синтетическая среда для замораживания спермы быков

Формула изобретения

Синтетическая среда для замораживания спермы быков, включающая трис-(гидроксиметил)-аминометан, фруктозу, лимонную кислоту, глицерин и воду, отличающаяся тем, что среда дополнительно содержит сухой соевый лецитин Центролекс Ф при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

Трис-(гидроксиметил)-аминометан	2,65-2,85
Фруктоза	0,70-0,80
Лимонная кислота	1,3-1,5
Глицерин	5-7
Сухой соевый лецитин Центролекс Ф	8-12
Вода дистиллированная	остальное.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способам обработки и замораживания семени быков.

Известно, что в процессе замораживания спермы быков погибает 50-60% сперматозоидов и после оттаивания живучесть сперматозоидов в половых путях коров значительно снижается по сравнению с нативными половыми клетками, что отрицательно сказывается на оплодотворяемости коров при использовании криоконсервированной спермы.

В этой связи необходима разработка более совершенных синтетических разбавителей для спермы быков, способствующих повышению устойчивости сперматозоидов к замораживанию и не содержащих в своем составе веществ животного происхождения с целью профилактики заболеваний, которые могут распространяться при искусственном осеменении коров.

Известна синтетическая среда для разбавления и замораживания спермы быков, содержащая лактозу, глицерин, желток куриного яйца и дистиллированную воду (1).

Также известна среда для криоконсервации спермы быков, содержащая лактозу, восстановленный глутатион, трис-(гидроксиметил)-аминометан, серицин, глутаминовую кислоту, желток куриных яиц, спермосан-3 и дистиллированную воду (2).

Недостатком данных сред является то, что при их применении для замораживания спермы быков наблюдается довольно высокая гибель сперматозоидов и живучесть оттаянных сперматозоидов в половых путях коров резко снижается в связи с недостаточным содержанием в среде буферных соединений. Кроме того, наличие в данных средах веществ животного происхождения (лактоза, желток куриных яиц) может способствовать переносу различных заболеваний коровам при их искусственном осеменении, в том числе и птичьего гриппа, в результате возможного содержания различных возбудителей как в желтке, так и в скорлупе куриных яиц. Помимо этого, присутствие в составе этих сред желтка куриных яиц не позволяет выявлять наличие различных патогенных бактерий и вирусов в криоконсервированной сперме быков с помощью полимеразной цепной реакции, так как ферменты, содержащиеся в яичном желтке, ингибируют протекание данной реакции. Это приводит к тому, что большое количество патогенных организмов не выявляется в сперме, используемой для искусственного осеменения коров в нашей стране, и таким способом передаются различные заболевания крупного рогатого скота.

Наиболее близкой по составу к нашему изобретению является среда для замораживания спермы быков (3), которая содержит следующие компоненты (мас.%): трис-(гидроксиметил)-аминометан - 2,4; фруктоза - 1,0; лимонная кислота - 1,354; глицерин - 8,8; желток куриного яйца - 20; вода дистиллированная - остальное.

Недостаток этой среды состоит в том, что она содержит вещество животного происхождения (желток куриного яйца), что может способствовать переносу заболеваний при искусственном осеменении коров. Кроме того, другие компоненты этой среды не сбалансированы в оптимальном соотношении, что снижает живучесть заморожено-оттаянных сперматозоидов в половых путях самок и их оплодотворяющую способность.

Целью изобретения является повышение биологической полноценности синтетической среды для замораживания спермы быков путем исключения из ее состава вещества животного происхождения (желтка куриного яйца) и более оптимального баланса всех компонентов синтетической среды.

Поставленная цель достигается тем, что среда, включающая трис-(гидроксиметил)-аминометан, фруктозу, лимонную кислоту, глицерин и дистиллированную воду, дополнительно содержит в качестве криопротектора вместо желтка куриного яйца сухой соевый лецитин (Центролекс Ф) при следующем соотношении ингредиентов, (мас.%):

Трис-(гидроксиметил)-аминометан	- 2,65-2,85
Фруктоза	- 0.70-0,80
Лимонная кислота	-1,3-1,5
Глицерин	- 5-7
Сухой соевый лецитин (Центролекс Ф)	- 8-12
Вода дистиллированная	- остальное

Сухой соевый лецитин (Центролекс Ф) получают из экстракта фосфолипидов соевых бобов путем лиофильной сушки. Он имеет постоянный биохимический состав и содержит 98% фосфолипидов, обладающих криопротекторным действием на сперматозоиды быков при замораживании, аналогично действию фосфолипидов желтка куриного яйца. Это позволяет заменить в составе замораживающей среды для спермы быков желток куриного яйца на сухой соевый лецитин данной марки.

Допустимые граничные значения концентраций компонентов в заявленной среде приведены в таблице 1.

Таблица 1
Компоненты среды и качественные показатели оттаянной спермы быков	Состав сред (мас.%)
	1-й	2-й	3-й
Трис-(гидроксиметил)-аминометанан	2,65	2,75	2,85
Фруктоза	0,70	0,80	0,90
Лимонная кислота	1,30	1,40	1,50
Глицерин	5,0	6,0	7,0
Сухой соевый лецитин (Центролекс Ф)	8,0	9,0	10,0
Вода дистиллированная	до 100	до 100	до 100
Показатели замороженно-оттаянной спермы:
Подвижность сперматозоидов,%	40,0	45,0	38,0
Абсолютный показатель живучести сперматозоидов при 37°С, усл.ед.	16,3	17,4	16,0

Если содержание компонентов выходит за границу крайних нижних или верхних значений предполагаемой среды, то это дает худшие результаты и не приводит к достижению поставленной цели (см. табл.2).

Таблица 2
Компоненты сред и показатели качества оттаянной спермы	Качественные показатели спермы при следующем содержании компонентов, мас.%
Трис-(гидроксиметил)-аминометан	2,6	2,9
Фруктоза	0,65	1,55
Лимонная кислота	1,20	1,60
Глицерин	4,0	8,0
Сухой соевый лецитин	6,0	12,0
Вода дистиллированная	до 100	до 100
Показатели:
Подвижность сперматозоидов после оттаивания, %	36,0	32,0
Абсолютный показатель живучести
сперматозоидов при 37°С, усл.ед.	15,4	15,0

Пример приготовления среды. В чистую химическую колбу вносят по рецепту трис-(гидроксиметил)-аминометан, фруктозу, лимонную кислоту и заливают прокипяченной дистиллированной водой с температурой 80-90°С. Тщательно растворяют все компоненты. Затем раствор охлаждают до 40°С и вносят туда глицерин и сухой соевый лецитин. Свежеприготовленная среда перед разбавлением спермы должна исследоваться по внешнему виду, цвету и периодически по показателю рН и осмотическому давлению. Предлагаемая синтетическая среда по физико-химическим свойствам должна отвечать следующим требованиям: внешний вид - однородная эмульсия без осадка; цвет - светло-желтый; без запаха; рН - 6,8-7,0; осмотическое давление - 7,0-8,5.

Приготовленную среду используют для разбавления спермы в течение 4-5 часов.

После разбавления сперму быков эквилибрируют при 4°С в течение 2-3 часов и затем замораживают в виде гранул объемом 0,2 мл на пластине сухого льда или в пайетах объемом 0,25-0,5 мл в парах жидкого азота.

Оптимальный (второй) состав предлагаемой среды (мас.%): трис-(гидроксиметил)-аминометан - 2,75; фруктоза - 0,80; лимонная кислота - 1,40; глицерин-6,0; сухой соевый лецитин - 9,0; вода дистиллированная - до 100, имеет более высокие защитные свойства в сравнении с другими вариантами и прототипом и повышает биологическую полноценность спермы в процессе замораживания-оттаивания. Подвижность сперматозоидов, замороженных в данной среде, после оттаивания составляла 45% против 40% в контроле (прототип), а абсолютный показатель их живучести при 37°С составлял соответственно 17,4 и 16.5 усл.ед.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1

Указанный оптимальный состав среды испытан комиссионно в производственных условиях на оплодотворяющую способность криоконсервированной спермы быков. Эксперименты проведены в хозяйствах Московской области. Результаты испытаний представлены в таблице 3.

Таблица 3
Синтетическая среда	Осеменено коров	Оплодотворилось от первичного осеменения
		Коров	в %
Предлагаемая (оптимальный вариант)	123	63	51,2
Контроль (прототип)	106	50	47.2

Испытания показали, что предложенная среда обладает более высокими защитными свойствами на сперматозоиды быков при замораживании: оплодотворяемость коров при использовании спермы, замороженной с сухим соевым лецитином, повысилась на 4,0% по сравнению с контролем.

ПРИМЕР 2

Было изучено выяснение возможности определения присутствия вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и лептоспир в криоконсервированной сперме быков с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого свежеполученные эякуляты от трех быков смешивали и разделяли на две части. Первая часть спермы разбавлялась и замораживалась в усовершенствованной среде с добавлением 10% желтка куриных яиц. Вторая часть спермы разбавлялась и замораживалась в этой же среде, но с добавлением вместо желтка куриных яиц 10% сухого соевого лецитина. В одной дозе содержалось 20 млн подвижных сперматозоидов. После оттаивания спермы в нее вносили определенную концентрацию вируса ИРТ и определяли его присутствие в оттаянной сперме всех групп быков с помощью ПЦР реакции.

Кроме того, нами изучалось присутствие лептоспир в криоконсервированой сперме данным методом. Для этого к 1 мл оттаянной спермы добавляли 1000, 100 или 10 лептоспир.

Результаты выделения вируса ИРТ в оттаянной сперме показали, что в случае использования в составе среды сухого соевого лецитина антигены данного вируса выявлялись отчетливо. В случае замораживания спермы с желтком куриного яйца присутствие антигенов ИРТ не обнаруживалось.

Анализ эксперимента по выделению антигенов лептоспир в криоконсервированной сперме быков показал, что использование в разбавителе сухого соевого лецитина позволило обнаружить антигены лептоспир даже в низкой концентрации (100 и 10 лептоспир/ мл). При замораживании спермы в среде с желтком куриного яйца чувствительность данного метода была низкой и позволяла выявить присутствие этих антигенов только в случае содержания 1000 лептоспир/мл.

Преимуществами заявленной среды над прототипом является повышение выживаемости сперматозоидов после замораживания и их оплодотворяющей способности, снижение вероятности заражения коров различными инфекционными заболеваниями при искусственном осеменении криоконсервированной спермой, а также повышение чувствительности метода ПЦР диагностики для выявления присутствия патогенных вирусов и микроорганизмов в криоконсервированной сперме быков.

Источники информации

1. Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. - М.: Колос, 1984, 159 С.

2. А.С. СССР №1189448 А. Бюл. №41, 1985.

3. Steinbach J, Foote R.J. Dairy Scince, 1964, v.47, p.812-815.