способ прогнозирования развития сирингомиелии у лиц русской этнической принадлежности

Формула изобретения

Способ прогнозирования развития сирингомиелии, характеризующийся тем, что проводят выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование полиморфизма SpI (1546G>T) гена 1 цепи коллагена I типа (Col1A1), при выявлении аллеля Col1A1·s прогнозируют риск развития сирингомиелии у обследуемого русской этнической принадлежности.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно, к неврологии, и может быть использовано для прогнозирования развития сирингомиелии у лиц русской этнической принадлежности.

Сирингомиелия - хроническое прогрессирующее заболевание нервной системы, характеризующееся разрастанием глии (спинальный глиоз, глиоматоз) и образованием полости в спинном мозге. Основными клиническими признаками сирингомиелии являются развитие диссоциированных расстройств чувствительности, периферических парезов, преимущественно в руках, и трофических изменений кожи, костей и суставов. Врожденная форма заболевания часто имеет семейный характер и поражает чаще мужчин в возрасте 25-40 лет. Данное заболевание является краевой патологией в Башкортостане с неравномерной частотой распространения по районам и представляет собой серьезную медико-социальную проблему, так как приводит к ранней инвалидизации молодого трудоспособного населения.

Самым эффективным и экономичным направлением в медицине является профилактика заболевания. Первичная профилактика предполагает формирование групп риска сирингомиелии с использованием молекулярно-генетических маркеров заболевания и меры предупреждения развития болезни.

Применение разработанного способа обеспечивает выявление лиц с повышенным риском развития сирингомиелии с целью формирования групп высокого риска и осуществления своевременных целенаправленных мероприятий по профилактике развития данной патологии.

Известен способ прогнозирования течения нервно-психических заболеваний и степени риска их развития, заключающийся в заборе крови, получении сыворотки, иммуноферментном анализе с использованием тест-системы ELI-N-1, определении в динамике уровня сывороточных антител к антигенам нервной ткани (ATI), уровня соответствующих антиидиотипических антител (АТ2), коэффициента I, представляющего собой отношение АТ2/АТ1.

Прогнозирование осуществляют по степени выраженности отклонений исследуемых параметров от уровня нормальных значений (патент РФ 2002108749, 2003 г.). Недостатком представленного способа является его низкая прогностическая значимость вследствие недифференцированного подхода. Данный способ не позволяет оценить риск развития сирингомиелии в частности, а определяет только общий риск развития нервно-психических заболеваний, к которым относятся как моногенные расстройства с установленным этиопатогенезом (атрофическую миотонию, болезнь Гентингтона, Х-сцепленную бульбоспинальную амиотрофию, синдром Ретта, и др.), так и обширная группа генетически и клинически гетерогенных состояний (Болезнь Альцгеймера, эпилепсия, шизофрения и др.), где оценить вклад наследственных и внешнесредовых факторов не представляется возможным. Кроме того, иммуноферментный анализ - достаточно дорогостоящий и сложный метод, который не столь чувствителен как полимеразная цепная реакция синтеза (ПЦР) ДНК и допускает как ложно положительные, так и ложно отрицательные результаты.

Авторами в доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружен способ прогнозирования риска развития сирингомиелии.

Задачей изобретения стала разработка объективного, высокоинформативного способа прогнозирования риска развития сирингомиелии у лиц русской этнической принадлежности, позволяющего в количественном отношении оценить риск возникновения данного заболевания.

Технический результат при использовании изобретения - получение критериев прогнозирования развития сирингомиелии у лиц русской этнической принадлежности.

Указанный технический результат достигается тем, что выделяют ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции, проводят генотипирование SpI (1546G>T) полиморфизма гена 1-цепи коллагена 1 типа (Col1A1), и при выявлении аллеля Col1A1*s прогнозируют риск развития сирингомиелии у обследуемого русской этнической принадлежности.

Способ осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew С.С.The isolation of high molecular weight eukaryotic DNA // Methods in Molecular Biology / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press. - 1984. - V.2. - P.31-34). Кровь набирают в пробирку с консервантом, содержащим 0,48% лимонной кислоты, 1,32% лимоннокислого натрия, 1,47% глюкозы, в соотношении 6:1, тщательно перемешивают и хранят при температуре 4°С не более одной недели. Для выделения ДНК к 8 мл крови добавляют 32 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl, рН 7,6. Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 400 мкл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА, рН 8,0 и 75 мМ NaCl, ресуспензируют, прибавляют 40 мкл 10% SDS, 20 мкл протеиназы К (10 мг/мл), затем образец инкубируют в термостате при 37°С в течение 18 часов. После этого из лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 минут и отбором водной фазы после каждого этапа. ДНК осаждается из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в деионизированной бидистиллированной воде и хранят при -20°С.

Выделенная ДНК используется для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР).

Генотипирование SpI (1546G>T) полиморфизма гена 1-цепи коллагена 1 типа (Col1Al) проводиться при помощи полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) в реакционной смеси объемом 25 мкл, которая содержит 2,5 мкл 10×Taq-буфера (67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH₄) ₂ SO_4,, 1,5 мМ MgCl ₂, 0,01% Tween-20), 0,1 мкг геномной ДНК, смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP no 200 мкМ каждого), 1 ед. ДНК-полимеразы Termus aquaticus и 5-10 пМ локусспецифичных олигонуклеотидных праймеров. Последовательности праймеров, размеры амплифицируемых фрагментов и температурные режимы амплификации представлены в таблице 1 и 2.

Амплификат, наработанный при ПЦР полиморфного локуса гена Col1A1, подвергают ферментативному гидролизу с использованием рестриктазы MlsI (к 20 мкл амплификата добавляют 5 Ед. активности рестриктазы и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 12 часов).

Продукты, образованные при амплификации и гидролизе, оцениваются путем разделения при помощи электрофореза в 7% полиакриламидном геле.

Электрофорез проводится в 1×TBE буфере (0,089 М трис; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА, рН 8,0). Пробы перед нанесением на гель, смешиваются в соотношении 5:1 с краской, содержащей 0,25% бромфеноловый синий, 0,25% ксиленцианол и 15% фикол. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромидом этидия (0,1 мкг/мл) в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете (при длине волны 312 нм) на трансиллюминаторе.

В качестве конкретного примера проведено клинико-генетическое изучение группы неродственных больных (N=121) из 116 семей с установленным клиническим диагнозом «сирингомиелия» [G95.0]. Выборка больных состояла из пациентов различной этнической принадлежности: 48 татар, 31 русских, 31 башкир и 11 метисов, сирингомиелией.

Набор больных осуществлялся на базе Республиканской клинической больницы им. Г.Г.Куватова, кафедры неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики Башкирского государственного медицинского университета, а также в ходе экспедиционных выездов с 2000 по 2003 гг. Клинический осмотр, оценка характера, степени психических и двигательных нарушений проводились в соответствии с Международной классификацией болезней 10-го пересмотра.

Контрольная группа состояла из 185 человек, не имеющих клинических признаков сирингомиелии и мальформации Арнольда-Киари, а также по возрастному, половому и этническому составу соответствующих группе больных с сирингомиелией.

В работе использованы образцы ДНК обследованных больных с клиническим диагнозом сирингомиелия, состоящих на учете в медико-генетическом регистре Республики Башкортостан, а также здоровых доноров, проживающих в Башкортостане.

Рядом авторов предложена гипотеза генетической основы сирингомиелии, основанная на семейном сцеплении сирингомиелии с редкими заболеваниями, косегрегации с известными генетическими синдромами, а также результатах исследований с использованием близнецового метода (Speer M., et al. A genetic hypotesis for Chiari I malformation with or without syringomyelia // Neurosurg Focus. - 2000. - Vol.8, №3. - Р.1-4.)

Учитывая возможность нарушения остеогенеза как сопутствующего или предрасполагающего фактора при сирингомиелии, проведено исследование гена, участвующего в процессах формирования и резорбции костной ткани.

Коллаген 1 типа является основным белком матрикса соединительной (до 25-30%) и костной (90%) тканей. Он придает механическую прочность и выполняет морфогенетическую функцию, влияя на рост, миграцию и дифференцировку клеток, определяя их секреторную и синтетическую активность. Структурно он образован из 1- и 2- полипептидных цепей, синтез которых у человека детерминируется двумя соответствующими генами - Col1A1 и Соl1А2. В настоящее время известны мутации в этих генах, приводящие к развитию переломов, остеопений, а также полиморфизмы, ассоциированные со снижением минеральной плотности костной ткани (Баранов B.C., с соавт. Геном человека и гены «предрасположенности» (Введение в предиктивную медицину). СПб. Интермедика. - 2000. - С.160-170).

Ген 1-цепи коллагена 1 типа (Col1A1) расположен на 17 хромосоме в области q21.3-22. В первом интроне гена Col1A1 существует сайт узнавания для транскрипционного фактора SpI, в котором обнаружена замена гуанина на тимин (1546G>T; af017178), приводящего к возникновению Col1A1*s аллеля, функциональная активность которого составляет не более 16% по сравнению с Col1A1*S аллелем (Berg J.P., Lehmann E.H., Stakkestad J.A., Haug E. and Halse J. The Spl binding site polymorphism in the collagen type I alpha 1 (COL1A1) gene is not associated with bone mineral density in healthy children, adolescents, and young adults // Eur J Endocrinol. - 2000. V.143. P.261-265).

С целью выявления генетических маркеров, ассоциированных с повышенным риском развития сирингомиелии, проведен анализ полиморфного ДНК-локуса af017178 гена, кодирующего 1 полипептидные цепи коллагена I типа.

Молекулярно-генетический анализ полиморфизма SpI (1546G>T) гена 1 цепи коллагена I типа (Col1A1) выполнен методом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

Доверительные интервалы частот аллелей и генотипов рассчитывали на основе точной формулы с использованием F-распределения (Животовский Л.А. Популяционная биометрия. - М.: Наука, 1991).

При попарном сравнении частот генотипов и аллелей ДНК-локуса SpI (1546G>T) в группах больных и здоровых лиц использовался критерий хи-квадрат ( ²) для таблиц сопряженности 2×2 с поправкой Иэйтса на непрерывность, вычисляемый по формуле:

где n₁ и n ₂ - объемы сравниваемых распределений; p ₁ и р₂ - частоты соответствующих классов.

Для подтверждения гипотезы о влиянии какого-то аллельного варианта или генотипа как протективного феномена или фактора риска развития сирингомиелии нами проведена для статистически значимо различающихся вариаций проанализированных вышеуказанных полиморфных ДНК-локусов оценка статистики связи - показателя отношения шансов (OR - odds ratio), a также границ его 95% доверительного интервала (CI95%). OR является мерой ассоциации, количественно определяющей взаимосвязь между фактором риска и развитием расстройства в ретроспективном исследовании. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя OR по формуле, предложенной Бландом (Bland, J.M. The odds ratio / J.M.Bland, D.G.Altman // Br. Med. J. - 2000. - Vol.320. - P.1468):

OR=(a×d)/(b×c),

где a - число лиц с наличием, b - с отсутствием маркера среди больных; c и d - число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых доноров.

При OR=1 - нет ассоциации, OR>1 рассматривается как положительная ассоциация заболевания с аллелем или генотипом («фактор риска») и OR<1 - как отрицательная ассоциация («фактор устойчивости»).

Доверительный интервал для показателя отношения шансов рассчитывался по формуле:

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ Statistica ver. 6.0 (StatSoft, Inc., 2001), программы «R×C» (Rows × Columns).

У больных сирингомиелией аллель Col1A1*s встречался в среднем с частотой 0.157, варьируя от 0.097 у башкир до 0.258 у русских, достигая достоверных различий между больными башкирского и русского происхождения ( ²=4.476, df=1, p=0.035). Между больными и контрольной группой в целом обнаружены статистически значимые различия в распределении частот аллелей SpI (1546G>Т) полиморфизма гена Col1A1 ( ²=4.77, df=1, р=0.029). Относительный риск составил 1.60 (95% CI=1.047-2.436). При разделении по этнической принадлежности выявлены достоверные различия по частоте аллеля Col1A1*s между больными сирингомиелией и контрольной группой здоровых доноров русской этнической принадлежности ( ²=5.77, df=1, p=0.017). Относительный риск для данной группы больных по сравнению с контролем составил 2.38 (95% CI=1.226-4.630), что позволяет рассматривать аллель Col1A1*s в качестве аллеля повышенного риска сирингомиелии у русских.

Таким образом, в ходе проведенного исследования установлено, что выявление аллеля Col1A1*s у лиц русской этнической принадлежности позволяет прогнозировать риск развития сирингомиелии у обследуемого.

Пример 1.

Обследуемый Ф., 1975 г.р., русской этнической принадлежности, сын больного А., 1945 г.р. с установленным диагнозом сирингомиелии, смешанной формы, медленно прогрессирующего течения с поражением сегментов спинного мозга CII - DVII, умеренным верхним парапарезом по периферическому типу, пирамидной недостаточностью в ногах, гипэстезией, трофическими нарушениями в руках. Диагноз больному А. установлен клинически в 1985 году, подтвержден магниторезонансной томографией в 2005 году. На момент обследования испытуемый Ф. клинически здоров.

Учитывая отягощенный семейный анамнез, определен риск развития сирингомиелии у наблюдаемого Ф. С этой целью у него была взята из вены кровь, выделена ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции и проведен генетический анализ полиморфизма SpI (1546G>Т) гена 1 цепи коллагена I типа (Col1A1) методом полиморфизма длины рестрикционных фрагметов.

Анализ показал, что обследуемый Ф. является носителем аллеля Col1A1*s. В отношении него был определен риск развития сирингомиелии, были предприняты необходимые меры профилактического характера, он был взят на диспансерный учет, даны рекомендации по наиболее подходящему образу жизни, рациональному трудоустройству.

Таблица 1
Тип полиморфизма, последовательность праймеров анализируемого полиморфизма SpI (1546G>7) гена альфа I цепи коллагена I типа (Col1A1)
Ген [OMIM], локализация	Полиморфизм (аллели)	Праймеры (рестриктаза)	Источник
Col1A1	SpI	5'-gtccagccctcatcctggcc-3'	Langdahl B.L. et al., 1998
[120150]	*S	5-taacttctggactatttgcggactttttgg-3'
17q21.3	*s	(MlsI)

Таблица 2
Температурные режимы амплификации ДНК-локуса
Этапы ПЦР		Col1A1A
		t°C	мин', сек"
1.	Начальная денатурация	94	4'
2.	Денатурация	95	45"
	Отжиг	57	45"
	Элонгация	72	2"
	Число циклов	30
3.	Пост-ПЦР	72	7"