биопрепарат-нефтедеструктор, используемый для очистки почв и грунтов от нефти и нефтепродуктов

Формула изобретения

Биопрепарат-нефтедеструктор, используемый для очистки грунтов и почвы от нефти и нефтепродуктов, содержащий биомассу консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5, отличающийся тем, что он дополнительно содержит биомассу аэробных азотфиксирующих микроорганизмов Azotobacter vinelandii ИБ 4 и биомассу аэробных спорообразующих микроорганизмов Bacillus species 739 в массовом соотношении, равном 1:1:0,5÷1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии защиты окружающей среды.

Способы биологической очистки нефтезагрязненных почв и грунтов, основанные на использовании ферментативной активности углеводородокисляющих микроорганизмов, характеризуются как наиболее эффективные и экологически безопасные. Известно [1] два принципиальных подхода к биодеградации нефтяных углеводородов: (1) - интродукция в загрязненную экосистему специально подобранных ассоциаций микроорганизмов-деструкторов различных классов углеводородных поллютантов; (2) - активизация аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры путем создания оптимальных условий для ее развития. Наиболее перспективны биотехнологии, предусматривающие сочетание этих двух подходов, в частности внесение в почву биопрепаратов, включающих бактериальные ассоциации и минеральные удобрения.

Известны консорциумы нефтеокисляющих микроорганизмов, предназначенные для очистки почв от нефтяного загрязнения [2-4]. Однако следует отметить, что степень биодеградации нефтяных углеводородов определяется при этом только потенциалом интродуцированных в систему микроорганизмов-деструкторов. То есть потенциал аборигенной микробиоты, присутствующей в загрязненной нефтью или нефтепродуктами экосистеме, по биодеградации углеводородов остается неиспользованным, что снижает эффективность процесса биологической рекультивации.

Ближайшим аналогом (прототипом) предлагаемого изобретения является консорциум микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов [5]. Известно его использование для биологической рекультивации отработанной отбеливающей земли, содержащей нефтепродукты [6] (биопрепарат «Ленойл»).

Недостатком известного консорциума штаммов микроорганизмов-нефтедеструкторов является сравнительно низкая степень биодеструкции нефти и нефтепродуктов.

Технической задачей предлагаемого биопрепарата является повышение эффективности биодеградации нефти и нефтепродуктов в загрязненных почвах и грунтах.

Поставленная задача решается путем создания биопрепарата, содержащего биомассу консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5, биомассу аэробных азотфиксирующих микроорганизмов Azotobacter vinelandii ИБ 4 и биомассу аэробных спорообразующих бактерий Bacillus species 739, вносимых в массовом соотношении 1:1:0,5÷1.

Указанный штамм микроорганизмов Azotobacter vinelandii известен в качестве основы биопрепарата для борьбы с корневыми гнилями пшеницы и повышения количества и качества урожая [7]. В процессе своей жизнедеятельности бактерии Azotobacter vinelandii ИБ 4 секретируют в окружающую среду различные биологически активные вещества, в том числе цитокинины; таким образом, биомасса этих микроорганизмов может играть роль эффективного биологического удобрения, стимулирующего развитие всей микробиоты в нефтезагрязненном объекте.

Штамм бактерий Bacillus sp.739 - основа биопрепарата «Бациспецин БМ», используемого против грибковых возбудителей болезней злаковых культур [8]. Указанный штамм микроорганизмов в процессе своей жизнедеятельности продуцирует различные биологически активные вещества, в том числе циклодекстрины и обладает фитогормональной активностью [9].

Примеры конкретного выполнения.

В лабораторных испытаниях эффективности предлагаемого биопрепарата-нефтедеструктора использовали биомассу консорциума микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5, полученную при их совместной ферментации, биомассу микроорганизмов Azotobacter vinelandii ИБ 4 и биомассу микроорганизмов Bacillus species 739.

Консорциум микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5 (биопрепарат «Ленойл») выращивают в аэробных условиях на питательной среде следующего состава, г/л: Na₂CO ₃ - 0,1; CaCl₂ - 0,01; MnSO ₄·7H₂O - 0,02; FeSO ₄·7H₂O - 0,02; NaH ₂PO₄ - 1,5; К₂ HPO₄ - 1,0; MgSO₄ ·7H₂O - 0,2; NH₄ NO₃ - 2,0; вода дистиллированная до 1000 мл. В качестве единственного источника углерода используется дизельное топливо, процесс ферментации проводят при комнатной температуре до достижения титра микроорганизмов в культуральной жидкости, равного 10⁹ КОЕ/мл.

Биомассу микроорганизмов Azotobacter vinelandii ИБ 4 (биопрепарат «Азолен») выращивают в аэробных условиях на питательной среде следующего состава, г/л: КН₂PO₄ - 0,2; К₂HPO₄ - 0,8; CaSO₄·2H₂ O - 0,1; MgSO₄·7H₂ O - 0,2; FeCl₃ - 0,01; Na ₂MoO₄ - 0,01; дрожжевой экстракт - 0,5; сахароза - 20 г; вода дистиллированная до 1000 мл. Процесс ферментации проводят при комнатной температуре до достижения титра микроорганизмов в культуральной жидкости, равного 10 ⁹ КОЕ/мл.

Биомассу микроорганизмов Bacillus species 739 (биопрепарат «Бациспецин БМ») выращивают в аэробных условиях на питательной среде следующего состава, мас.%: крахмал - 1,0-2,0; К₂HPO₄ - 0,2; (NH ₄)₂HPO₄ - 0,2; (NH₄)₂SO ₄ - 0,3; СаСО₃ - 1,0; вода до 100%. Процесс ферментации проводят при температуре 40-43°С в течение 48 часов, затем культуру высушивают на распылительной сушилке. Титр клеток препарата «Бациспецин БМ» составляет 2,0·10 ⁶ КОЕ/г.

Для оценки интенсивности разложения нефти или нефтепродуктов использовали показатель остаточного содержания нефтепродуктов в загрязненном субстрате.

Определение остаточного содержания нефтепродуктов проводили спектрофотометрическим и весовым методами [10]. По первому из них пробу весом 10 г помещали в патрон из фильтровальной бумаги и переносили в аппарат Сокслета. Экстракцию проводили 120-150 мл гексана в течение 2-3 часов при температуре кипения гексана (69°С). Концентрацию углеводородов в пробе определяли по оптической плотности экстракта на спектрофотометре СФ-46 при длине волны, на которой данная смесь углеводородов имела максимальный пик поглощения. Максимальный пик поглощения определяли на спектрофотометре SPECORD UF-VIS. По весовому методу пробу весом 10 г помещали в патрон из фильтровальной бумаги и взвешивали на электронных весах. Проэкстрагированные пробы вместе с патронами высушивали в жарочном шкафу при температуре 100-120°С и снова взвешивали на электронных весах. По разнице в весе проб до и после экстракции определяли содержание остаточных нефтепродуктов.

Численность основных групп микроорганизмов, участвующих в биотрансформации нефтепродуктов, определяли посевом почвенной суспензии методом разведений на плотные питательные среды [11]: бактерий, усваивающих органический азот - на мясопептонном агаре (МПА), олигонитрофилов - на питательной среде Эшби, микроскопических грибов (микромицетов) - на среде Чапека и углеводородокисляющих микроорганизмов на среде Цукамуры, где в качестве источника углерода была использована стерильная смесь углеводородов, полученная после экстракции гексаном загрязненной отбеливающей земли.

Схема лабораторного (модельного) опыта по рекультивации отбеливающей земли: в отбеливающую землю, содержащую 181 г/кг остаточных углеводородов, вносили минеральные удобрения (нитрофоска из расчета 0,25 г/кг субстрата), биопрепарат «Ленойл» из расчета 1 мл к 1 кг отбеливающей земли и биопрепарат «Азолен» в массовом соотношении к биопрепарату «Ленойл», составляющем 1:1, 1,25:1 и 0,75:1. Повторность опытов - трехкратная, длительность экспериментов - 150 сут. Влажность в сосудах в течение всего срока инкубации поддерживали на уровне 60%, температуру - 20-25°С. Отбор проб отбеливающей земли осуществляли через 30 суток.

Результаты испытания предлагаемого биопрепарата-нефтедеструктора показали, что внесение консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species с дополнительной добавкой биомассы бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 значительно повышает эффективность процесса биодеградации нефтепродуктов в отбеливающей земле (табл.1). Через 150 суток инкубации степень снижения содержания нефтепродуктов в этом случае составила 81,3 мас.%. Применение биопрепарата «Ленойл» без внесения биопрепарата «Азолен» в условиях опыта оказалось менее эффективным, а степень биодеградации нефтепродуктов составила всего 69,3 мас.%. При массовом соотношении биомассы бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 к биомассе консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов, составляющем 0,75:1, эффективность процесса биодеградации нефтепродуктов снижалась, а при соотношении 1,25:1 величина степени биодеградации практически не отличалась от соответствующего показателя, достигнутого при массовом соотношении, равном 1:1.

Дополнительное внесение в нефтезагрязненную отбеливающую землю биомассы микроорганизмов биопрепарата «Бациспецин БМ» совместно с внесением биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен» при их массовом соотношении, равном 1:1:0,5÷1, показало увеличение эффективности процесса биологической ремедиации субстрата. Это выразилось в повышении степени биодеградации углеводородов, содержащихся в отработанной отбеливающей земле. Так, если степень биодеградации углеводородов при использовании смеси биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен» при их массовом соотношении, равном 1:1, за 150 сут эксперимента составляла 81,3 мас.%, то степень биодеградации углеводородов в аналогичных условиях эксперимента при совместном внесении биомассы микроорганизмов биопрепаратов «Ленойл», «Азолен» и «Бациспецин БМ» при их массовом соотношении 1:1:0,5÷1 составляла 87,3-87,6 мас.% (табл.1). Внесение в нефтезагрязненный субстрат смеси биомасс биопрепаратов «Ленойл», «Азолен» и «Бациспецин БМ» в массовом соотношении 1:1:0,3 снижало эффективность процесса биодеградации углеводородов и степень их биодеструкции в условиях эксперимента составила величину, равную 81,6 мас.%. При внесении в нефтезагрязненный субстрат смеси биомасс биопрепаратов «Ленойл», «Азолен» и «Бациспецин БМ» в массовом соотношении, равном 1:1:1,5, степень биодеструкции углеводородов составила 87,6 мас.%; таким образом повышение массовой доли биомассы микроорганизмов биопрепарата «Бациспецин БМ» не привело к дополнительному увеличению эффективности процесса биодеградации углеводородов.

Внесение в нефтезагрязненный субстрат биомассы бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 и биомассы бактерий Bacillus species 739 совместно с биомассой бактерий биопрепарата «Ленойл» способствует значительному увеличению численности почвенных микроорганизмов, принимающих участие в трансформации нефтепродуктов, загрязняющих отбеливающую землю - гетеротрофных бактерий, растущих на МПА, олигонитрофилов, углеводородокисляющих бактерий и микромицетов (табл.2-5). По-видимому, биомасса этих микроорганизмов, содержащая в своем составе различные биологически активные вещества, играет роль эффективного биологического удобрения, стимулирующего развитие всей микробиоты в нефтезагрязненном объекте.

Таким образом, предлагаемый биопрепарат-нефтедеструктор, содержащий биомассу консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5, биомассу аэробных азотфиксирующих бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 и биомассу бактерий Bacillus species 739 в массовом соотношении, равном 1:1:0,5÷1, позволяет повысить эффективность процесса биоразложения нефтепродуктов в грунте, активизировать микробиологическую активность почвы. Вместе с тем использование предлагаемого биопрепарата-нефтедеструктора не нарушает жизнедеятельность полезной микробиоты нефтезагрязненного субстрата.

Таблица 1
Динамика изменения степени биодеградации углеводородов в отбеливающей земле
Варианты опыта	Степень биодеградации углеводородов, мас.%
	30 сут	60 сут	90 сут	120 сут	150 сут
Контроль - отбеливающая земля без внесения биопрепаратов	5,3	6,1	13,1	13,1	15,3
Биопрепарат «Ленойл»	32,1	39,3	43,1	55,4	69,3
Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен» в массовом соотношении 1:1	42,3	61,2	68,1	79,2	81,3
Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен» в массовом соотношении 1,25:1	41,4	60,0	66,8	77,2	78,6
Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен» в массовом соотношении 0,75:1	42,3	61,5	69,0	79,3	81,3
Совместное внесение биопрепаратов	44,3	67,2	70,1	81,7	87,3
«Ленойл», «Азолен» и «Бациспецин БМ» в массовом соотношении 1:1:0,5
Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл», «Азолен» и «Бациспецин БМ» в массовом соотношении 1:1:1	44,6	68,2	70,7	81,3	87,6
Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл», «Азолен» и «Бациспецин БМ» в массовом соотношении 1:1:0,3	42,4	61,5	68,2	79,4	81,6
Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл», «Азолен» и «Бациспецин БМ» в массовом соотношении 1:1:1,5	44,6	68,2	70,7	81,3	87,6

Таблица 2
Динамика изменения численности бактерий на МПА
Варианты опыта	Количество клеток, тыс. в 1 г абсолютно сухой почвы
	30 сут	60 сут	90 сут	120 сут	150 сут
Контроль - отбеливающая земля без внесения биопрепаратов	20±1	80±11	80±6	90±5	130±8
Биопрепарат «Ленойл»	670±43	320±13	590±46	990±104	1120±82
Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен»	980±68	2800±63	1750±122	1390±111	1180±101
Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл», «Азолен», «Бациспецин БМ»	1120±46	3200±70	2420±85	2200±60	2320±80

Таблица 3
Динамика изменения численности олигонитрофилов на среде Эшби
Варианты опыта	Количество клеток, тыс. в 1 г абсолютно сухой почвы
	30 сут	60 сут	90 сут	120 сут	150 сут
Контроль - отбеливающая земля без внесения биопрепаратов	10±1	180±8	280±50	360±22	410±31
Биопрепарат «Ленойл»	40±6	750±92	790±103	850±68	900±68
Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен»	560±49	490±57	580±97	640±38	680±50
Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл», «Азолен», «Бациспецин БМ»	750±61	710±56	780±83	830±45	860±43

Таблица 4
Динамика изменения численности углеводородокисляющих бактерий на среде Цукамуры
Варианты опыта	Количество клеток, тыс. в 1 г абсолютно сухой почвы
	30 сут	60 сут	90 сут	120 сут	150 сут
Контроль - отбеливающая земля без внесения биопрепаратов	15±2	50±3	50±7	50±6	30±1
Биопрепарат «Ленойл»	270±48	130±19	148±22	176±14	180±20
Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен»	310±28	200±20	267±17	281±32	310±30
Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл», «Азолен», «Бациспецин БМ»	407±25	348±17	386±19	390±30	425±28

Таблица 5
Динамика изменения численности микромицетов на среде Чапека
Варианты опыта	Количество клеток, тыс. в 1 г абсолютно сухой почвы
	30 сут	60 сут	90 сут	120 сут	150 сут
Контроль - отбеливающая земля без внесения биопрепаратов	15±2	18±2	13±5	20±4	13±2
Биопрепарат «Ленойл»	53±3	25±6	13±1	33±2	13±4
Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен»	60±9	65±6	60±8	70±8	70±20
Совместное внесение биопрепаратов «Ленойл», «Азолен», «Бациспецин БМ»	75±6	78±8	81±9	85±6	87±7

Список литературы

1. Вельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы // Биотехнология. - 1995. - №3-4. - С.20-27.

2. Пат. 2023686 Российская Федерация. Консорциум микроорганизмов, используемых для очистки почвенных и солоновато-водных экосистем от загрязнения нефтепродуктами / И.А.Борзенков, Е.И.Милехина, С.С.Беляев, М.В.Иванов. - 1994, - Бюл. 22.

3. Пат. 2083667 Российская Федерация, С12N 1/20. Консорциум микроорганизмов-деструкторов: Alcaligenes denitrificans, Pseudomonas maltopfilia, Pseudomonas putida, Pseudomonas species, Bacillus species для очистки почв, почвогрунтов, вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности / Г.П.Голодяев. Заявлено 15.08.95; опубл. 10.07.97.

4. Пат. 2182529 Российская Федерация, С12N 1/26. Консорциум штаммов микроорганизмов-деструкторов: Bacillus species, Aeromonas species, Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes denitrificans, используемый для очистки почв, почвогрунтов и вод от нефтяных загрязнений / Г.П.Голодяев. Заявлено 15.08.2000; опубл. 20.05.2002.

5. Пат. 2232806 Российская Федерация, 7 С12N 1/20. Консорциум штаммов микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов / О.Н.Логинов, Н.Н.Силищев, Р.Н.Чураев, Т.Ф.Бойко, Н.Ф.Галимзянова, Е.А.Данилова, А.К.Подцепихин, И.М.Султанов, С.П.Четвериков. Заявлено 12.08.2002; опубл. 20.07.2004. Бюл. 20.

6. Пат. 2237711 Российская Федерация, 7 С12N 1/20. Способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами / О.Н.Логинов, В.В.Пилюгин, В.П.Костюченко, С.И.Комаров, Н.Н.Силищев. Заявлено 30.12.2002; опубл. 10.10.2004. Бюл. 28.

7. Пат. 2245918 Российская Федерация, 7 С12N 1/20. Штамм бактерий Azotobacter vinelandii для получения биопрепарата для борьбы с корневыми гнилями пшеницы и повышения количества и качества урожая / О.Н.Логинов, Е.Г.Пугачева, Н.Н.Силищев, Т.Ф.Бойко, Н.Ф.Галимзянова. Заявлено 07.07.2003; опубл. 10.02.2005. Бюл. 4.

8. Пат. 1743019 Российская Федерация, 5 С12N 1/20. Штамм бактерий Bacillus sp. для получения препарата против грибковых возбудителей болезней злаковых культур / А.И.Мелентьев, Н.Г.Усанов, О.Н.Логинов. Заявлено 03.10.1989; опубл. 30.05.1994.

9. Морозов Ю.М., Мелентьев А.И., Кузьмина Л.Ю. Ультраструктура клеток пшеницы при развитии бактерий Bacillus sp. - активного начала бактериального инокулята Бациспецин БМ // Физиология растений. - 1994. - Т.41, №1. - С.36-43.

10. Груздякова Р.А. Спектрофотометрическое определение нефтепродуктов в пробах почвы // Гигиена и санитария. - 1993. - №3. - С.73-74.

11. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. - М.: МГУ. - 1980. - 223 с.