синтетическая среда для разбавления и криоконсервации спермы баранов

Формула изобретения

Синтетическая среда для разбавления и криоконсервации спермы баранов, включающая лактозу, декстрин, ксилит, трис-(оксиметил)-аминометан, динатриевую двуводную соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, глицерин, желток куриного яйца и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит натрий янтарно-кислый 6-ти водный при следующем оптимальном соотношении ингредиентов, мас.%:

Лактоза	6,00
Декстрин	3,60
Ксилит	0,18
Трис-(оксиметил)-аминометан	0,08
Динатриевая двуводная соль ЭДТА	0,10
Глицерин	4,3
Желток куриного яйца	14,3
Натрий янтарно-кислый 6-ти водный	0,03
Вода дистиллированная	остальное.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к животноводству. Может быть использовано при искусственном осеменении овец криоконсервированной спермой баранов для повышения суягности и многоплодия.

При искусственном осеменении овцематок используют свежевзятую, охлажденную (до +2-0°С) и криоконсервированную (до -196°С) сперму баранов. В последних двух случаях в процессе технологической обработки ее разбавляют в 3-4 раза защитными синтетическими средами.

В нативной сперме баранов имеется достаточно природных антиоксидантов, предохраняющих живые клетки от перекисного окисления липидов (ПОЛ). Это фосфолипиды, токоферолы, убихинон, цистин, коэнзим Q, и другие, а так же специфические ферменты защиты, например глутатионпероксидазная система.

Учитывая подверженность спермы баранов при хранении процессу ПОЛ, отрицательно действующего на сохранность биологической полноценности сперматозоидов, зарубежные и отечественные ученые предлагают обогащать среды для разбавления различными антиоксидантами.

Однако в процессе дальнейшей технологической обработки (разбавление, эквилибрация, замораживание, дефростация) концентрация химических веществ плазмы спермы существенно уменьшается.

Известны среды для разбавления и криоконсервации спермы баранов, включающие в свой состав дисахара (сахароза, лактоза), полисахариды (декстрин), желток куриного яйца, или яичный порошок, стабилизаторы буферной емкости (трис-(оксилометил)-аминометан)трилон-Б, экстрацелюлярные криопротекторы (гуммиарабик, глицерин, унитиол, глютатион, антиоксиданты (2,6-трет-бутил толуол; бутилокситолуол, таурин, глиотаурин) (1).

Однако эти среды не обладают достаточным криозащитным действием из-за отсутствия в их составе специализированных ингредиентов, способных эффективно структурировать воду вокруг сперматозоидов, эффективно стабилизировать структуру мембран спермиев.

Происходит нарушение упорядоченности структуры мембран спермиев, что способно инициировать ПОЛ. В результате этого развиваются деструктивные изменения в мембранных структурах сперматозоидов. В свою очередь это приводит к нарушению ионной проницаемости и снижению текучести мембран, инактивации ферментов, накоплению продуктов метаболизма, оказывая этим отрицательное воздействие на сохранность биологической полноценности сперматозоидов.

Очевидно, что эти процессы являются основными причинами низкой результативности искусственного осеменения овец криоконсервированной спермой.

Наиболее близкой по технической сущности к предлагаемой среде является ГЖУК-трис-буферная среда для разбавления и замораживания спермы баранов: лактоза - 8,4 г; декстрин кукурузный - 5 г; ксилит - 0,26 г; трис-(оксиметил)-аминометан - 0,105 г; динатриевая двуводная соль ЭДТА (трилон-Б) - 0,135 г; глицерин - 6,0 см; желток куриного яйца - 20 см; ИХФГАН-3 - 8 мг; вода дистиллированная - 100 мл (2).

Антиоксидант ИХФГАН-3, оказывающий положительный эффект на живучесть и оплодотворяющую способность криоконсервированной спермы баранов, является жирорастворимым антиоксидантом фенольного ряда, химическая формула: бромид-N,N-диметил-N-децил-4окси-3,5-дитрет-бутил-бензил амин, синтезированный в институте химической физики РАН. ИХФГАН-3 вводят в ГЖУК-трис-буферную среду в дозе - 0,08 мг/мл, для предотвращения активации ПОЛ в мембранных структурах сперматозоидов при криоконсервации спермы.

Однако этот препарат не может способствовать полной реализации воспроизводительной способности сперматозоидов после дефростации. Являясь антиоксидантом, ИХФГАН-3 в составе среды проявляет себя лишь как ингибитор ПОЛ. Он в своем составе не содержит специализированных инградиентов, которые в условиях гипоксии способствовали бы энергообеспечению живых сперматозоидов.

Целью изобретения является совершенствование синтетической среды для повышения сохранности, биологической полноценности сперматозоидов барана вне организма после разбавления спермы, ее криоконсервации и дефростации, обеспечивающей повышение процента суягности и многоплодия овцематок при искусственном осеменении.

Цель достигается за счет включения в состав среды биологически активного препарата (БАВ) пролонгированного действия, оказывающего двойное (сочетанное) положительное воздействие на живые сперматозоиды при криоконсервации и дефростации спермы. В составе среды используемый препарат проявляет себя во первых - как антиоксидант, ингибитор перекисного окисления липидов, а во-вторых - в условиях гипоксии окисляясь, он становится основным субстратом энергообеспечения спермиев, что способствует сохранению структуры повреждаемых клеток при криоконсервации.

Сущность изобретения заключается в использовании натрия янтарнокислого 6-водного.

Натрий янтарнокислый 6-водный - сыпучий порошок белого цвета, хорошо растворим в воде имеет следующую химическую формулу: NaOOCCH ₂СН₂COONa6Н₂ О с молекулярной массой 162. При включении в состав среды в нетоксичных концентрациях существенно не изменяет осмотическое давление и рН среды. В составе среды натрий янтарнокислый 6-водный диссоциирует на ионы натрия и янтарную кислоту - химическая формула: НООССН ₂СН₂СООН (синоним - этан-1,2-дикарбоновая кислота).

Перечисленные метаболические эффекты янтарной кислоты свидетельствуют об адекватности выбора этого субстрата для поддержания в сконструированной нами среде энергообеспечения спермиев и сохранения их структуры.

Ранее этот препарат в составе синтетических сред не применялся.

Преимущество настоящего изобретения в сравнении с прототипом состоит в том, что предлагаемая среда имеет более высокие криозащитные свойства в сравнении с прототипом и контролем, повышает биологическую полноценность спермы при криоконсервации и дефростации. В опытной группе подвижность сперматозоидов при оттаивании после криоконсервации (-196°С) составляет 4,5±0,20 балла, а абсолютный показатель живучести при 0°С составляет 368±13,0 условных единиц, против 4,25±0,18 балла и 340±12,4 условных единиц у прототипа соответственно.

Подвижность спермиев в контрольной группе (среда без натрия янтарнокислого 6-водного) составила 4,1±0,15 балла, абсолютный показатель живучести - 305±10,5 условных единиц.

Синтетическая среда с натрием янтарнокислым 6-водным более эффективно сохраняет биологическую полноценность и оплодотворяющую способность криоконсервированной спермой баранов и стимулирует воспроизводительную функцию овцематок - оплодотворяемость и многоплодие.

Более высокие криозащитные свойства в сравнении с прототипом предлагаемая среда оказывает вследствие того, что новый протектор включает в себя не только ионы натрия, способствующие повышению подвижности сперматозоидов, но и янтарную кислоту, которая, являясь природным антиоксидантом ингибирует перекисное окисление липидов и, окисляясь в условиях гипоксии, становится источником энергообеспечения спермиев.

Эти свойства хорошо объясняют его роль в предотвращении роста метаболических нарушений, инициирующих перекисное окисление липидов и необратимого повреждения мембран сперматозоидов при криоконсервации.

Таким образом, защитное действие натрия янтанокислого 6-водного более направленное, чем у антиоксиданта ИХФГАН-3 вследствие того, что он обладает более широким спектром физиологического воздействия на сперматозоиды - ионы натрия способствуют повышению подвижности сперматозоидов, а янтарная кислота ингибирует перекисное окисление липидов и в условиях гипоксии становится источником энергообеспечения сперматозоидов.

В итоге, предлагаемая среда позволяет более эффективно повысить биологическую полноценность спермиев после криоконсервации и дефростации, так как обладает лучшими криозащитными свойствами.

Способ осуществляется следующим образом. Для криоконсервации спермы использовали ГЖУК-трис-буферную среду в которую дополнительно, вместо ИХФГАН-3, включили препарат натрия янтарнокислого 6-водного в концентрации 0,40 мг/мл.

Пример приготовления среды

В стерильную химическую колбу вносят по рецепту (в мас.%): лактозу - 6,00; декстрин - 3,60; ксилит - 0,18; трис-(оксиметил)-амино-метан - 0,08; динатриевую двуводную соль ЭДТА (трилон-Б) - 0,10; глицерин - 4,30; желток куриного яйца - 14,30; натрий янтарнокислый, 6-водный - 0,03; воду дистиллированную остальное. Все вышеуказанные ингредиенты в сумме составляют 100 мас.%.

Свежеприготовленная синтетическая среда перед разбавлением спермы должна исследоваться по внешнему виду, цвету, периодически - по показателю рН и осмотическому давлению.

Предлагаемая среда по физико-химическим свойствам должна отвечать следующим требованиям: внешний вид - однородная эмульсия, без осадка и механических примесей: Цвет - желто-серый без запаха; рН при температуре 20°С - 6,8±0,15; осмотическое давление среды без глицерина при температуре 0°С - 10,0±0,5 атм.

Приготовленную среду используют для разбавления спермы в течение 4-х часов с момента приготовления. Хранят при температуре 0°-4°С, перед употреблением нагревают до +28 - +30°С.

При использовании среды к одному объему спермы добавляют 2-3 объема среды, в зависимости от концентрации сперматозоидов в эякуляте.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами

Пример №1. Сперму для исследований получали от баранов сальской породы с помощью искусственной вагины. После взятия каждого эякулята определяли его объем и ряд качественных показателей (активность спермиев в баллах, концентрацию в млрд/мл, общее количество сперматозоидов в эякуляте в млрд). В опытах использовали эякуляты, отвечавшие требованиям «Наставления по применению ГЖУК-трис-буферной среды для разбавления, замораживания, хранения и использования спермы баранов» (3), разбавление спермы проводили также согласно данному наставлению в 3-4 раза. Для изучения воздействия натрия янтарнокислого 6-водного в составе среды на сохранение биологической полноценности сперматозоидов барана вне организма после ее криоконсервации были использованы следующие концентрации препарата: 0,20, 0,40, 0,80 и 1,20 мг на 1 мл. В контрольной группе нативную сперму барана разбавляли ГЖУК-трис-буферной средой без препарата.

Разбавленную сперму расфасовывали в пронумерованные флаконы и вместе с контрольным образцом подвергали эквилибрации (охлаждению) в течение 2-х часов при температуре +2-4°С. Далее сперму замораживали на фторопластовой пластине в парах жидкого азота, в лунках по 0,2 мл, по методике ВНИИплем, согласно наставлению. Для биологического контроля подопытные образцы замороженной спермы дефростировали в 3%-ном растворе цитрата натрия при 42°С, затем определяли подвижность сперматозоидов через каждый час до полной их гибели. Абсолютный показатель живучести (Sa) сперматозоидов определяли при температуре инкубации +2+4°С. Опыты были проведены в шести повторностях.

Оптимальную концентрацию натрия янтрнокислого 6-водного в разбавленной сперме определяли после ее дефростации по показателю подвижности и живучести спермы в опытных и контрольных образцах (табл.1).

Таблица 1.
Влияние натрия янтарнокислого 6-водного в ГЖУК-трис-буферной среде на биологические показатели сперматозоидов барана после криоконсервации
Концентрация Препарата (мг/мл)	Показатели
	Подвижность		Живучесть	Конц. водор. ионов
	Балл	%	Sa (усл. единицы)	%	рН	%
Опыт: натрий янтарнокислый 6-водный
0,25	4,2±0,14	105	315±15,9	112,5	6,80	99,3
0,40	4,5±0,10 х	113	340±18,7 х	121,5	6,78	99,0
0,80	3,8±0,12	95	256±20,1	91,4	6,65	97,0
1,20	3,6±0,10	90	230±20,5	82,1	6,50	95,0
Контроль (без препарата)	4,0±0,25	100	280±20,0	100	6,85	100
х - статистически достоверная величина (р<0,01)

Данные таблицы 1 свидетельствуют, что включение натрия янтарнокислого 6-водного в состав среды существенно влияет на биологические показатели (подвижность и живучесть) сперматозоидов барана. Оптимальной концентрацией натрия янтарнокислого в среде следует считать 0,40 мг/мл. В этом случае подвижность сперматозоидов превосходит показатель контрольной группы на 12,5%, а абсолютный показатель живучести - на 21,5%. (р<0,01).

Криозащитные свойства рекомендуемой нами среды с натрием янтарнокислым 6-водным и прототипа среды с препаратом ИХФГАН-3 по сравнению с контролем (ГЖУК-трис-буферная среда без препаратов ИХФГАН-3 и натрия янтарнокислого 6-водного) иллюстрирует таблица 2.

Таблица 2.
Влияние натрия янтарнокислого 6-водного и ИХФГАН-3 в составе ГЖУК-трис-буферной среды на повышение биологической полноценности криоконсервированной спермы баранов
Концентрация препаратов (мг/мл)	Показатели
	Подвижность		Живучесть		Конц. водор. ионов
	балл	%	Sa (усл. единицы)	%	рн	%
Натрий янтарнокислый 6-водный
0,40	4,5±0,20х	109,7	368±13,0х	120	6,75±0,1	99,3
ИХФГАН-3 (прототип)
0,08	4,25±0,18	103,6	340±12,4х	111	6,78±0,1	99,7
Контроль (без препаратов)	4,10±0,15	100	305±10,5	100	6,80±0,1	100
х - статистически достоверная величина (р<0,05)

Приведенные данные (табл.2) показывают, что синтетическая среда с натрием янтарнокислым 6-водным повышает биологическую полноценность криоконсервированной спермы баранов на статистически достоверную величину по сравнению с прототипом (антиоксидантом ИХФГАН-3) и контролем (среда без сукцината натрия и ИХФГАНА-3).

Так, если в контрольной группе подвижность сперматозоидов была равна 4,1 балла, а с использованием ИХФГАН-3 возрасла до 4,25 баллов, то в среде с натрием янтарнокислым 6-водным подвижность спермиев увеличилась до 4,50 баллов, что выше контроля и прототипа на 9,7% и 3,6% соответственно.

Более существенные различия были установлены при изучении живучести сперматозоидов. При использовании препарата ИХФГАН-3 абсолютный показатель живучести увеличился в сравнении с контролем на 11%, а в среде с натрием янтарнокислым 6-водным, этот показатель увеличился на 20%. Полученная разница в показателях живучести опытной и контрольной групп (20% и 11%) статистически достоверна в обоих случаях при р<0,05.

Таким образом, проведенные исследования показали, что натрий янтарнокислый 6-водный в ГЖУК-трис-буферной среде проявляет комплексное воздействие на сперматозоиды барана, (как ингибитор ПОЛ и как субстрат энергообеспечения клеток). Лучше, чем прототип ИХФГАН-3, оказывает влияние на сохранение биологической полноценности спермиев барана вне организма после ее криоконсервации и дефростации, увеличивая подвижность на 9,7%, а абсолютный показатель живучести на 20%.

Пример №2. Влияние натрия янтарнокислого 6-водного на процент суягности и многоплодия овцематок изучали комиссионно в научно-производственном опыте в концентрации 0,40 мг/мл. Данная концентрация препарата в составе ГЖУК-трис-буферной среды была выбрана в связи с тем, что она повышает на статистически достоверную величину качественные показатели дефростированной спермы баранов.

Результаты этих исследований представлены в таблице 3.

Полученные данные (табл.3) показывают, что оплодотворяемость овцематок в опытной группе, где использовали оптимальную дозу натрия янтарнокислого 6-водного (0,40 мг/мл), была выше, чем в контрольной группе на 11,2%, а многоплодие - на 12 голов - 142 ягненка на 100 овцематок, против 130 голов в контрольной группе (р<0,05).

Таблица 3. Влияние натрия янтарнокислого 6-водного и ИХФГАН-3 в ГЖУК-трис-буферной среде на результаты искусственного осеменения овцематок криоконсервированной спермой баранов.
Доза препарата, мг/мл.	Подвижность, балл	Живучесть (усл.ед)	Осеменено овец (голов)	Объягнилось
				гол.	%	Кол-во ягнят на 100 маток, гол.
Натрий янтарнокислый 6-водный, (0,40)	4,5±0,10 х	370±15,3х	192	109	59,8±3,2х	142
ИХФГАН-3 (0,08)	4,2±0,12	355±18,4	190	95	53,5±3,6	135
Контроль (без препарата)	4,0±0,15	310±20,1	183	90	48,6±3,2	130
х - статистически достоверная величина (p<0.05)

Таким образом, введение в ГЖУК-трис-буферную среду натрия янтарнокислого 6-водного в концентрации 0,40 мг/мл позволяет значительно улучшить биологическую полноценность спермиев после дефростации (подвижность на 9,7%; абсолютный показатель живучести на 20%), а также повысить оплодотворяемость овцематок на 11,2%, их многоплодие - на 12 голов (на каждые 100 маток) по сравнению с контролем (среда без антиоксидантов). Эффективность использования среды с натрием янтарнокислым 6-водным (в концентрации 0,40 мг/мл) была выше соответственно на 6,3% и 7 голов на каждые 100 маток по сравнению с прототипом (среда с ИХФГАН-3 в концентрации 0,08 мг/мл).