мелафен в качестве регулятора роста для увеличения накопления берберина в клеточной культуре василистника малого

Формула изобретения

Применение Мелафена для увеличения накопления берберина в клеточной культуре Василистника малого.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к применению известного регулятора роста растений Мелафена для увеличения накопления (содержания) алкалоида берберина в суспензионной клеточной культуре Василистника малого.

Берберин - четвертичный изохинолиновый алкалоид протобербериновой подгруппы, широко использующийся при лечении заболеваний желудка и желчного пузыря (Потопальский А.И., Петличная Л.И., Ивасивка С.В. Барбарис и его препараты в биологии и медицине. - Киев. Наукова думка. - 1989. - С.287) [1]. Берберин содержится в растениях семейства барбарисовых, лютиковых, маковых и др. (Manske R.H.F., Ashford W.R. The Protoberberine Alkaloids. // The alkaloids. Chemistry and physiology. Y.IY / Ed. Manske R.N.Y. - London: Asad. Presss. - 1954. - P.77-118. Тележенецкая М.В. Алкалоиды рода Taliktrum. // Итоги исследования алкалоидных растений. Под ред. Арипова Х.Н. Ташкент: ФАН - 1993. - С.190-205) [2, 3].

В России основным сырьем для получения берберина является кора корней барбариса обыкновенного и барбариса амурского, в которых содержание алкалоидов достигает 2% [1].

Берберин является одним из немногих продуктов, получаемых в промышленности биотехнологическим способом, т.е. путем использования в качестве альтернативного источника биологически активных веществ клеточную биомассу лекарственных растений. Коммерческое производство берберина из культуры клеток Coptis Japonika реализовано в Японии (Fujita Y. Industrial Production of Shikonin and berberine. // Application of Plant Cell and Tissue Culture: CIBA Foundation Symp. 137 / Eds Bosk G., Marsh J. / Chichester, Sussex: у and Sons Ltd, 1988. - p.228-235) [4].

Известно, что в клеточной культуре травянистого растения Василистника малого (Thalictrum Minus) содержание берберина превышает таковое в нативном растении примерно на два порядка (Рабинович С.А., Смирнов A.M. Алкалоиды калусных тканей Papaver bracteatum.a клеток растений и биотехнология. - Москва. Наука. - 1986. - С.63-66) [5]. Поэтому оптимизация условий выращивания данной клеточной линии достаточно актуальна.

Увеличение накопления берберина в альтернативном источнике биологически активных веществ - биомассе культивируемых клеток и тканей растений - является актуальным и в связи с ограниченностью природных ресурсов и особенностью проведения заготовительных работ (строгая очередность эксплуатации зарослей, повторные заготовки не чаще чем через 5-10 лет).

Клеточная культура Василистника малого накапливает синтезируемые протобербериновые алкалоиды в основном внутри клеток, небольшая часть их экскретируется в культуральную жидкость. Для своего роста культура требует внесения в питательный субстрат регуляторов роста. Оптимальными в данном случае являются биологически активные соединения, относящиеся к ауксиновой и цитокининовой группам: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота - 2,4-Д - в концентрации 1*10^-4 г/л и кинетин в концентрации 5*10 ^-4 г/л (Урманцева В.В., Гаевская О.А., Смирнов А.В. и др. Особенности культуры клеток Thalictrum minus как продуцента алкалоидов. // Физиология растений. - 2000. - Т.47, №1. - С.65-72) [6].

Задача изобретения - расширение арсенала известных средств, способствующих увеличению накопления берберина в суспензионной клеточной культуре Василистника малого и сокращению цикла развития клеточной культуры.

Технический результат достигается внесением Мелафена в качестве единственного регулятора роста в питательную среду для выращивания суспензионной культуры клеток Василистника малого.

Мелафен представляет собой меламиновую соль бис(оксиметил)фосфиновой кислоты, предложенную в качестве высокоэффективного синтетического регулятора роста и развития растений (RU 2158735 С1, 2000.11.10) [7]. Препарат малотоксичен - LD₅₀ 2000 мг/кг на мышах.

Известно его применение при культивировании культуры ткани Раувольфии змеиной в питательной среде с последующим выделением целевого продукта (RU 2174555 С1, 2001.10.10) [8].

Исследования проводились с суспензионной культурой Василистника малого, полученной в НПО «Всероссийский Институт лекарственных и ароматических растений» (ВИЛАР) в 1987 году из черешка листа растения киргизской популяции, выращенного в Ботаническом саду ВИЛАР, штамм задепонирован в 1990 г. (Даниличев М.В., Рабинович С.А., Давыденков В.Н., Гребнева Е.В. Культура тканей Василистника - продуцент берберина. // Деп. В ВИНИТИ 11.03.90 №1312-В90. 1990, с.35-38) [9].

В питательную среду для выращивания суспензионной культуры клеток Василистника малого входят следующие компоненты (мг/л):

А. Минеральная основа по Мурасиге и Скугу, мг/л

Калий азотнокислый	1900
Аммоний азотнокислый	1650
Кальций хлористый двухводный	440
Магний сернокислый	370
Калий фосфорнокислый семиводный	170
Борная кислота	6,2
Марганец сернокислый четырехводный	22,3
Кобальт хлористый шестиводный	0,0025
Медь сернокислая пятиводная	0,025
Цинк сернокислый семиводный	8,6
Натрий молибденовокислый двухводный	0,25
Калий йодистый	0,83
Железо сернокислое семиводное	27,8
Трилон Б	37,3

В. Другие компоненты:

Сахароза	40000
Тиамин бромид	0,1
Пиридоксин хлорид	0,5
Никотиновая кислота	0,1
Мелафен	1*10 -1-1*10-3

Мелафен добавляют в питательную среду непосредственно перед автоклавированием.

Стерилизацию объектов осуществляют при температуре 119°С и избыточном давлении 0,9 атм в течение 25 минут.

Культивирование суспензионной культуры Василистника малого осуществляют в колбах на качалке, совершающей 100 об/мин, при температуре 26°С, в темноте. Соотношение инокулюма и питательной среды составляет 1:10 по объему. Химический анализ биомассы Василистника проводят хроматоспектрофотометрическим методом (Цыбулько Н.С., Осипова Е.А. Методы определения протобербериновых алкалоидов в культуре ткани Василистника. Химико-фармацевтический журнал, 1999, №4, с.34-36) [10]. Высушенную ткань экстрагируют этиловым спиртом до полного извлечения действующих веществ и определяют количественное содержание алкалоида берберика методом ТСХ, после элюирования алкалоидов с пластинки измеряют оптическую плотность целевого компонента при длине волны 427 нм.

Установлено воздействие пяти концентраций Мелафена: 5*10^-4, 1*10 ^-4, 5*10^-5, 1*10^-6 , 1*10^-8 г/л в динамике нарастания биомассы: 10, 15, 20 суток. В контрольный вариант вносят стандартные регуляторы роста: кинетин и 2,4-Д. Результаты эксперимента приведены в таблице 1.

Результаты показывают, что введение в питательную среду Мелафена как единственного регулятора роста положительно влияет на рост суспензионной культуры Василистника малого. При всех изучаемых концентрациях наблюдают достаточно активное нарастание биомассы. Мелафен не только стимулирует ростовые процессы, но и значительно повышает их интенсивность. Стандартные регуляторы роста (контроль) стимулируют максимальное нарастание биомассы на 20 сутки роста, а при применении Мелафена данный эффект наблюдается уже на 15 сутки. Таким образом, при введении в питательный субстрат Мелафена цикл развития сокращается на 5 суток при интенсификации процесса роста на 25%.

Следует отметить несколько различное влияние на рост клеточной культуры самих изучаемых концентраций Мелафена. Самая низкая концентрация Мелафена, равная 1*10 ^-8 г/л, обеспечивает достаточно активное нарастание биомассы уже в течение первых 10 суток роста, но культура при этом имеет более светлое-желтое окрашивание. С увеличением концентрации Мелафена до 5*10^-5 г/л нарастание биомассы несколько снижается, но окрашивание биомассы становится более интенсивным. Алкалоид берберин имеет желтое окрашивание и по цвету суспензии клеток можно вести визуальную оценку биосинтеза. При дальнейшем повышении концентрации Мелафена ростовые процессы интенсифицируются, но при этом суммарное содержание берберина уменьшается.

Применение Мелафена приводит к значительному повышению биосинтетической активности культуры. Спектрофотометрический анализ показывает, что накопление алкалоида берберина в культуре ткани по сравнению с контролем возрастает на 275%. Оптимальной для синтеза алкалоида берберина можно считать концентрацию Мелафена, равную 5*10^-5 г/л. Данная концентрация Мелафена обеспечивает уже на 15 сутки максимальный выход берберина и достаточно высокое нарастание биомассы.

Таким образом, применение Мелафена в качестве единственного регулятора роста при культивировании суспензионной клеточной культуры Василистника малого существенно повышает накопление в ней берберина и сокращает цикл развития культуры.

Следует отметить, что заявляемый технический результат не является очевидным, так, изучение действия Мелафена на рост и продуктивность клеточной культуры макротомии красящей, продуцента шиконина, который является природным красителем для парфюмерной и пищевой промышленности, текстильного производства и на основе которого изготавливаются медицинские препараты, показало, что Мелафен не оказывает влияния на содержание шиконина в калусной культуре макротомии красящей, хотя и способствует увеличению роста самой культуры.

Таким образом, применение регулятора роста растений Мелафена для увеличения накопления (содержания) алкалоида берберина в суспензионной клеточной культуре Василистника малого дает хорошие результаты и расширяет арсенал известных средств, позволяющих увеличивать содержание берберина в суспензионной клеточной культуре Василистника малого.

Таблица 1
Динамика накопления алкалоида берберина в культуре ткани Василистника малого под действием регулятора роста Мелафена в зависимости от концентрации и сравнение с динамикой накопления алкалоида берберина в культуре ткани Василистника малого под действием регуляторов роста кинетина и 2,4-Д
Регулятор роста	Масса ткани, г/л			Содержание берберина, мг/л
	10 сутки	15 сутки	20 сутки	10 сутки		15 сутки		20 сутки
				1	2	1	2	1	2
Мелафен (5*10-4 г/л)	11,52	18,98	16,92	33,50	57,00	36,06	48,00	54,14	46,00
Мелафен (1*10 -1 г/л)	13,96	18,46	18,12	48,86	46,00	44,31	42,00	81,50	81,00
Мелафен (5*10-5 г/л)	12,85	17,85	15,53	35,98	70,00	66,10	72,00	74,54	52,00
Мелафен (1*10-6 г/л)	12,35	17,01	13,80	24,70	39,00	30,62	42,00	51,06	10,00
Мелафен (1*10-8 г/л)	16,20	18,84	18,42	27,54	30,00	30,14	22,00	25,76	38,00
Кинетин (0,5 г/л) и 2,4-Д (1,0 г/л)	10,26	14,07	16,35	9,23	11,0	21,10	29,0	27,79	18,00
1 - в биомассе 2 - в культуральной жидкости

Таблица 2
Сравнительные данные по выходу биомассы и алкалоида берберина с использованием Мелафена и с использованием Кинетина и 2,4-Д
Питательная среда	Получаемый продукт	Сроки культивирования (сутки)
		10	15	20
С использованием Мелафена	Масса ткани, г/л	12,85	17,85	15,53
	Берберин, мг/л (суммарное содержание)	105,98	138,10	126,54
с использованием Кинетика и 2,4-Д	Масса ткани, г/л	10,26	14,07	16,35
	Берберин, мг/л (суммарное содержание)	20,23	50,10	45,79