желтый раствор охлаждали в ледяной бане при 0-5°С, а затем добавляли HBTU (0,33 г, 0,86 ммоль, 2,1 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 0-5°С в течение 15 минут, а затем нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 часов. В реакционную смесь, помещенную в ледяную баню, добавляли H ₂O (30 мл) и полученную белую взвесь перемешивали в течение 30 минут, а затем подвергали вакуумной фильтрации. Белое твердое вещество промывали H₂O (30 мл), а затем возвращали в 100-миллилитровую колбу, загруженную IPA-H ₂O (95:5, 20 мл). Смесь нагревали до 60°С в течение 5 минут и постепенно охлаждали до комнатной температуры. Твердое вещество собирали вакуумной фильтрацией и промывали IPA (5 мл × 4). Неочищенное соединение 5, ПЭГ₆ -(NH-AA(36-27)-Fmoc)₂, сушили на воронке под вакуумом (4,4 г не полностью осушенного продукта).

Стадия 6. Получение ПЭГ₆ -(NH-АА(36-17)-Н)₂

К раствору неочищенного соединения 5, ПЭГ₆-(NH-AA(36-17)-Fmoc) ₂ (3,0 г, неосушенного) в NMP (10 мл) добавляли DBU (100 мкл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 1 часа добавляли смолу PL-SO₃H (150 мг) и смесь продолжали перемешивать в течение 40 минут. Смолу отфильтровывали и промывали NMP (10 мл). После обработки раствора NMP водой (H ₂O) (30 мл) получали молокообразную эмульсию. К этой эмульсии добавляли H₂O (100 мл), после чего смесь лиофилизовали. Полученное желтое клейкое масло суспендировали в EtOH (10 мл), нагревали до 50°С в течение 5 минут, а затем охлаждали до комнатной температуры. После добавления H ₂O (20 мл) получали белую взвесь и эту взвесь перемешивали 30 минут. Белое твердое вещество собирали вакуумной фильтрацией и промывали EtOH-H₂O (1:1, 10 мл × 2). Неочищенное соединение 6, ПЭГ₆-(NH-AA(36-17)-Н) ₂, сушили в вакуумной печи (35°С) в течение ночи.

Стадия 7. Получение ПЭГ₆ -(NH-АА(36-1)-Ac)₂

Следует отметить, что на этой стадии добавляли аминокислоты 16-1 SEQ ID NO:4. В 50-миллилитровую круглодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой, загружали соединение 6, ПЭГ ₆-(NH-AA(36-17)-Н)₂ (0,48 г, 0,056 ммоль, 1 экв.), Fmoc-AA(1-16)-Ас (0,37 г, 0,112 ммоль, 2 экв.), HOAT (0,023 г, 0,169 ммоль, 3,0 экв.), DIEA (0,040 мл, 0,225 ммоль, 4 экв.) и ДМФ (5 мл). Полученный желтый раствор охлаждали в ледяной бане при 0-5°С, а затем добавляли HBTU (0,047 г, 0,124 ммоль, 2,2 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 0-5°С в течение 15 минут, а затем нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 часов. В реакционную смесь в ледяной бане добавляли H₂O (30 мл) и полученную белую взвесь перемешивали в течение 30 минут, а затем подвергали вакуумной фильтрации. Белое твердое вещество промывали H₂O (30 мл), а затем возвращали в 50-миллилитровую колбу и растирали с MeCN-H₂O (9:1). Твердое вещество собирали вакуумной фильтрацией и промывали H ₂O (10 мл×2). Неочищенное соединение 7, ПЭГ ₆-(NH-AA(36-1)-Ac)₂, сушили на воронке под вакуумом (0,73 г не полностью осушенного продукта).

Стадия 8. Получение ПЭГ₆ -(Т20)₂

В 25-миллилитровую колбу с неочищенным соединением 7, ПЭГ₆-(NH-AA(36-1)-Ac) ₂ (0,20 г) загружали TFA/DTT/H₂O (90:5:5, 2,5 мл). Полученный желтый раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. К реакционной смеси, охлажденной в ледяной бане, добавляли МТВЕ (8 мл) и полученную взвесь перемешивали в течение 20 минут, а затем фильтровали в вакууме. Желтое твердое вещество промывали МТВЕ (5 мл × 2) и сушили на воронке под вакуумом в течение 30 минут (с получением не полностью сухого вещества). Желтое твердое вещество растворяли в MeCN/H₂O (1:1, 1 мл). Полученную желтую суспензию фильтровали через вату и промывали MeCN/H ₂O (1:1, 1 мл × 2). рН объединенного раствора доводили до 4 путем добавления раствора NaHCO₃ (0,33н.). К этому раствору добавляли НОАс (60 мкл) и светло-желтый раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. рН реакционной смеси доводили до 8 путем добавления раствора К ₂СО₃ (1М). Раствор разбавляли MeCN-H ₂O (15:85, 3 мл) и наносили на ВЭЖХ-колонку для разделения (PLRP-XL, 300A, 10 мкм, 20 × 300 мм; буфер А, 100 мМ NH ₄ОАс в H₂O, рН, доведенный до 8,5 путем добавления NH₄ОН; буфер В, MeCN: градиент: 20%-40%, 60 минут; скорость потока: 15 мл/мин). Собранные фракции оценивали с помощью ВЭЖХ соответственно и чистые фракции объединяли для лиофилизации. Конечный продукт, содержащий конъюгат настоящего изобретения (ПЭГ₆-(Т20) ₂), получали в виде белого порошка, 5,5 мг.

Пример 2

В этом примере проиллюстрирована повышенная биологическая доступность (например, продолжительность времени полужизни в кровотоке in vivo) конъюгата по изобретению по сравнению со временем полужизни синтетического пептида, взятого отдельно. Синтетический пептид и конъюгат были получены с использованием методов и композиций, описанных в примере 1, представленном выше. При этом важно отметить, что стандартная модель животного, используемая для определения биологической доступности, коррелировала с биологической доступностью синтетического пептида в организме (in vivo) человека (как более подробно описано в патенте США № 6258782). Вкратце, канюлированным мышам внутривенно вводили дозу либо синтетического пептида, либо конъюгата по изобретению, где концентрацию дозы в растворе определяли методом Эдельхоха, и корректировали по массе животного, в результате чего эта доза составляла 10 мг/кг. Пробы крови брали через предварительно определенные интервалы времени (0, 15, 30 мин. и 1, 2, 4, 6 и 8 часов) и вводили в пробирки-сборники, содержащие антикоагулянт (EDTA). Из каждой пробирки-сборника собирали плазму, которую затем анализировали с помощью флуоресцентной жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД). Помимо разведений образца делали серийные разведения дозосодержащего раствора в буфере, а также в плазме и эти разведения использовали для построения стандартной кривой зависимости площади пика от известной концентрации пептида. Затем эту кривую использовали для вычисления концентрации пептида в плазме с учетом всех проведенных разведений и количества, введенного в колонку. Время полужизни (t 1/2) и общая AUC (площадь под кривой) отдельно взятого синтетического пептида и конъюгата, содержащего синтетический пептид по изобретению, представлены в таблице 1.

Таблица 1
Тестируемый агент	AUC (мкг·час/мл)	t 1/2 (часы)
Пептид Т20	158	1,6
Конъюгат	500	4,3

Как проиллюстрировано в таблице 1, конъюгат по изобретению может иметь значительно более продолжительное (более чем в два раза) время полужизни в кровотоке по сравнению с временем полужизни отдельно взятого синтетического пептида в кровотоке.

Пример 3

В этом примере проиллюстрирован неожиданный результат, полученный для противовирусной активности с использованием конъюгатов по изобретению. Важно отметить, что в in vitro-анализе на противовирусную активность противовирусный эффект синтетического пептида, продемонстрированный в in vitro-анализе, коррелировал с противовирусным эффектом синтетического пептида in vivo. Для определения противовирусной активности (например, оценки способности ингибировать передачу ВИЧ клетке-мишени) конъюгатов по изобретению был проведен in vitro-анализ, который показал, что исходя из данных, полученных с использованием синтетических пептидов, происходящих от любой из областей HR gp41 ВИЧ, может быть определена противовирусная активность, наблюдаемая in vivo. Более конкретно было показано, что противовирусная активность, наблюдаемая с использованием in vitro анализа на инфекционность ("анализ на инфекционность Magi-CCR5", см., например, патент США № 6258782), хорошо коррелирует с противовирусной активностью, наблюдаемой in vivo для тех же самых пептидов, происходящих от gp41 ВИЧ (см., например, Kilby et al., 1998, Nature Med. 4:1302-1307). Кроме того, следует подчеркнуть, что каждый из Т20 (SEQ ID NO:4) и Т1249 (SEQ ID NO:5) продемонстрировал сильную противовирусную активность, направленную против ВИЧ как в in vitro анализе на инфекционность, так и в клинических испытания с участием человека.

Для оценки результатов анализа на снижение титров инфекционности вируса использовали индикаторные клеточные линии MAGI или CCR5-экспрессирующие производные cMAGI. Обе клеточные линии использовали способность tat ВИЧ-1 к трансактивации экспрессии репортерного гена -галактозидазы, регулируемого ВИЧ-LTR. Репортерный ген -gal был модифицирован так, чтобы он присутствовал в ядре и мог быть детектирован с использованием субстрата Х-gal в качестве интенсивного ядерного окрашивающего агента, действующего в течение нескольких дней после инфицирования. Таким образом, число окрашенных ядер может интерпретироваться как число, равное числу инфекционных вирионов при заражении инокулятом, если до окрашивания был проведен только один цикл инфицирования. Инфицированные клетки были подсчитаны с использованием CCD-визуализатора и оба, как первичный, так и лабораторный адаптированный, изоляты обнаруживали линейную зависимость между уровнем вхождения вируса в клетку и числом инфицированных клеток, визуализированных с помощью формирователя изображения. В анализах с использованием MAGI и cMAGI, 50% снижение титра инфекционности является значимым (Vn/Vo=0,5) и дает начальную пороговую величину для оценки противовирусной активности ("IC50" определяли как разведение, при котором достигается 50% снижение титра инфекционного вируса). Оценивали также и второе пороговое значение Vn/Vo=0,1, соответствующее 90%-ному снижению титра инфекционности ("IC90"). Пептиды, тестируемые на противовирусную активность, разводили в различных концентрациях и тестировали против скорректированного ВИЧ-инокулята с двумя или тремя повторениями, в результате чего получали примерно 1500-2000 инфицированных клеток на лунку в 48-луночном микротитрационном планшете. Пептид (при соответствующем разведении) добавляли к клеткам cMAGI или MAGI, после чего добавляли вирусный инокулят, а через 24 часа добавляли ингибитор инфицирования и слияния клеток (например, Т20) для предотвращения прохождения вторых циклов ВИЧ-инфицирования и распространения вируса на другие клетки. Клетки культивировали еще 2 дня, а затем фиксировали и окрашивали субстратом Х-gal для детекции ВИЧ-инфицированных клеток. Число инфицированных клеток для каждого контрольного и пептидного разведения определяли с помощью CCD-визуализатора, а затем вычисляли IC50 и IC90 (выраженные в мкг/мл).

В этом первом примере противовирусной активности два клинических изолята ВИЧ получали от одного и того же ВИЧ-инфицированного индивидуума. Первый изолят, который для удобства обозначали "Т20S ВИЧ-1", был чувствительным к противовирусному действию Т20 (SEQ ID NO:4) как in vitro, так и in vivo. Второй изолят, который для удобства обозначали "Т20R ВИЧ-1", был резистентным к противовирусному действию Т20 (SEQ ID NO:4) как in vitro, так и in vivo. Два клинических изолята, Т20S ВИЧ-1 и Т20R ВИЧ-1, были использованы в in vitro-анализе на инфекционность, в котором противовирусное действие Т20 (SEQ ID NO:4; отдельно взятый синтетический пептид; таблица 2, "пептид Т20") сравнивали с противовирусным действием конъюгата по изобретению (например, конъюгата, содержащего две молекулы Т20 (SEQ ID NO:4), функционально присоединенные к ПЭГ; таблица 2, "конъюгат"), и полимер (например, ПЭГ), имеющий одну молекулу синтетического пептида (Т20), функционально присоединенную к этому полимеру (таблица 2, "ПЭГ-Т20-мономер"). Результаты, выраженные в величинах IC50 в нг/мл, проиллюстрированы в таблице 2.

Таблица 2
Протестированный агент	Т20S ВИЧ-1: IC50	Т20R ВИЧ-1: IC50
Пептид Т20	10	1211
Конъюгат	32	49
ПЭГ-Т20-мономер	1149	>20000

Исходя из результатов, представленных в таблице 2, может быть сделано несколько выводов. Во-первых, как показали результаты, полученные с использованием Т20-чувствительного ВИЧ-изолята, конъюгат по изобретению (в котором по крайней мере две молекулы синтетического пептида функционально присоединены к молекуле полимера) сохранял значительную биологическую (противовирусную) активность по сравнению с активностью отдельно взятого синтетического пептида (например, эти активности отличались лишь в 3 раза, и это различие было гораздо меньше, чем логарифмическая разность). В противоположность этому, как показали результаты, полученные с использованием Т20-чувствительного изолята, полимер, имеющий только одну молекулу синтетического пептида, функционально присоединенную к этому полимеру (например, таблица 2, "ПЭГ-Т20-мономер"), обнаруживал значительное изменение (log-снижение) биологической активности по сравнению с активностью отдельно взятого синтетического пептида. Было неожиданно обнаружено, что биологическая активность конъюгата сохранялась на более высоком уровне по сравнению с биологической активностью ПЭГ-Т20-мономера, чем это могло наблюдаться при аддитивном эффекте нескольких молекул синтетического пептида на одно соединение (например, эффекте двух молекул синтетического пептида, функционально связанных с полимером по сравнению с эффектом одной молекулы синтетического пептида, функционально связанной с полимером).

Во-вторых, как показали результаты, полученные с использованием Т20-резистентного ВИЧ-изолята, было неожиданно обнаружено, что конъюгат по изобретению обладал более сильной противовирусной активностью (по крайней мере, по логарифмической разности) против ВИЧ-изолята, который был резистентным к действию отдельно взятого синтетического пептида (и который также был резистентным к ПЭГ-Т20-мономеру). Более конкретно, совершенно неожиданно было обнаружено, что конъюгат, имеющий две функционально присоединенные молекулы Т20, обладал значительной противовирусной активностью против Т20-резистентного ВИЧ-изолята (с усиленным действием). Результаты, систематизированные в таблице 2, в целом показали, что конъюгат по изобретению сохраняет значительную биологическую активность, то есть противовирусную активность, направленную против ВИЧ, и обладает усиленным действием против ВИЧ-резистентных штаммов по сравнению с отдельно взятым синтетическим пептидом. Эта биологическая активность была продемонстрирована в in vitro-анализе, и было установлено, что она коррелировала с противовирусным действием, наблюдаемым in vivo.

Для дополнительной иллюстрации неожиданных результатов, которые указывали на то, что конъюгат по изобретению обладал сильной противовирусной активностью против ВИЧ-изолята, резистентного к отдельно взятому синтетическому пептиду, были протестированы некоторые другие Т20-чувствительные изоляты и Т20-резистентные изоляты (изоляты "А-D") с использованием in vitro анализа на инфекционность, как показано в таблице 3. IC50 и IC90 были выражены в мкг/мл.

Результаты, систематизированные в таблице 3, в целом показали, что конъюгат по изобретению не только сохранял значительную биологическую активность, то есть противовирусную активность, направленную против ВИЧ (по сравнению с отдельно взятым синтетическим пептидом), но также неожиданно обнаруживал усиленное действие, то есть сильную противовирусную активность, направленную против ВИЧ-изолятов, которые были резистентными к отдельно взятому синтетическому пептиду.

Таблица 3
Вирус	Пептид Т20 IC50	Пептид Т20 IC90	Конъюгат IC50	Конъюгат IC90
HIV-1 T20S-A	0,006	0,078	0,034	0,200
HIV-1 T20R-A	>5	>5	0,330	2,524
HIV-1 T20S-B	0,029	0,117	0,013	0,087
HIV-1 T20R-B	1,898	7,179	0,044	0,257
HIV-1 T20S-C	0,006	0,073	0,024	0,151
HIV-1 T20R-C	1,544	6,285	0,105	0,610
HIV-1 T20S-D	0,018	0,208	0,063	0,457
HIV-1 T20R-D	2,039	>5	0,030	0,210

Для дополнительной иллюстрации того, что конъюгат по изобретению сохраняет значительную биологическую активность по сравнению с активностью отдельно взятого синтетического пептида, были протестированы дополнительные ВИЧ-штаммы в in vitro-анализе на инфекционность. Как видно в Таблице 4, IC50 и IC90 были выражены в мкг/мл.

Таблица 4
Вирус	Пептид Т20 IC50	Пептид Т20 IC90	Конъюгат IC50	Конъюгат IC90
IIIB/CEM4	0,007	0,052	0,035	0,206
3'GIV/CEM4	0,008	0,050	0,034	0,194
SIM/CEM4	0,584	3,398	0,038	0,216

Результаты, систематизированные в таблице 4, в целом показали, что конъюгат по изобретению не только сохранял значительную биологическую активность, то есть противовирусную активность, направленную против ВИЧ (по сравнению с отдельно взятым синтетическим пептидом), но также в некоторых случаях неожиданно обнаруживал более сильную противовирусную активность, чем активность отдельно взятого синтетического пептида.

Способами, описанными в примере 1, были продуцированы дополнительные конъюгаты с использованием различных полимеров, различных концов синтетического пептида, которые были функционально присоединены к полимеру, и различных реакционноспособных функциональных групп, используемых для функционального присоединения синтетического пептида к полимеру. Две молекулы синтетического пептида (например, SEQ ID NO:4) были функционально связаны с полимером. Затем такие конъюгаты тестировали на противовирусную активность, направленную против ВИЧ-изолятов IIIB, Т20S ВИЧ-1 и Т20R ВИЧ-1 (см. таблицу 2 для ВИЧ-резистентных штаммов), где указанную противовирусную активность (IC50) выражали в мгк/мл. Результаты, полученные для различных конъюгатов (таблица 5, А-Q), представлены в таблице 5, где указаны концы синтетического пептида, используемые для функционального присоединения к полимеру (таблица 5, С-конец, обозначен "С", N-конец обозначен "N"), либо внутренний лизин, если он используется (таблица 5, "Lys 18" означает лизиновый аминокислотный остаток 18 в аминокислотной последовательности синтетического пептида), а также противовирусная активность (IC50) против штамма IIIB ВИЧ-1 (таблица 5, "IIIB"), противовирусная активность (IC50) против штамма Т20S ВИЧ-1 (таблица 5, "Т20S"),и противовирусная активность (IC50) против штамма Т20R ВИЧ-1 (таблица 5, "Т20R").

Таблица 5
Тестируемый конъюгат	Конец	Полимер	IIIB	Т20S	Т20R
Отдельный синтетический пептид	-	-	0,007	0,010	1,2
A	N	ПЭГ 6	0,037	0,029	0,050
B	C	ПЭГ 6	0,117	0,053	0,070
C	C	ПЭГ 6	0,065	0,046	0,050
D	N	алкил С5	0,039	0,036	0,049
E	N	ПЭГ 8	0,018	0,026	0,020
F	N	алкил С8	0,089	0,049	0,087
G	N	алкил С11	0,174	0,176	0,218
H	N	АТ	0,046	0,047	0,124
I	N	ПЭГ 4-6-4	0,029	0,012	0,029
J	N	ПЭГ 3	0,036	0,028	0,049
K	N	ПЭГ 4	0,033	0,026	0,067
L	C	GLY-ПЭГ 3	0,107	0,061	0,066
M	C	GLY-C2	0,139	0,085	0,114
N	N	ПЭГ 10	0,039	0,017	0,023
O	C	GLY-C6	0,140	0,083	0,044
P	C	GLY-ПЭГ 6	0,088	0,031	0,051
Q	Lys 18	ПЭГ 6	0,057	0,055	0,120

В таблице 5 число, указанное после "ПЭГ", означает число этиленовых звеньев, содержащихся в ПЭГ (кратные числа соответствуют множеству ПЭГ-звеньев, где дискретные молекулы функционально связаны друг с другом); алкил с указанной после него цифрой означает алкильную цепь с соответствующим числом атомов углерода, содержащихся в алкильной цепи; GLY означает аминокислоту глицин, которая была использована в качестве линкера между полимером и синтетическим пептидом; а АТ означает трехосновную кислоту (например, трисукцинимидиламинотриацетат). Результаты, систематизированные в таблице 5, продемонстрировали, что каждый из различных проиллюстрированных конъюгатов по изобретению не только сохраняет значительную биологическую активность, направленную против ВИЧ-1 (по сравнению с активностью отдельно взятого синтетического пептида), но, как было неожиданно обнаружено, также обладает усиленным действием против ВИЧ-резистентных изолятов по сравнению с отдельно взятым синтетическим пептидом.

Пример 4

В другом иллюстративном варианте осуществления изобретения конъюгат по изобретению получали путем функционального связывания двух молекул SEQ ID NO:114 посредством N-конца синтетического пептида с реакционноспособными функциональными группами полимера ПЭГ. Более конкретно молекула SEQ ID NO:114 была функционально связана с ПЭГ-кислотой, тогда как другая молекула SEQ ID NO:114 была функционально связана со второй молекулой ПЭГ-кислоты, в результате чего получали конъюгат, содержащий димер SEQ ID NO:114-ПЭГ. Так, например, двухосновную ПЭГ-6-кислоту (5,4 мг, 0,016 ммоль) и тетрафторборат О-(1Н-6-хлорбензотриазол-1-ил)-N,N,N'N'-тетраметилурония (TCTU, 11,4 мг, 0,032 ммоль) растворяли в 1,5 мл смеси ДХМ:ДМФ, 2:1 (дихлорметан:диметилформамид). Затем добавляли N,N-диизопропилэтиламин (DIEA, 11,1 мкл, 0,064 ммоль), после чего сразу добавляли защищенный по боковой цепи пептид "Н (водород)-SEQ ID NO:114 (250 мг, 0,032 ммоль). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. ДХМ удаляли на роторном испарителе, а затем для осаждения пептида добавляли воду (5 мл). Твердое вещество собирали вакуумной фильтрацией, промывали водой (3 × 5 мл) и сушили с получением защищенного по боковой цепи димера "SEQ ID NO:114 - ПЭГ-6" (225 мг) с выходом 90%. Защищенный по боковой цепи димер "SEQ ID NO:114 - ПЭГ-6" (225 мг) растворяли в трифторуксусной кислоте (TFA, 4,5 мл), содержащей воду (0,25 мл) и дитиотреитол (DTT, 0,25 г) в качестве акцепторов катионов. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов. Для осаждения неочищенного димера "SEQ ID NO:114 - ПЭГ-6" добавляли метил-трет-бутиловый эфир (МТВЕ). Раствор декантировали и твердое вещество несколько раз промывали МТВЕ, а затем фильтровали и сушили на воздухе. Твердое вещество растворяли в 10 мл смеси вода/ацетонитрил, 1:1, и рН доводили до 6-7 добавлением разбавленного гидроксида аммония. Затем рН раствора снижали до 4-5 добавлением уксусной кислоты (0,2 мл). Полученный прозрачный раствор оставляли, перемешивая, на ночь при комнатной температуре для снятия защиты с боковой цепи. Раствор замораживали, а затем лиофилизовали с получением неочищенного димера "SEQ ID NO:114 - ПЭГ-6" (150 мг). Неочищенный димер "SEQ ID NO:114 - ПЭГ-6" очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с использованием обращенной фазы С18, 5 микрон, упакованной в качестве стационарной фазы, и с использованием смеси ацетонитрил/вода с 0,1% TFA в качестве подвижной фазы (40-70% органических веществ в течение 90 минут). Фракции, содержащие чистый продукт, собирали, замораживали и лиофилизовали с получением 8 мг конъюгата по изобретению (89,2%, ВЭЖХ, МС: найдено 9268,43, вычислено 9268,35).

В способах, описанных в примере 3, для определения противовирусной активности штамм ВИЧ-1, который был чувствительным к противовирусному действию пептида, содержащего SEQ ID NO:114 (таблица 6, "114-S"), и штамм ВИЧ-1, который был резистентным к обработке пептидом, содержащим SEQ ID NO:114 (таблица 6, "114-R"), использовали in vitro анализе на инфекционность, в котором противовирусную активность пептида, содержащего SEQ ID NO:114 (таблица 6, "отдельно взятый синтетический пептид") сравнивали с противовирусной активностью конъюгата по изобретению (например, конъюгата, содержащего две молекулы SEQ ID NO:114, функционально присоединенные к ПЭГ-6; таблица 6, "конъюгат"). Результаты, выраженные в величинах IC50 и IC90, в мкг/мл, проиллюстрированы в таблице 6.

Таблица 6
Протестированный агент	114S:	IC50	IC90	114R:	IC50	IC90
Отдельно взятый синтетический пептид		0,005	0,034		2,40	>20
Конъюгат		0,016	0,169		0,151	2,46

Результаты, систематизированные в таблице 6, неожиданно показали, что конъюгат по изобретению не только сохранял значительную биологическую активность, направленную против ВИЧ (по сравнению с активностью отдельно взятого синтетического пептида), но также обладал усиленным действием против ВИЧ-изолятов, резистентных к отдельно взятому синтетическому пептиду. Кроме того, конъюгат, проиллюстрированный в этом примере, подтверждает общие свойства синтетических пептидов, происходящих либо от области HR1, либо от области HR2 gp41 ВИЧ-1, и используемых для получения конъюгата по изобретению.

Пример 5

Настоящее изобретение относится к конъюгатам, которые обладают противовирусной активностью, на что указывает их способность ингибировать передачу ВИЧ клетке-мишени; и к способу ингибирования передачи ВИЧ клетке-мишени, где указанный способ предусматривает введение в вирус и в клетку конъюгата по изобретению в количестве, эффективном для ингибирования инфицирования клетки вирусом ВИЧ, а более предпочтительно для ингибирования слияния вируса и клетки-мишени. Этот способ может быть использован для лечения (терапевтического) ВИЧ-инфицированных индивидуумов или для лечения (профилактического) индивидуумов, уже подвергавшихся воздействию вируса, или индивидуумов с высоким риском ВИЧ-инфицирования (например, индивидуумов, употребляющих наркотики или имеющих беспорядочные половые связи). Так, например, в случае ВИЧ-1-инфицированного индивидуума эффективное количество конъюгата должно быть введено в дозе, достаточной для снижения нагрузки вирусом ВИЧ у этого индивидуума. Как известно специалистам, существует несколько стандартных методов измерения нагрузки вирусом ВИЧ, и такими методами являются, но не ограничиваются ими, количественная оценка культур мононуклеарных клеток периферической крови и РНК ВИЧ в плазме. Конъюгаты по изобретению могут быть введены один раз, с перерывами, периодически или непрерывно, как может быть определено лечащим врачом, например, путем мониторинга вирусной нагрузки. В зависимости от композиции, содержащей конъюгат, и таких факторов, как состав полимера и синтетического пептида, используемых для получения конъюгата, а также от наличия в данном конъюгате фармацевтически приемлемого носителя и от природы фармацевтически приемлемого носителя конъюгат по изобретению может быть введен с периодичностью, составляющей от нескольких дней до нескольких недель или более, если это возможно. Кроме того, конъюгат по изобретению может давать синергический эффект ингибирования передачи ВИЧ клетке-мишени при использовании в комбинации с другими противовирусными лекарственными средствами (например, путем одновременного введения или введения отдельными циклами, сначала с одним лекарственным средством, а затем с другим лекарственным средством), которые обычно применяются для лечения ВИЧ-инфекций (например, включая, но не ограничиваясь ими, другие ингибиторы передачи ВИЧ клетке (например, CCR5-ингибиторы, ретроциклин и т.п.), ингибиторы ВИЧ-интегразы, ингибиторы обратной транскриптазы (например, нуклеозидные или ненуклеозидные), ингибиторы протеазы и т.п., хорошо известные специалистам).

Эффективные дозы вводимого конъюгата по изобретению могут быть определены методами, хорошо известными специалистам, например, путем определения эффективности, биологического времени полужизни и токсичности. В предпочтительном варианте осуществления изобретения интервал эффективных доз конъюгата может быть определен специалистами с использованием результатов рутинных in vitro и in vivo исследований, хорошо известных специалистам. Так, например, в in vitro анализах на противовирусную активность, описанных в настоящей заявке, специалист может определить среднюю ингибирующую концентрацию (С) конъюгата, необходимую для блокирования определенного уровня вирусной инфекционности (например, 50%-ного ингибирования, IC ₅₀; или 90%-ного ингибирования, IC₉₀ ). Затем подходящие дозы могут быть выбраны специалистом с использованием фармакокинетических данных, полученных от одной или нескольких моделей животных, в результате чего может быть получена минимальная концентрация (С[min]) данного конъюгата, которая равна или превышает предварительно определенное количество IC. Хотя интервал доз обычно зависит от выбранного способа введения и от дозосодержащей композиции, однако приблизительный интервал доз конъюгата по изобретению может составлять в пределах от значения не ниже 0,1 мкг/кг массы тела и до значения не выше 10 мг/кг массы тела; предпочтительно в пределах примерно 0,1-100 мкг/кг массы тела; а предпочтительно примерно от 10 мг до 250 мг конъюгата.

Конъюгат по изобретению может быть введен индивидууму любым способом, обеспечивающим доставку активного агента в клетки-мишени (клетки, которые могут быть инфицированы ВИЧ). Так, например, конъюгаты по изобретению могут быть введены любым подходящим способом, включая пероральное, парентеральное (например, внутримышечные, внутрибрюшинные, внутривенные или подкожные инъекции или вливания, чрескожное введение или введение имплантата), интраназальное, пульмональное, вагинальное, ректальное, подъязычное или местное введение, и эти конъюгаты могут быть приготовлены в виде лекарственных форм, подходящих для каждого из указанных способов введения. Конкретный способ введения зависит, например, от истории болезни индивидуума, включая любые ожидаемые или предполагаемые побочные эффекты, связанные с таким введением, и от состава вводимого конъюгата (например, от природы полимера и синтетического пептида, содержащихся в данном конъюгате). Наиболее предпочтительным введением является инъекция (например, внутривенная или подкожная инъекция), но может быть также проведено и непрерывное вливание (с использованием, например, препаратов для пролонгированного высвобождения или мини-насосов, таких как осмотические насосы и т.п.). Конъюгат по изобретению может также содержать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, выбор которых зависит от нужной композиции, участка доставки, способа введения, схемы введения и других факторов, известных лечащему врачу. Кроме того, как будет более подробно описано ниже, конъюгат может содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие полимер и синтетический пептид, которые после их введения с использованием соответствующей техники и хорошо известных экспрессирующих векторов экспрессируются в представляющих интерес клетках.

Пример 6

Из описания, приведенного в настоящей заявке, специалисту очевидно, что если полимер, используемый для получения конъюгата по изобретению, является полимером, полученным на основе полиаминокислоты, то могут быть синтезированы или сконструированы полинуклеотиды, кодирующие такой конъюгат, и что этот конъюгат может быть продуцирован методами рекомбинантных ДНК, используемых в качестве средства для продуцирования (например, продуцирования in vivo) и/или в качестве метода ингибирования передачи ВИЧ клетке-мишени. Для специалиста также очевидно, что конъюгат по изобретению может кодироваться более чем одним полинуклеотидом и что такие полинуклеотиды могут быть синтезированы исходя из выбора кодонов-триплетов, о которых известно, что они кодируют аминокислоты аминокислотной последовательности данного конъюгата, и исходя из вырожденности третьего основания кодона и предпочтительности данного кодона-триплета в клетке-хозяине (например, прокариотической или эукариотической клеткой, и т.п.), в которой желательна экспрессия. Так, например, полимер может содержать полилизин, а лизин может быть кодирован любым из кодонов ААА или AAG. В другом примере может быть использован гетеродимер, состоящий из лизинов и аланинов, при этом аланин кодируется любым одним из кодонов GCA, GCG, GCC или GCU. В другом примере, в котором одна молекула синтетического пептида присоединена к амино-концу полимера, а вторая молекула синтетического пептида присоединена к карбокси-концу полимера, может оказаться желательным присутствие гибкого линкера, который функционально связывает молекулы синтетического пептида с полимером. Специалистам хорошо известно, что гибкий линкер, который может быть использован для функционального связывания двух аминокислотных последовательностей, может состоять из глицина или глицина, объединенного с другими аминокислотами, такими как серин. Известно, что глицин кодируется любым одним или несколькими кодонами, такими как GGU, GGC, GGA или GGG, а серин, как известно, кодируется любым одним или несколькими кодонами, такими как AGU, AGC, UCU, UCC, UCA или UCG. Репрезентативными примерами могут служить, но не ограничиваются ими, (цифра указывает на число молекул): Gly(3), GlySerGly, Gly(4)Ser(3), GlySer и т.п. Предпочтительный гибкий линкер может быть определен стандартными методами, известными специалистом. Так, например, конъюгат может содержать: синтетический пептид-гибкий линкер-полимер-гибкий линкер-синтетический пептид.

Иллюстративные, но неограничивающие примеры полинуклеотидов, кодирующих синтетический пептид, которые могут быть использованы для получения конъюгата по изобретению, включают SEQ ID NO: 100-106 (для синтетических пептидов, содержащих SEQ ID NO: 63, 65, 66, 61, 62, 4 и 5, соответственно); однако очевидно, что различные кодоны могут быть заменены кодонами, которые кодируют такие же аминокислоты, как и исходные кодоны. Кроме того, исходя из предпочтительности указанных здесь кодонов специалист может легко определить предпочтительность кодона для синтетического пептида аналогичной последовательности и/или последовательности аналогичного происхождения (например, происходящей от областей HR1 или HR2, таких как, но не ограничивающихся ими, SEQ ID NO:3, 6-60, 64 и 67-99). В дополнение к этому примеру можно отметить, что SEQ ID NO:107-113 кодируют такие же соответствующие пептиды, как и SEQ ID NO: 100-106. Однако SEQ ID NO: 100-106 представляют собой полинуклеотиды, содержащие кодон, предпочтительный для бактериальной экспрессии, тогда как SEQ ID NO:107-113 представляют собой полинуклеотиды, содержащие кодон, предпочтительный для экспрессии в экспрессионных системах млекопитающих.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к прокариотическому экспрессионному вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий конъюгат по изобретению, и к его применению для рекомбинантного продуцирования конъюгата. В одном из примеров полинуклеотид может быть расположен в прокариотическом экспрессионном векторе так, чтобы при продуцировании конъюгата в бактериальных клетках-хозяевах он продуцировался в виде гибридного белка с последовательностями, которые облегчают очистку конъюгата. Так, например, специалистам известны последовательности, которые экспрессируются как часть гибридного белка с нужным полипептидом и облегчают его продуцирование в тельцах включения, присутствующих в цитоплазме прокариотической клетки, используемой для экспрессии (см., например, Tokatlidis et al., 1993, Protein Eng. 6:947-952). Тельца включения могут быть выделены из других прокариотических клеточных компонентов методами, известными специалистам, например с использованием денатурирующих агентов и фракционированием (например, центрифугированием, колоночной хроматографией и т.п.). В другом примере представлены коммерчески доступные векторы, в которые вводят представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты, экспрессируемую в виде белка или пептида, так чтобы после экспрессии генный продукт также содержал множество концевых гистидиновых остатков (His-меток), которые могут быть использованы для очистки генного продукта стандартными методами.

Для специалиста очевидно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая конъюгат по изобретению, может быть встроена в плазмиду или в неплазмидные векторы, либо в другие экспрессирующие системы, которые могут быть также использованы, включая, но не ограничиваясь ими, бактерии, трансформированные бактериофаговым вектором, или космидную ДНК; дрожжи, содержащие дрожжевые векторы; грибки, содержащие векторы на основе грибков; клеточные линии насекомых, инфицированные вирусом (например, бакуловирусом); и клеточные линии, трансфицированные плазмидой или вирусными экспрессионными векторами, или инфицированные рекомбинантным вирусом (например, вирусом коровьей оспы, аденовирусом, адено-ассоциированным вирусом, ретровирусом и т.п.). Для успешной экспрессии конъюгата необходимо, чтобы рекомбинантная ДНК-молекула, включающая последовательность, кодирующую конъюгат, или сам вектор, содержали необходимые элементы регуляции транскрипции и трансляции, которые являются совместимыми с системой хозяина, конкретно используемой для экспрессии, и распознаются ими. С использованием методов, известных специалистам в области молекулярной биологии, включая методы, описанные выше, различные промоторы и энхансеры могут быть включены в вектор или в рекомбинантную ДНК-молекулу, содержащую кодирующую последовательность, в целях увеличения уровня экспрессии конъюгата, при условии, что такой повышенный уровень экспрессии конъюгата является совместимым (например, нетоксичным) с конкретно используемой системой клетки-хозяина. Как очевидно для специалиста, выбор промотора зависит от используемой экспрессионной системы. Промоторы могут варьировать по длине, то есть по способности стимулировать транскрипцию. Вообще говоря, для экспрессии клонированного гена желательно использовать сильный промотор в целях достижения высокой степени транскрипции гена и его экспрессии с образованием генного продукта. Так, например, известными бактериальными, фаговыми или плазмидными промоторами, которые обеспечивают высокий уровень транскрипции в системе клеток-хозяев E.coli, являются промотор lac, промотор trp, промотор recA, промотор рибосомной РНК, промоторы Р.sub.R и Р.sub.L, lacUV5, ompF, bla, lpp и т.п., которые могут быть использованы для осуществления транскрипции встроенной нуклеотидной последовательности, кодирующей синтетический пептид. Промоторами млекопитающих, обычно используемыми в экспрессирующих векторах для экспрессии в системах млекопитающих, являются промоторы, происходящие от генов вирусов млекопитающих. В качестве примеров могут служить ранний промотор SV40, промотор LTR мышиного вируса опухоли молочной железы, главный поздний промотор аденовируса, промотор вируса простого герпеса и промотор CMV.

В случае когда экспрессия конъюгата может приводить к гибели или повреждению клеток-хозяев то клеточный штамм/клеточная линия хозяина и экспрессирующие векторы могут быть выбраны так, чтобы действие промотора ингибировалось до тех пор, пока не потребуется его специфическое индуцирование. Так, например, для некоторых оперонов добавление специфических индукторов необходимо для эффективной транскрипции встроенной ДНК (например, оперон lac индуцируется добавлением лактозы или изопропилтио-бета-D-галактозида; оперон trp индуцируется в случае отсутствия триптофана в культуральной среде; а тетрациклин может быть использован в экспрессирующих векторах млекопитающих, имеющих tet-чувствительный промотор). Таким образом, экспрессия конъюгата может регулироваться путем культивирования трансформированных или трансфицированных клеток в условиях, при которых промотор, регулирующий экспрессию кодирующей последовательности, не индуцируется, а когда клетки достигают подходящей плотности в культуральной среде, то этот промотор может быть индуцирован для экспрессии кодирующей последовательности. Специалистам хорошо известны и другие регуляторные элементы, используемые для эффективной транскрипции гена или трансляции транскрипта, и такими элементами являются энхансеры, сигналы инициации транскрипции или трансляции, последовательности терминации транскрипции и последовательности полиаденилирования и т.п.

Приведенное выше подробное описание конкретных вариантов осуществления изобретения представлено лишь в иллюстративных целях. Исходя из настоящего описания и графического материала и имеющейся научной информации специалист может легко модифицировать и/или адаптировать настоящее изобретение для его применения в различных целях, не выходя, однако, за рамки основной концепции настоящего изобретения; а поэтому такие модификации и/или адаптации не должны выходить за рамки объема прилагаемой формулы изобретения.