способ определения специфических антител к вирусу энтерита гусей

Формула изобретения

Способ определения специфических антител к вирусу энтерита гусей, включающий получение антигена и очистку вируса гельхроматографией на макропористом стекле, его адсорбцию на поверхности полистироловых планшет, проведение ИФА, заключающегося во внесении контрольных и исследуемых сывороток крови и детекции комплекса антиген-антитело с помощью антивидового иммунопероксидазного конъюгата в присутствии субстратно-индикаторной смеси, отличающийся тем, что в качестве антигена используют вирус, полученный в результате введения в организм эпизоотического штамма вируса энтерита "П-75", при очистке вируссодержащего материала используют макропористое стекло с диаметром пор не менее 700 А, в качестве антивидового иммунопероксидазного конъюгата используют специфичный к Ig G гусей, а результаты ИФА учитывают по формуле: титр=antilg[2,02(lgS/P)+3,51], где S - значение оптической плотности исследуемой сыворотки; Р - значение оптической плотности положительного контроля.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способам для определения специфических антител к вирусу энтерита (парвовирусу) гусей.

Вирусный энтерит гусей (парвовирусная инфекция, болезнь Держи) - Enteritis virosa anserculorum - контагиозное парвовирусное заболевание молодняка птицы, характеризующееся преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта, печени, сердца, поджелудочной железы и других паренхиматозных органов и вызывающее его высокую смертность (от 30 до 100%). Возбудителем болезни является парвовирус гусей. Болезнь широко распространена в европейских странах (ФРГ, Франция, Англия, Венгрия, Чехия, Словакия, Нидерланды) и на других континентах. Серологические и вирусологические исследования установили распространение парвовирусной инфекции у гусей в большинстве исследованных хозяйств различных зон Российской Федерации. При этом экономический ущерб достигает от 25 до 100 тыс. руб. на 1000 голов птиц (1). Поэтому исключительно важное значение приобретает диагностика данной болезни, основанная на эпизоотологических, клинических и патолого-анатомических данных, результатах лабораторных исследований (выделение вируса и его идентификация в реакции нейтрализации, биопроба), а также обнаружение специфических антител в сыворотке крови птиц методом иммуноферментного анализа.

В настоящее время для определения антител к вирусу энтерита используют, как правило, реакцию преципитации в агаровом геле. Однако этот способ не позволяет проводить количественного анализа (2).

Известен способ диагностики вирусного энтерита путем исследования проб сывороток крови гусей с помощью реакции нейтрализации, заключающийся в том, что к двукратным разведениям сыворотки добавляют равный объем вируссодержащей суспензии, содержащей 100 или 1000 ТЦД₅₀ антигена. Смеси инкубируют при комнатной температуре 1 час и заражают культуру клеток. Титр вируснейтрализующих антител выражают в log₂ (3).

Недостатком данного способа является его длительность - (5-6 суток), что недопустимо в разгар эпизоотии, а также способ дорогостоящий, трудоемкий и связан с сезонностью яйцекладки гусынь.

Известен способ определения антител к экзотоксину коклюшных бактерий путем иммуноферментного анализа, включающий в себя адсорбцию экзотоксина на поверхности полистирола, внесение исследуемых антител, конъюгата антивидовых антител с ферментом субстрата, причем перед адсорбцией токсина поверхность полистирола обрабатывают частично денатурированным церулоплазмином человека (4).

Однако указанный способ не позволяет проводить диагностику вирусного энтерита гусей.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является известный способ определения антител к антигену реовирусного теносиновита кур (5).

Согласно способу вируссодержащий материал получают с использованием штамма "ВНИВИП - ДЕП", очистку полученного биосырья осуществляют путем вирусной гельхроматографии на макропористом стекле с диаметром пор, соответствующим диаметру очищаемого вируса, разведение очищенного антигена теносиновита кур проводят фосфатно-буферным раствором до концентрации 5,0-10,0 мкг/0,1 см³, адсорбцию разведенного антигена проводят на поверхности полистироловых планшет, затем на планшеты наносят исследуемые сыворотки крови кур, детекцию комплекса антиген-антитело осуществляют с использованием антивидового иммунопероксидазного конъюгата против IgG кур и учитывают результаты реакции ИФА.

Учет результатов реакции ИФА исследуемых сывороток крови проводят как визуально путем сравнения цветового окрашивания содержимого лунок исследуемой сыворотки с интенсивностью окраски продукта пероксидазной реакции титруемого контроля, так и используя математическую формулу.

Однако данный способ также не позволяет проводить диагностику энтерита гусей.

Задачей, решаемой в рамках данного изобретения, является создание способа определения антител к вирусу энтерита гусей, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью, а также позволяющего сократить время исследования и снизить экономические затраты.

Указанная задача была решена в результате создания способа определения специфических антител к вирусу энтерита гусей (парвовирусу) путем проведения ИФА, включающего получение антигена в результате введения в организм эпизоотического штамма "П-75" вируса энтерита гусей и очистки вируссодержащего материала методом молекулярно-ситовой хроматографии на макропористом стекле, модифицированном поливинилпирролидоном (ПВП) с диаметром пор не менее 700 Å, а в качестве антивидового иммунопероксидазного конъюгата используют конъюгат, специфичный к IgG гусей, а результаты ИФА учитывают по формуле: титр=antilg (2.02(Ig S/P)+3.51), где

S - значение оптической плотности исследуемой сыворотки;

Р - значение оптической плотности положительного контроля.

Заявляемые свойства способа обусловлены прежде всего использованием штамма "П-75", инфекционный титр которого составляет 4.0-4.5 lg ЭЛД₅₀ в 0,3 см³ . Штамм вируса депонирован в коллекции Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов под номером "П-75".

Установлено, что оптимальной дозой антигена вируса энтерита гусей для адсорбции на полистироловом планшете является 5-8 мкг/0,1 см³, поскольку увеличение ее выше 8 мкг/0,1 см³ приводит к многослойной сорбции антигена, вследствие чего снижается чувствительность реакции, а уменьшение ее - ниже 5 мкг/0,1 см³ не приводит к получению монослоя на полистироле, что также отрицательно сказывается на результатах.

Специфический комплекс - антиген-немеченное антитело выявляют использованием антивидового иммунопероксидазного конъюгата, специфичного к IgG гусей, поскольку это определяется его биологическими свойствами.

Способ осуществляют следующим образом.

Вирус энтерита гусей штамма П-75 хранится во ВГНКИ ветпрепаратов и выдается по требованию предприятия не реже 1 раза в год с паспортом, характеризующим свойства штамма.

Для получения вируссодержащего материала используют общепринятые методики (3).

Инфекционный титр вируссодержащей жидкости должна быть не ниже 4.0 lg ЭЛД₅₀ в 0,3 см³. Активный и специфичный антиген вируса энтерита гусей получают путем очистки вируссодержащей эмбриональной жидкости методом молекулярно-ситовой хроматографии на макропористом стекле с диаметром пор 700 Å (ВГХ), модифицированном ПВП.

В очищенном препарате вируса количество белка определяют по методу Лоури, и оно, как правило, составляет от 35 до 50 мкг/см ³. Затем очищенный препарат вируса разводят 0,01 М фосфатно-буферным раствором (ФБР) с содержанием 0,15 М хлорида натрия, рН 7,2-7,4, до конечной концентрации 5-8 мкг/0,1 см³ . Это значение является оптимальным параметром для адсорбции очищенного антигена вируса в лунках планшета, поскольку увеличение концентрации антигена свыше 8 мкг/0,1 см³ и уменьшение ее ниже 5 мкг/0,1 см³ снижает чувствительность реакции.

После определения активности и специфичности очищенный антиген вируса разделяют на две партии (части), одну из которых используют для иммунизации гусят с целью получения вирусспецифической сыворотки крови, а вторую - для адсорбции в лунках планшета для ИФА.

Твердофазный иммуносорбент получают посредством сорбции в лунках планшета для ИФА по 0,1 см³ разведенного в ФБР до конечной концентрации очищенного антигена в течение 16-18 часов при 2-4°С.

Затем содержимое лунок планшета удаляют резким встряхиванием и трехкратно промывают буфером следующего состава: 0,01 М калий-фосфатный буфер, содержащий 0,5 М хлорида натрия с конечной концентрацией детергента (твин-20, твин-80 или тритон Х-100) 0,1%, рН 7,2-7,4. После чего лунки планшета подсушивают путем постукивания по фильтровальной бумаге.

Для постановки иммуноферментного анализа используют: одно- и восьмиканальные автоматические пипетки со сменными наконечниками разных объемов, термостат с температурой нагрева (37,0±0,5)°С, бытовой холодильник, рН-метр тип 121 или 340, спектрофотометр любой конструкции с вертикальным лучом света при длине волны 450 нм.

Для исследования в лабораторию доставляют по 20-25 проб в объеме 0,2-0,3 см³ сывороток крови птиц разных возрастных групп из птицехозяйств, где имеется подозрение на данное заболевание.

Затем готовят иммуноспецифические и неспецифические компоненты и рабочие растворы:

Компонент №1 - положительная сыворотка крови гусей к вирусу энтерита (положительный контроль), разведенная 1:100 0,15 М раствором хлорида натрия с содержанием 1% фетальной сыворотки, лиофилизированная, 1,0 см³ - 1 ампула или флакон (K.I.);

Компонент №2 - отрицательная сыворотка крови гусей (отрицательный контроль), разведенная 1:100 0,15 М раствором хлорида натрия с содержанием 1% фетальной сыворотки, лиофилизированная, 1,0 см³ - 1 ампула или флакон (К.2.);

Компонент №3 - антиген вируса энтерита гусей, очищенный и адсорбированный по 0,1 см³ в лунках планшета для ИФА - 2 планшета (K.3.);

Компонент №4 - антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против IgG гусей, лиофилизированный, 0,2 или 1,0 см ³ - 1 ампула (флакон), рабочее разведение 1:21 (К.4.);

Компонент №5 - концентрат буферного раствора, 5 см ³ - 1 флакон (К.5.);

Компонент №6 - разбавленный детергент твин-20, твин-80 или тритон Х-100, 5 см ³ - 1 флакон (К.6.);

Компонент №7 - 5-аминосалициловая кислота, порошок, 20 мг - 1 флакон или 1 пробирка для микропроб (К.7.);

Компонент №8 - гидроперит, таблетка, 0,75 или 1,5 г - 1 шт. (К.8.);

Компонент №9 - 1% раствор NaOH, бесцветная прозрачная жидкость, 15 см³ - 1 флакон (К.9.);

Компонент №10 - натрий хлористый, кристаллический порошок, 22 г - 1 флакон (К.10.).

Приготовление рабочих растворов осуществляют следующим образом.

Раствор №1 - 0,01 М калий-фосфатный буфер, содержащий 0,5 М хлорида натрия с конечной концентрацией детергента (твина-20, твина-80 или тритона Х-100) 0,1%, рН 7,2-7,4. Для его приготовления берут флаконы с концентратом буферного раствора (К.5.) и хлористым натрием (К.10.), содержимое растворяют в 750 см³ дистиллированной воды, проверяют рН. Затем добавляют разбавленный детергент (К.6.).

Раствор используют для разведения положительной, отрицательной, исследуемых проб сывороток крови гусей, антивидового конъюгата и промывания лунок планшетов. Хранят не более 15 суток в бытовом холодильнике при 4-8°С.

Раствор №2 - содержимое ампулы (флакона) с положительной сывороткой крови гусей (K.1.) растворяют в 1,0 см³ раствора №1, получают разведение положительной сыворотки 1:100. Готовят перед использованием. Допускается хранение в морозильной камере бытового холодильника до 15 суток.

Раствор №3 - содержимое ампулы (флакона) с отрицательной сывороткой крови гусей (К.2.) растворяют с 1,0 см³ раствора №1, получают разведение отрицательной сыворотки 1:100. Готовят перед использованием. Допускается хранение в морозильной камере бытового холодильника до 15 сут.

Раствор №4 - содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом (К.4.) растворяют в 21 см³ раствора №1. Готовят перед использованием. Допускается хранение в морозильной камере бытового холодильника до 15 суток.

Раствор №5 - таблетку гидроперита 0,75 или 1,5 г (К.8.) растворяют в 22,5 или 45 см³ дистиллированной воды. Раствор хранят в защищенном от света месте при 4-8°С не более 10 суток.

Раствор №6 - субстратно-индикаторная смесь. 5-аминосалициловую кислоту (К.7.) растворяют в 25 см ³ горячей дистиллированной воды (70±2)°С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке, затем охлаждают до комнатной температуры и доводят рН до 6,0±0,1 с помощью 1% раствора NaOH (К.9.), затем добавляют 0,1 см ³ раствора №5. Раствор готовят непосредственно перед использованием, не хранят.

Исследуемые сыворотоки разводят 1:100 раствором №1. С этой целью к 1,0 см³ раствора №1 добавляют 0,01 см³ (10 мкл) сыворотки крови птиц. Затем в три лунки (A1, B1, C1) вертикального ряда планшета вносят по 0,1 см³ положительной сыворотки крови (раствор №2) и в следующие три лунки (D1, E1, F1) вносят по 0,1 см³ отрицательной сыворотки крови (раствор №3). В лунки G1, H1 вносят по 0,1 см ³ раствора №1, служащие для контроля конъюгата и субстратно-индикаторной смеси.

В остальные лунки рядов В2-12...Н2-12 вносят по 0,1 см³ раствора №1, а в лунки горизонтального ряда А2-12 по 0,2 см³ исследуемые пробы сывороток крови и проводят раститровку по вертикальным рядам, начиная от разведения 1:100 до 1:12800. С этой целью из лунок А2-12 отбирают по 0,1 см³ разведенных исследуемых сывороток крови и переносят в лунки В2-12 соответствующего ряда, пипетируют и проводят двукратное разведение переносом по 0,1 см³ в очередную лунку вертикального ряда планшета, удаляя из последних лунок Н2-12 по 0,1 см ³.

Планшет осторожно встряхивают для перемешивания содержимого, закрывают крышкой и переносят в термостат (37,0±0,5)°С на 30 мин. Затем лунки планшета освобождают от содержимого путем вытряхивания, трехкратно промывают раствором №1 в объеме 0,2 см³ и подсушивают путем постукивания перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.

Готовят раствор №4 и вносят во все лунки планшета по 0,1 см³ , затем помещают в термостат (37,0±0,5°С) на 30 мин. После инкубации раствор конъюгата удаляют, лунки трехкратно промывают раствором №1 и подсушивают путем постукивания перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.

Затем готовят субстратно-индикаторную смесь и вносят во все лунки планшета по 0,1 см ³. Планшет оставляют при комнатной температуре в темном месте на 10-15 мин.

Выявление специфических антител в сыворотках крови гусей иммуноферментным методом можно проводить и без раститровки испытуемых сывороток. В этом случае в три лунки (A1, B1, C1) вертикального ряда планшета вносят по 0,1 см³ разведенной 1:100 положительной сыворотки крови (положительный контроль), а в следующие три лунки (D1, E1, F1) вносят по 0,1 см³ разведенной 1:100 отрицательной сыворотки (отрицательный контроль). В лунки G1, H1 вносят по 0,1 см ³ раствора №1, служащие для контроля конъюгата и субстратно-индикаторной смеси, а в лунки А2 по 0,2 см³ положительной сыворотки и проводят раститровку по вертикальному ряду А2-Н2. В остальные лунки рядов А3-12...Н3-12 вносят по 0,1 см ³ исследуемых проб сывороток крови гусей в разведении 1:100, используя по одной лунке на каждую пробу. Остальные этапы постановки реакции проводят аналогично.

При спектрофотометрическом учете реакцию останавливают внесением во все лунки планшетов по 50 мкл (0,05 см³) 1% раствора NaOH (K.9.).

Учет результатов анализа проводят через 10-15 мин визуально - по интенсивности окрашивания содержимого лунок планшета или инструментально - с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом света при длине волны 450 нм.

При визуальном способе учета первоначально проводят оценку результатов по контрольным лункам планшета: содержимое лунок с положительной сывороткой (положительный контроль) должно быть интенсивно окрашено в коричневый цвет. Содержимое лунок с отрицательной сывороткой (отрицательный контроль) и контроль конъюгата должно быть бесцветным или иметь бледно-соломенное окрашивание. При отсутствии необходимости строгого количественного определения содержания специфических антител в исследуемых пробах сывороток крови учет результатов ИФА проводят визуально, сравнением цветового окрашивания содержимого лунок исследуемой сыворотки с интенсивностью окраски продукта пероксидазной реакции титруемого положительного контроля. Интенсивность цветового окрашивания продукта пероксидазной реакции пропорциональна содержанию антител к вирусу энтерита гусей.

Раститровка проб испытуемых сывороток крови дает возможность количественно оценить концентрацию специфических антител. За титр сыворотки принимается наивысшее ее разведение, при котором еще достаточно четко видна разница цветового окрашивания по сравнению с отрицательной сывороткой крови.

Спектрофотометрический учет результатов ИФА позволяет количественно оценить содержание антител в исследуемых пробах путем измерения значений оптической плотности (ОП) с одновременной записью результатов реакции с каждой лунки планшета на специальной бумажной ленте или листе бумаги. Среднее значение ОП отрицательных контролей должно быть не выше 0,150. Разница показателей между средним значением ОП положительного контроля и средним значением ОП отрицательного контроля (P-N) допустимо в диапазоне 0,340-0,780. Если она выходит за пределы этих значений, результаты считаются недостоверными и пробы исследуют заново. Наличие или отсутствие антител к вирусу энтерита гусей устанавливается сравнением значений оптической плотности тестируемой сыворотки (S) с положительным контролем (Р). Проба сыворотки с S/P-отношением ниже 0,18 должна расцениваться как отрицательная. Если S/P-отношение равно или больше, чем 0,18, то исследуемая проба должна расцениваться как положительная. При определении конечного титра исследуемой пробы по одному разведению 1:100, используют формулу Титр=antilg [2.02(lgs/p)+3,51], где

S - значение оптической плотности исследуемой сыворотки; Р - значение оптической плотности положительного контроля.

При обнаружении в сыворотках крови птиц разных возрастных групп, невакцинированных против ВЭГ, специфических антител в титрах 1:100 и выше у более, чем 50% исследуемых проб дает основание считать хозяйство стационарно неблагополучное по парвовирусной инфекции.

Для подтверждения диагноза проводят вирусологические исследования по выделению вируса из патологического материала (сердце, почки, селезенка, печень, кусочки 12-перстной кишки).

Оценкой эффективности применения вакцины является выявление в сыворотках крови привитых гусей специфических антител в титрах не ниже, чем 1:400 у 80% вакцинированной птицы.

Пример 1.

Был проведен сравнительный анализ результатов исследования проб сывороток крови гусей с помощью реакции нейтрализации (pH) и с использованием заявляемого способа.

Сыворотки проверяли на наличие антител к вирусу энтерита гусей в pH. Тест нейтрализации является классическим тестом для выявления специфических антител при вирусных заболеваниях, в том числе и при парвовирусной инфекции гусей. Результаты сравнительного изучения чувствительности ИФА и реакции нейтрализации при выявлении специфических антител к вирусу энтерита представлены в табл.1.

Таблица 1 Результаты сравнительного изучения серологических реакций
		Активность сывороток
№ п/п	Исследуемые сыворотки крови гусей	Титр вируснейтрализующих антител, log2	Заявляемое изобретение
1	Положительная сыворотка к вирусу энтерита гусей от 09.04.	9.5	1:3800
2	Положительная сыворотка к вирусу энтерита гусей от 05.05.	10.0	1:4570
3	Положительная сыворотка к вирусу энтерита гусей (положительный контроль) от 03.05	9.0	1:3235
4	Положительная сыворотка к вирусу энтерита от суточных гусят, полученных от вакцинированных гусынь	5.8	1:370
5	Положительная сыворотка к вирусу энтерита от вакцинированных гусей родительского стада	8.5	1:2820
6	Отрицательная сыворотка (отрицательный контроль) от 03.05	0.75	-

Результаты проведенных исследований показали, что предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет выявлять специфические антитела к вирусу энтерита гусей в сыворотках крови. Между двумя сравниваемыми способами коэффициент корреляции составил 1.0 (р<0.05). Время проведения исследования с использованием заявляемого изобретения составило 3 часа, а в случае pH - 5-6 суток.

Пример 2.

Были проведены испытания на активность и специфичность предложенного способа в шифрованном опыте.

На испытание были представлены:

1. Положительные сыворотки крови гусей (положительный контроль) от 03.05.

2. Отрицательные сыворотки крови гусей (отрицательный контроль) от 03.05.

3. Сыворотка крови гусят-реконвалесцентов - 10 проб.

4. Сыворотка крови гусей, вакцинированных против вирусного энтерита - 20 проб.

5. Сыворотка крови гусей из хозяйств, благополучных по вирусному энтериту - 25 проб.

6. Специфические (гетерологичные) сыворотки крови гусей к вирусам гепатита и реовирусу - по 2 пробы.

Для исследований было зашифровано 6 проб сывороток крови гусей. Исследуемые сыворотки разводили ФБР 1:100 и вносили в лунки планшета с адсорбированным очищенным антигеном вируса энтерита гусей в объеме 0,1 см³, по 2 лунки на каждую сыворотку. Иммуноферментную реакцию проводили аналогичным образом как указано ранее. Результаты испытаний представлены в табл.2.

Таблица 2 Выявление специфических антител в сыворотках крови гусей в шифрованном опыте
Шифр	Исследуемые сыворотки	Результат
1	Положительная к вирусу энтерита гусей (положительный контроль от 03.05)	+
2	Отрицательная сыворотка гусей (отрицательный контроль от 03.05)	-
3	Сыворотка крови гусят-реконвалесцентов	+
4	Сыворотка крови гусей, вакцинированных против вирусного энтерита	+
5	Сыворотка крови гусей из хозяйств, благополучных по вирусному энтериту	-
6	Положительная сыворотка крови гусей к вирусу гепатита	-
7	Положительная сыворотка крови гусей к реовирусу	-
Примечание: "+" - наличие антител к вирусу энтерита гусей в ИФА;
"-" - отсутствие антител в ИФА.

Результаты шифрованного опыта показали, что ИФА при выявлении специфических антител к вирусу энтерита гусей в сыворотках крови птиц обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Таким образом, заявляемый способ может быть использован для качественного и количественного выявления специфических антител к вирусу энтерита в сыворотках крови гусей при проведении серологического мониторинга птицепоголовья, а также для определения уровня поствакцинального иммунитета против вирусного энтерита (парвовирусной инфекции) гусей.

Источники информации

1. Патент RU №2118539, A61K 39/15, G01N 33/535.

2. Gouf R.E., Applikation of the agar gel preeipiting and virus neutralisation test to the serological stady of goose parvovirus. Avian Palhology, 13, 501-509.

3. Сюрин В.Л. «Руководство по ветеринарной вирусологии». M., 1966.

4. Патент SU №1475331, 1999.

5. Патент RU №2192012, A61К 39/15, G01N 33/535, 27.10.2002.