способ культивирования трехмерных комплексов клеток и устройство для его осуществления

Формула изобретения

1. Способ культивирования трехмерных комплексов клеток, предусматривающий движение клеток и комплексов клеток в жидкой среде, отличающийся тем, что это движение осуществляют путем направленного перемещения клеток и комплексов клеток преимущественно в вертикальном направлении вдоль оси культивационной камеры, имеющей форму цилиндра, при этом направленное перемещение осуществляют путем поворота культивационной камеры в вертикальной плоскости на 180° с остановкой вращения при совмещении оси культивационной камеры с вектором силы тяжести с последующим многократным повторением цикла.

2. Устройство для осуществления способа по п.1, содержащее культивационную камеру, выполненную, по меньшей мере, частично из газопроницаемого материала в форме цилиндра и привод для вращения вокруг горизонтальной оси, отличающееся тем, что дополнительно содержит управляющее устройство, соединенное с приводом и обеспечивающее поворот камеры на 180°, при этом культивационная камера выполнена в виде вертикально расположенного высокого цилиндра.

3. Устройство по п.2, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит оборудование для слежения за перемещением культур и управления приводом по принципу обратной связи.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам выращивания клеточных культур.

Трехмерные (многослойные) агломераты клеток, получаемые in vitro, имитируют архитектуру и межклеточные взаимодействия, присущие нативным тканям, и являются более адекватным модельным объектом для биомедицинских исследований, чем монослойные, «двумерные» культуры. Развитие технологий выращивания трехмерных культур животных клеток позволит значительно расширить возможности восстановления или замещения поврежденных тканей организма человека благодаря созданию имплантатов из аутологичных клеток, которые, в отличие от донорского материала, не вызывают иммунных реакций.

Известно несколько различных способов получения трехмерных культур нетрансформированных животных клеток. В частности, трехмерный рост наблюдается при выращивании клеток в пористом матриксе (в том числе биодеградируемом), или же на поверхности пористой мембраны, отделяющей отсек с питательной средой. Более эффективными являются методы выращивания трехмерных культур, поддерживаемых во взвешенном состоянии в жидкой среде. Для этих целей был разработан ротационный культиватор, принцип действия которого заключается в непрерывном вращении заполненной жидкой средой культуральной емкости вокруг горизонтальной оси. В этих условиях клеточные агломераты испытывают воздействие нескольких сил (силы тяжести, силы сопротивления среды, кориолисовой и центробежной сил), под влиянием которых они движутся по круговым траекториям. Длительное время считалось, что ротационное культивирование позволяет компенсировать воздействие на клетки силы тяжести, что и стимулирует трехмерный рост культур. Впоследствии данные представления были признаны необоснованными, и трехмерный рост культур в настоящее время связывают с низким уровнем турбулентности, сдвиговых напряжений и более эффективным переносом нутриентов и продуктов жизнедеятельности клеток при ротационном культивировании. Большое значение имеет осуществление газообмена через газопроницаемую мембрану, благодаря чему исключается повреждающее воздействие газовых пузырьков, присутствующих в традиционных установках для суспензионного культивирования [Hammond T.G., Hammond J.M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am. J. Physiol. Renal Physiol. V. 281, F12-F25 (2001)].

Впервые метод ротационного культивирования был реализован в устройстве [Schwarz R.P., et al. Gas permeable bioreactor and method of use. US Patent №5,437,998]. Основной элемент культиватора - газопроницаемая цилиндрическая камера, ось которой расположена в горизонтальной плоскости. Вращение культивационной камеры вокруг горизонтальной оси позволяет поддерживать находящиеся в ней клеточные культуры во взвешенном состоянии в жидкой среде при низком уровне турбуленции и сдвиговых воздействий. Данный способ имеет ряд недостатков: культивирование необходимо осуществлять при высокой скорости вращения (30 об/мин, и более). Движение находящихся в культиваторе частиц подчиняется статистическим законам. Траектории культур внутри камеры имеют сложную форму, что затрудняет контроль за их положением в процессе культивирования. При культивировании многоклеточных конструкций, имеющих более высокую плотность, чем плотность жидкой культуральной среды, неизбежны соударения со стенками культивационной камеры, сила которых при используемых угловых скоростях лимитирует целостность культур, в случае если они к этому времени достигли значительных размеров. Для предотвращения дрейфа клеточных агломератов к боковым стенкам камеры клетки предварительно прикрепляют к гранулам носителя, обладающего более низкой, по сравнению с питательной средой, плотностью. В ходе ротационного культивирования комплексы клетка-носитель скапливаются вблизи оси вращения камеры, и эффективность переноса растворенных в среде веществ снижается.

Авторы конструкции особо акцентируют возможность использования культивационной камеры как одноразовой в связи с ее конструктивной простотой, однако для создания протока среды через камеру необходимо применять достаточно сложные гермосоединения для подключения трубопроводов к вращающимся емкостям, что осложняет обеспечение стерильности в процессе культивирования.

Сходными функциональными качествами обладает устройство [Huijser R.H. New small size microgravity simulator for the bioscience laboratory. FS-MG-R00-017 Fokker Space (2000)], обеспечивающее одновременное вращение культивационной камеры относительно двух взаимоперпендикулярных осей. Величина и направление скорости вращения в каждый момент времени выбираются как случайные величины. Данному устройству также присущи недостатки, обусловленные непрерывным вращением камеры с клеточными культурами. По-видимому, именно этот факт заставил разработчиков вводить ограничения величины угловой скорости при работе культиватора.

Условия трехмерного роста создаются для суспензионных культур, находящихся в потоке жидкой среды. Для достижения стабильной динамической обстановки с низким уровнем турбулентности и сдвиговых воздействий был предложен культиватор, представляющий собой вертикальную цилиндрическую камеру, в которой сформирован устойчивый спиралевидный поток питательной среды. Во время культивирования частицы культур, благодаря существующим в этом культиваторе гидродинамическим условиям, в процессе движения не выходят за пределы потока жидкости [Bradamante S., et al. Bioreattore, in particolare per spettroscopia NMR. Pat. # PD2003A000142, 2003]. Недостатком способа является неравномерность скорости тока жидкости по высоте сосуда.

Прототипом предлагаемого способа служит метод ротационного культивирования, обеспечивающий длительное пребывание культур в суспендированном состоянии в жидкой среде [Schwarz R.P., et al. Gas permeable bioreactor and method of use. Патент США №5,437,998]. Трехмерные клеточные культуры помещены в расположенную горизонтально цилиндрическую камеру с закрытыми концами, заполненную жидкой питательной средой. Камера непрерывно вращается вокруг своей оси, и находящиеся в ней культуры движутся по круговым траекториям. Такой способ поддержания суспензионной культуры позволяет снизить турбуленцию и сдвиговые напряжения, однако в процессе движения культур, плотность которых превышает плотность среды, происходит постепенное смещение клеточных агломератов в направлении от оси вращения и в результате частицы культуры на большой скорости сталкиваются с внутренней поверхностью цилиндра. При значительных размерах культур соударение с поверхностью камеры приводит к фракционированию образовавшихся агломератов клеток. Ротационное культивирование клеток, предварительно прикрепленных к гранулам носителя, обладающего плотностью, меньшей, чем плотность культуральной среды, приводит к образованию скоплений комплексов клетки-носитель в центре камеры и ухудшает условия для обмена нутриентов и продуктов жизнедеятельности с внешней средой. Для снижения повреждающих воздействий на клетки корпус культивационной камеры ротационного биореактора, по крайней мере, частично, выполняется из газопроницаемых материалов, что позволяет обеспечивать газообмен с внешней средой при отсутствии газовой фазы во внутреннем пространстве биореактора. Культивационная камера снабжена одним или несколькими гермосоединениями для подачи и отвода материалов. Устройство для ротационного культивирования снабжено приводом, обеспечивающим вращение культивационной камеры относительно горизонтальной оси.

Задачей изобретения является создание способа культивирования суспендированных в жидкой среде трехмерных комплексов эукариотических клеток, позволяющего снизить повреждающие воздействия на клетки, обусловленные соударением частиц культуры, обладающих высокой кинетической энергией, со стенками культивационной камеры.

Данная задача решается предлагаемым способом выращивания трехмерных клеточных культур: клетки или агломераты клеток (в том числе прикрепленные к носителю) помещают в газопроницаемый сосуд цилиндрической формы, который устанавливают так, чтобы движение клеток и комплексов клеток осуществлялось в вертикальном направлении, которое совпадает с осью цилиндра. Периодически производится поворот цилиндра на 180° и, соответственно, движение клеток (частиц культуры) относительно культивационной камеры меняется на противоположное. В течение короткого времени после начала движения устанавливается постоянная скорость движения частиц в вертикальном направлении в жидкой среде, значение которой существенно ниже скоростей, характерных для ротационного культивирования. Миграции частиц в жидкой среде обеспечивают поступление нутриентов и удаление продуктов жизнедеятельности, и, кроме того, перемешивание питательной среды.

Для осуществления способа разработано устройство для культивирования трехмерных комплексов клеток (фиг.1), состоящее из культивационной камеры (1), выполненной, по крайней мере, частично, из газопроницаемого материала, снабженной штуцерами для подачи и отвода материалов (2, 2а), привода (3), обеспечивающего периодическое вращение культивационной камеры, держателя (4), предназначенного для крепления культивационной камеры, блока управления и контроля (5). Культивационная камера может выполняться как одноразовая. Так как данное устройство позволяет осуществлять поворот культивационной камеры попеременно в противоположных направлениях, не требуется использования специальных подводов к вращающимся частям конструкции, что упрощает конструкцию и облегчает обеспечение стерильности.

Устройство для культивирования работает следующим образом. Культивационную камеру через имеющиеся штуцеры заполняют культуральной средой и вносят клетки или «затравочные» трехмерные структуры (содержащие носитель или без него), служащие исходным материалом для выращивания трехмерных культур. Объем культивационной камеры герметизируют, культивационную камеру закрепляют в держателе, подсоединенному к управляемому приводу. Устройство помещают в модуль, обеспечивающий необходимый температурный режим и состав газовой среды, включают привод, управляемый с помощью блока управления и контроля. С помощью блока управления и контроля устанавливается режим вращения, обеспечивающий повороты культивационной камеры на 180° с частотой, необходимой для получения желаемой формы и амплитуды траекторий культур. В зависимости от конкретного экспериментального протокола могут выполняться различные по продолжительности остановки культивационной камеры в вертикальном положении. Как правило, основную часть времени перемещение культур происходит вдоль вектора силы тяжести. Возможно использование дополнительного оборудования для слежения за перемещениями культур и управления приводом по принципу обратной связи. (При культивировании клеток, прикрепленных к носителю и образующих комплексы, плотность которых ниже плотности среды, движение культур при повороте культивационной камеры происходит в противоположном направлении - против направления вектора силы тяжести).

Культивационная камера может быть выполнена в различных вариантах в зависимости от ее назначения - для многократного или однократного применения. В случае культивирования в непрерывном режиме целесообразно предварительное насыщение подаваемой в камеру питательной среды газовой смесью во внешнем газообменном устройстве.

Пример. Культивационная камера, входящая в состав устройства для культивирования, изготавливается в виде полого цилиндра диаметром 10 мм и длиной 150 мм. 30-50% площади цилиндрической поверхности выполняется из пористого полимерного материала с размером пор не более 0,22 мкм. На противоположных концах цилиндра имеются штуцеры, служащие для подачи и удаления жидкой среды и клеток. Культивационную камеру подвергают стерилизации и хранят в стерильной упаковке. Заполнение культуральной средой и заправку клеток (или «затравочных» трехмерных комплексов, в том числе клеток, прикрепленных к носителю) проводят в стерильных условиях. Культивационную камеру закрепляют в держателе, жестко соединенном с приводом. Ориентируют камеру таким образом, чтобы ось цилиндра совпала с вектором гравитации. После оседания клеток на нижнюю торцевую поверхность камеры камеру переворачивают на 180° вокруг горизонтальной оси после перемещения клеточных культур на требуемое расстояние от «стартовой» торцевой поверхности, включают вращение привода. Поворот культивационной камеры на 180° осуществляется в течение 0,2-0,5 секунд, после чего цилиндр фиксируют в вертикальном положении на время, необходимое для перемещения частиц культуры к противоположному торцу камеры (3-10 секунд), после чего цикл повторяют. Устройство помещают в термостатируемую герметичную камеру, заполненную газовой смесью заданного состава (CO₂-инкубатор). При необходимости допускается остановка вращения камеры для проведения манипуляций с культурами или смены среды. Контроль состояния выращенных в культиваторе трехмерных культур фибробластов и кардиомиоцитов методами микроскопии показал отсутствие повреждений культур и жизнеспособность образующих их клеток.