способ получения посадочного материала красной водоросли гелидиум (gelidium) с ризоидами (варианты)

Формула изобретения

1. Способ получения посадочного материала красной водоросли гелидуим с ризоидами, включающий отбор верхушечных фрагментов слоевища водоросли и культивирование в питательной среде, отличающийся тем, что верхушечные фрагменты помещают в жидкую питательную среду, предварительно затенив их нижнюю часть, культивирование ведут в течение не менее 5 недель при постоянном перемешивании и аэрировании с еженедельной сменой питательной среды.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для культивирования берут верхушечные фрагменты длиной не более 1 мм.

3. Способ получения посадочного материала красной водоросли гелидуим с ризоидами, включающий отбор верхушечных фрагментов слоевища водоросли и культивирование в жидкой питательной среде, отличающийся тем, что перед культивированием в жидкой питательной среде верхушечные фрагменты подвергают глубокой заморозке в течение 10-30 мин, затем оттаивают при комнатной температуре и выдерживают в жидкой питательной среде 1-2 недели, после этого отбирают живые верхушки ветвей, а культивирование ведут в течение не менее 6 недель при периодическом освещении, постоянном перемешивании и аэрировании с еженедельной сменой питательной среды.

Описание изобретения к патенту

Изобретения относятся к биотехнологии и марикультуре, в частности к способам получения посадочного материала в виде проростков с ризоидами красной водоросли гелидиум, и могут быть использованы для его промышленного культивирования.

Получение проростков как посадочного материала красной водоросли гелидиум, широко используемой для получения агара, очень актуально в связи с ее плантационным культивированием в ряде стран Европы и Америки и отсутствием в мировой практике быстрых и экономичных способов получения проростков, несущих ризоиды, с помощью которых растения прикрепляются к субстрату.

Известно несколько способов получения посадочного материала для плантационного (растение прикрепляется к субстрату) способа культивирования гелидиума. Техника получения проростков с ризоидами из спор зрелых дикорастущих растений один раз в году описана в работе Rojas R.H., Leon N.M., Rojas R.O. Practical and descriptive techniques for Gelidium rex (Gelidiales, Rhodophyta) culture. Hydrobiologia 1996. Vol. 326/327. P. 367-370. Выход спор стимулировался искусственно, споры оседали на мертвые раковины моллюсков и прикреплялись к ним ризоидами. Посадочный материал представлял собой проростки гелидиума, прикрепленные к раковинам. При высадке материала на плантации раковины фиксировались к субстрату.

Однако данный способ не только технически сложен, но и имеет временные ограничения, поскольку водоросли спороносят только один раз в году.

Другим способом получения проростков гелидиума является использование фрагментов длиной 4 см из верхней части слоевища, закрепление их на твердом субстрате, богатом карбонатом магния и кальция, и выращивание на этих фрагментах ризоидов в увлажняющей культуре с распылением среды (Salinas J.M.Spray system for re-attachment of Gelidium sesquipidale (Clem.) Born. et Thuret (Gelidiales, Rhodophyta). Hydrobiologia 221: 107-117, 1991).

Способ не нашел широкого применения в плантационном культивировании гелидиума из-за дороговизны и сложности, поскольку требует не только закрепления фрагментов на твердом субстрате, но и постоянного орошения.

Задача изобретения - разработка способов быстрого и массового получения проростков гелидиума с ризоидами в любое время года за счет проведения процесса выращивания в постоянно перемешиваемой и аэрируемой культуре.

Поставленная задача решается тем, что в известный способ получения посадочного материала красной водоросли гелидуим с ризоидами, включающий отбор верхушечных фрагментов слоевища водоросли и культивирование в питательной среде, согласно изобретению вносят следующие изменения, верхушечные фрагменты помещают в жидкую питательную среду, предварительно затенив их нижнюю часть, а культивирование ведут по меньшей мере в течение 5-ти недель, постоянном перемешивании и аэрировании с еженедельной сменой питательной среды.

Получение проростков гелидиума с ризоидами в жидкой перемешиваемой культуре без прикрепления к субстрату значительно упрощает и ускоряет не только способ культивирования посадочного материала, но и, как следствие, значительно снижает трудоемкость всего цикла плантационного культивирования водоросли. Получение проростков с ризоидами в постоянно перемешиваемой и аэрируемой культуре авторами заявляемого изобретения предложено впервые.

Установлено, что именно затенение нижней части верхушечных фрагментов способствует росту ризоидов у водоросли.

Культивирование в течение не менее 5-ти недель позволяет получить проростки с ризоидами. Проведение процесса менее пяти недель не обеспечивает достижения роста проростков с ризоидами, достаточного для использования их в качестве посадочного материала для дальнейшего использования в плантационной культуре.

Ведение процесса культивирования при постоянном перемешивании и аэрировании способствует нормальному развитию и росту культуры, обеспечивая таким образом получение жизнеспособного готового конечного продукта, а именно проростков гелидиума с ризоидами.

Еженедельная смена питательной среды во время культивирования дает возможность получать бактеориологически относительно чистую культуру, а также поддерживает в жидкой среде оптимальную концентрацию ингредиентов, обеспечивающих оптимальные условия роста проростков с ризоидами.

Для культивирования берут верхушечные фрагменты длиной не более 1 мм.

Использование фрагментов длиной не более 1 мм обеспечивает в нем максимальное содержание количества меристематической ткани, что оказывает влияние на скорость роста проростков на начальной их стадии культивирования и, как следствие, позволяет получить проростки с ризоидами достаточных размеров и хорошего качества за меньшее время культивирования.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1

Верхние части растений (фиг.1а) очищались от эпифитов жесткой волосяной щеткой и промывались под струей стерилизованной морской воды. Затем от них отрезались верхушки ветвей длиной не более 1 см (в основном от 0,5 до 1 мм) (фиг.1б). Нижняя половина верхушечных фрагментов обворачивалась несколькими слоями черной пластиковой сетки, которая закреплялась на фрагменте силиконовой трубкой (фиг.1в). Фрагменты, завернутые в сетку, помещались в сосуды с жидкой питательной средой, где перемешивались и аэрировались пузырьками воздуха. Питательная среда заменялась на новую еженедельно. Растения выдерживались при температуре 14-15°С, освещенности около 120 мкмоль/м² × сек, фотопериоде 12:12 (свет: темнота), солености 27.7 и pH 8.1. Растения культивировались в течение 5 недель.

Пример 2

Выполняют аналогично Примеру 1, только растения культивируют в течение 6 недель.

Морфофизиологические характеристики проростков, выращенных из верхних ветвей растений в перемешиваемой и аэрируемой культуре, согласно примерам 1 и 2 по сравнению с контролем без затенения представлены в табл.1, а рост и развитие ризоидов наглядно демонстрируется фиг.1, где а) верхушечные части гелидиума; б) фрагменты гелидиума длиной до 1 мм, отрезанные для культивирования; в) затененные сеткой и закрепленные на носителе фрагменты гелидиума; г) образцы гелидуума через 6 недель культивирования, имеющие пролификации в базальной части фрагмента; д) образование ризоидов на базальных пролификациях, е) внешний вид ризоидов.

Как видно из табл.1 и фиг.1, за это время длина растений увеличилась в 2.5 раза, а их вес - в 3 раза. Средняя скорость роста составляла 1.5% в день (табл. 1). В верхней (свободной от сетки) части фрагментов на ветвях второго порядка появились пролификации в виде ветвей третьего порядка. В нижней (закрытой сеткой) части фрагментов пролификации были обнаружены только в области среза (фиг.1е). В верхней половине пролификации в 90% случаев появились ризоиды (фиг.1д, е, табл. 1). Таким образом, за 5-6 недель культивирования верхушечных частей гелидиума в перемешиваемой и культивируемой культуре с затенением базальной части фрагментов были получены проростки, имеющие ризоиды, которые могут быть использованы как посадочный материал для дальнейшего плантационного культивирования.

Заявляемый изобретением технический результат достигается также тем, что в известном способе получения посадочного материала красной водоросли гелидуим с ризоидами, включающем отбор верхушечных фрагментов слоевища водоросли и культивирование в жидкой питательной среде, согласно изобретению перед культивированием в жидкой питательной среде верхушечные фрагменты подвергают глубокой заморозке в течение 10-30 мин, затем оттаивают при комнатной температуре и выдерживают в жидкой питательной среде 1-2 недели с ежедневной ее заменой. Для культивирования отбирают у оттаивших водорослей верхушки ветвей, а культивирование ведут в течение не менее шести недель при постоянном перемешивании и аэрировании с еженедельной сменой питательной среды.

Глубокая заморозка значительно позволяет упростить отбор жизнеспособного материала для дальнейшего получения проростков с ризоидами. Кроме того, в этом жизнеспособном материале - верхушечных микрофрагментах, полученных после размораживания, живыми остаются только клетки меристематической ткани, что существенно повышает впоследствии скорость роста проростков, а мертвая паренхиматозная ткань затеняет часть проростков.

Заморозку ведут в течение 10-30 минут. Ведение заморозки менее 10 минут не обеспечивает глубокого промораживания исходного материала и в результате не позволяет получить качественный исходный материал для культивирования, а это в свою очередь приводит к увеличению длительности процесса получения посадочного материала с ризоидами необходимых размеров. Проведение процесса заморозки более 30 минут нецелесообразно, поскольку это никоим образом не сказывается на качестве получения исходного материала для культивирования.

Выдержка оттаивших водорослей в питательной среде в течение одной-двух недель позволяет не только подрасти оставшейся жизнеспособной меристатической ткани, но и способствует визуальному проявлению четких контуров между живой меристатической тканью и мертвой паренхиматозной тканью слоевищ, которая за это время обесцвечивается. Выдержка менее одной недели не обеспечивает достижение вышеуказанного эффекта и, как следствие, осложняет отделение меристематической ткани и замедляет способ получения жизнеспособного материала, а выдержка более двух недель не оказывает влияния на процесс разделения живой и мертвой ткани. Ежедневная смена питательной среды в процессе оттаивания позволяет получить бактериологически относительно чистую культуру.

Культивирование посадочного материала осуществляют путем выдержки в жидкой питательной среде в течение не менее 6-ти недель при постоянном перемешивании и аэрировании. Именно данное время выдержки позволяет получить проростки с ризоидами достаточных размеров, которые в дальнейшем могут использоваться как посадочный материал.

Проведение культивирования проростков гелидиума и получение на них ризоидов в интенсивно перемешиваемой культуре авторами предложено впервые. Постоянное аэрирование необходимо для поддержания жизнедеятельности и роста проростков.

Еженедельная смена жидкой питательной среды в процессе культивирования дает возможность избежать массового появления бактерий, а также поддерживает в жидкой питательной среде оптимальную концентрацию ингредиентов, обеспечивающих оптимальные условия роста проростков.

Пример 3

Верхнюю часть талломов гелидиума очищают от эпифитов, как описано в примере 1. Затем от верхних частей растений отрезают фрагменты длиной 2-3 см, имеющие наибольшее количество ветвей второго и третьего порядков (фиг.2а). Фрагменты промокают фильтровальной бумагой и заворачивают в алюминиевую фольгу. Пакет с водорослями помещают в цилиндр, сделанный из папье-маше, цилиндр закрывают с обеих сторон пробками и помещают в шкаф глубокого охлаждения (-80°С) на 10 мин. После глубокого охлаждения водоросли размораживают при комнатной температуре. Водоросли после оттаивания помещают в чашки с жидкой питательной средой на 1 неделю. Питательную среду в чашках меняют ежедневно. Замораживание водорослей приводит к гибели всех клеток слоевища, кроме меристематических. Через две недели выдерживания водорослей в питательной среде погибшие клетки обесцвечиваются, а клетки меристемы продолжают делиться, оставаясь яркоокрашенными, что дает возможность идентифицировать живую ткань в верхушечной части ветвей (фиг.2б). Затем отрезаются верхушки ветвей, содержащие живую и мертвую части (фиг.2в), помещают в сосуды с жидкой питательной средой и культивируют в перемешиваемой и аэрируемой культуре в течение 6 недель, как сказано в примере 1.

Пример 4

Верхнюю часть талломов гелидиума очищают от эпифитов, как описано в примере 1. Затем от верхних частей растений отрезают фрагменты длиной 2-3 см, имеющие наибольшее количество ветвей второго и третьего порядков (фиг.2а). Фрагменты промокают фильтровальной бумагой и заворачивают в алюминиевую фольгу. Пакет с водорослями помещают в цилиндр, сделанный из папье-маше, цилиндр закрывают с обеих сторон пробками и помещают в шкаф глубокого охлаждения (-80°С) на 30 мин. После глубокого охлаждения водоросли размораживают при комнатной температуре. Водоросли после оттаивания помещают в чашки с жидкой питательной средой на 2 недели. Питательную среду в чашках меняют ежедневно. Замораживание водорослей приводит к гибели всех клеток слоевища, кроме меристематических. Через две недели выдерживания водорослей в питательной среде погибшие клетки обесцвечиваются, а клетки меристемы продолжают делиться, оставаясь яркоокрашенными, что дает возможность идентифицировать живую ткань в верхушечной части ветвей (фиг.2б). Затем отрезаются верхушки ветвей, содержащие живую и мертвую части (фиг.2в), помещают в сосуды с жидкой питательной средой и культивируют в перемешиваемой и аэрируемой культуре в течение 8 недель, как сказано в примере 3.

Изменение биомассы и относительная скорость роста двух образцов замороженных-оттаянных верхушечных фрагментов ветвей слоевища гелидиума при культивировании в жидкой питательной среде, при перемешивании и аэрировании согласно примерам 3 и 4 представлены в таблице 2 (где первая цифра соответствует примеру 3, а вторая - примеру 4), а на фото 2 наглядно показано развитие проростков при культивировании, где на фиг.2а показан исходный материал, верхние части; 2б - точка роста слоевища после замораживания-оттаивания с живой меристематической и мертвой паренхиматозной тканями; 2в - верхушки ветвей слоевища гелидиума после зхамораживания-оттаивания и содержания в жидкой питательной среде в течение 2-х недель, являющегося исходным материалом для выращивания проростков с ризоидами; 2г - проросток гелидиума после 4-х недель культивирования, мертвая паренхиматозная ткань затеняет растущий проросток; 2д - проросток гелидиума с ризоидами после 8-ми недель культивирования; 2е - внешний вид ризоидов.

Как видно из представленных результатов, в течение первой недели культивирования рост фрагментов отсутствует. Наибольшая скорость роста фрагментов до 12% в сутки отмечена к четвертой неделе выращивания (табл. 2). В это время одна часть проростка покрыта (затеняется) мертвой тканью, другая находится вне нее (фиг.2г). В течение 8 недель культивирования биомасса образца растущих фрагментов увеличивается в 30-40 раз (табл. 2). В конце эксперимента проростки представляют собой молодые талломы длиной 3-5 мм, имеющие одну точку роста и один пучок ризоидов (фиг.2д, е). Эти молодые талломы могут быть использованы как посадочный материал в плантационной культуре.

Таким образом, заявляемые технические решения решают проблемы массового и быстрого получения проростков из красных водорослей с ризоидами для экстенсивного, плантационного и интенсивного культивирования красных водорослей в любое время года. Авторами впервые предложено получать проростки гелидиума с ризоидами без закрепления их на субстрат в интенсивно перемешиваемой жидкой культуре.

Таблица 1
Затенение ветвей	Средняя биомасса одной ветви, мг	Средняя длина одной ветви, см		Средняя скорость роста ветвей, % × день-1	Относительное количество ветвей с ризоидами
Пластиковой черной сеткой (примеры 1-2)	21.6±4.3	2.5×0.6		1.5×0.4	92%
Контроль: без затенения	23.3×3.6	2.6×0.7		1.7×0.4	0%
Таблица 2
Продолжительность культивирования	Номер примера		Биомасса образца, г		Относительная скорость роста, % в сутки
1-я неделя	3		100		-
	4		90		-
2-я неделя	3		150		5.8
	4		160		8.2
3-я неделя	3		362		11.0
	4		410		11.7
4-я неделя	3		1014		12.8
	4		380		10.8
5-я неделя	3		1617		6.7
	4		1430		5.4
6-я неделя	3		2292		4.9
	4		1840		3.6
7-я неделя	-		-		-
	4		2660		6.1
8-я неделя	-		-		-
	4		3111		2.23