способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани

Формула изобретения

Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани, включающий ферментативный гидролиз, депротеинизацию, осаждение, отличающийся тем, что деминерализацию проводят в течение 20 ч используя 0,5 н. HCl, ферментативный гидролиз проводят в течение 18 ч используя фермент пепсин, депротеинизацию осуществляют добавлением сульфата аммония до 75%-ного насыщения, осаждение гликозаминогликанов проводят 4%-ным ацетатом калия в 96%-ном этаноле, переосаждают этанолом, проводят лиофильную сушку, разделяют гликозаминогликаны хроматографически с использованием ДЕАЕ-сефадекса А-25, проводят лиофильную сушку.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относиться к области химической технологии и косметологии, возможно его использование в области медицины и здравоохранения для производства биологически активных и пищевых добавок, действие которых направлено на улучшение состояния соединительной ткани.

В настоящее время известно, что гликозаминогликаны (ГАГ) из разных видов соединительной ткани применяются с целью хондропротективного действия в артрологии, а также используют естественные и синтетические гликозаминогликаны, которые входят в ряд препаратов для регенерации покровных тканей. [Остеоартроз: современное состояние проблемы (аналитический обзор) / Миронов С.П. С.96-99].

В литературе описаны способы выделения гликозаминогликанов из хрящевой ткани (Карякина Е.В., Косягин Д.В. Определение гликозаминогликанов сыворотки крови // Лаб. дело. - 1982. - №10. - С.15-17).

Для проведения ферментативного гидролиза в этих способах используются протеолитические ферменты (проназа Е), а для осаждения гликозаминогликанов - специфические осадители ГАГ - четвертичные аммониевые основания (цетилпиридиний хлорид либо цетилпиридиний бромид) (Косягин Д.В., Василенко Ж.Б. Осаждение ГАГ мочи солями алифатических аммониевых оснований и их очистка // Лаб. дело. - 1988. - №2, - С.57).

Известнен способ выделения агрегатов протеогликанов, в котором проводят диализ до полного удаления солей, освобождаются от растворимого коллагена и неагрегированных протеогликанов путем их осаждения лимонной кислотой, далее проводят диализ до полного удаления кислоты, полученный раствор обрабатывают H⁺ формой катионита для получения кислой формы агрегатов протеогликанов, далее солевой формой катионита для получения кислой солевой формы агрегатов протеогликанов, которую затем обрабатывают не менее чем двойным объемом 96,6° этанола, насыщенного ацетатом металла, для осаждения основной формы агрегатов протеогликанов, с последующей промывкой и сушкой осадка этиловым спиртом и эфиром, при этом кислотно-солевая и основно-солевая формы агрегатов протеогликанеов могут быть лиофилизированы. (Патент РФ №2096038, опубл. 20.11.1997).

Однако данный метод подразумевает длительную процедуру диализа и использование большого количества дистиллированной воды. Кроме того, конечным продуктом являются углеводобелковые соединения, т.е. недостаточно освобожденные от белка гликозаминогликаны. Использование катионитов требует их регенерации, а промывка и сушка этанол-эфирной смесью является токсичной процедурой на конечном этапе очистки ГАГ из-за процессов сорбции эфира на целевом продукте.

Известно также косметическое средство, предотвращающее старение кожи, в основе которого в качестве активных ингридиентов используются ферментный препарат панкреатин и гиалуроновая кислота, введенные в состав жировой основы гидрогенизированного хлопкового масла, гидролина и глицерина с использованием консервантов, антисептиков и антиоксидантов (Патент РФ №2078561, опубл. 10.04.1996).

Однако известное средство является дорогим по себестоимости, энергоемким, трудоемким.

Известен способ выделения гликозаминогликанов (ГАГ) из фиброзного хряща, в котором хрящ подвергают протеолизу папаином депротеинизации гидролизата трихлоруксусной кислотой и осаждение гликозаминогликанов этанолом, содержащим уксуснокислые соли калия или натрия (Патент РФ №2089201 опубл. 10.09.1997 г.).

Однако в известном способе предлагается выделение ГАГ из неминерализованной соединительно-костной ткани - фиброзного хряща и он не предназначен для выделения ГАГ из костей сельскохозяйственных животных.

Задачей настоящего изобретения является разработка экономичного по расходу времени и реактивов способа выделения гликозаминогликанов из различных видов минерализованной соединительной ткани, в первую очередь, из костей сельхозживотных.

Поставленная задача решается тем, что в способе выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани, включающем ферментативный гидролиз, депротеинизацию, осаждение, деминерализацию проводят в течение 20 ч, используя 0,5 н. HCl, ферментативный гидролиз проводят в течение 18 ч, используя фермент пепсин, депротеинизацию осуществляют добавлением сульфата аммония до 75%-го насыщения, осаждение гликозаминогликанов проводят 4%-ным ацетатом калия в 96% этаноле, переосаждают этанолом, проводят лиофильную сушку, разделяют гликозаминогликаны хроматографически с использованием ДЕАЕ-сефадекса А-25, проводят лиофильную сушку.

Настоящее изобретение поясняют подробным описанием, примером лабораторного выполнения и иллюстрациями, на которых:

фиг.1 - иллюстрирует схему выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани;

фиг.2 - иллюстрирует хроматографический профиль гликозаминогликанов костной ткани на анионообменнике.

Способ осуществляют следующим образом.

После предварительной обработки, заключающейся в удалении мягких тканей, минерализованную соединительную ткань (например, кости крупного рогатого скота) измельчали до кусочков около 5×5 мм. Затем ткань подвергали деминерализации 0,5 н. HCl в течение 20 ч, после этой процедуры деминерализованную ткань освобождали от раствора костного минерала, неколлагеновых белков и проводили пепсиновый протеолиз в присутствии фермента в 0,1 М HCl с рН=2. Пепсин брался из расчета 1 мг на 100 мг ткани. За 18 ч инкубации при температуре 37°С на магнитной мешалке ткань разрушалась полностью с образованием коллоидного раствора, который подвергали центрифугированию при 40.000gx. Белки, РНК, гликопротеины осаждали из супернатанта добавлением сульфата аммония до 75%-го насыщения. Осадок формировался в течение 1 ч, после чего его отделяли центрифугированием (10 мин, 40.000gx). Из полученного супернатанта проводили осаждение ГАГ 4%-ным ацетатом калия в 96% этаноле. Осадок ГАГ, собранный центрифугированием, переосаждали этанолом, снова собирали и лиофильно высушивали. Для получения высокоочищеных фракций ГАГ их разделяли хроматографически с использованием ДЕАЕ-сефадекса А-25, после этого лиофильно высушивали и для изготовления косметического средства гомогенизировали с мазевой основой в массовом соотношении 1:10 соответственно.

Пример лабораторного выполнения

Кости крупного рогатого скота очищают от мягких тканей, обезжиренные спирт-эфирной смесью 1:1 измельчают до кусочков размерами 5×5 мм.

100 г измельченной обезжиренной костной ткани помещают в круглодонную колбу, в которую заливают 200 мл 0,5 н. HCl и оставляют на 20 ч при комнатной температуре. Полученный после удаления надосадка нерастворившийся костный матрикс заливают 0,1 М HCl и вносят 1 мг пепсина. Реакционную массу помещают на магнитную мешалку и проводят ферментативный гидролиз костной ткани в течение 18 ч до полного растворения костей и образования коллоидного раствора.

После этого из раствора протеолизата центрифугированием при 40.000gx 10 мин отделяют осадок, в котором содержаться белки, РНК, гликопротеины. Отбирают в стаканы для центрифугирования супернатант и проводят депротеинизацию, добавляя в него сульфат аммония до 75% насыщения. После повторного центрифугирования в том же режиме осаждают ГАГ 4%-ным ацетатом калия в 96% этаноле в расчете объемов 1:4. Осадок формируется в течение 30 мин на холоде при 4°С. После центрифугирования при 1.300gx 15 мин удаляют супернатант, собирая отработанный 4%-ный ацетат калия в 96% этаноле в отдельную емкость для последующей перегонки этанола. Осадок ГАГ, собранный центрифугированием, переосаждают этанолом, снова центрифугируют при 1.300gx 15 мин, собирают и лиофильно высушивают. Для получения высокоочищеных фракций ГАГ их разделяли хроматографически с использованием ДЕАЕ-сефадекса А-25 (ионообменная емкость 3,5+0,5 meg/g, размер гранул 40-120 мкм). Линейный градиент концентрации элюирующего раствора создают использованием 0,00-2,5 М хлористого натрия в 0,02 М трис-HCl буфере (рН 7,0). Фракции денситометрируют при 226 нм и отбирают по 3 мл, идентифицируя их по определению ГУК, гексоз, общего азота и сульфатов. После этого полученные растворы различных фракций ГАГ лиофильно высушивают.

Выделенные высокоочищенные ГАГ вводят в мазевую основу в соотношении 1:10 соответственно.

Предлагаемый способ прост в использовании, позволяет воспроизводить его в условиях лаборатории лечебного учреждения, для его осуществления не требуется применения дорогостоящих реактивов - специфических осадителей ГАГ и большого количества протеолитических ферментов.

Кроме того, этот способ экономичен по времени, дает возможность повторного использования этанола при собирании его использованным, после последующей перегонки, и позволяет получить высокоочищенный целевой продукт.

Предлагаемый способ используется в биохимической лаборатории РНЦ "ВТО" им. академика Г.А.Илизарова, там же разработано и косметическое средство.