способ идентификации соединений, взаимодействующих с трансмембранными белками

Формула изобретения

1. Способ отбора соединения-кандидата по его способности взаимодействовать, по меньшей мере, с одним трансмембранным белком, включающий трансфекцию клетки, по меньшей мере, одной нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, включающий трансмембранный белок, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность ядерной локализации (nuclear localization sequence, NLS) и обнаруживаемую часть молекулы, и обеспечивающей экспрессию в клетке кодируемого белка;

приведение клетки в контакт с соединением-кандидатом; определение распределения в клетке экспрессированного белка путем определения распределения в клетке обнаруживаемой части молекулы; причем определение измененного распределения в клетке обнаруживаемой части молекулы в сравнении с распределением обнаруживаемой части молекулы в контрольной клетке, не имевшей контакта с соединением-кандидатом, указывает на то, что соединение взаимодействует с трансмембранным белком.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что обнаруживаемой частью молекулы является обнаруживаемый пептид, включающий антигенную часть аминокислотной последовательности трансмембранного белка, и/или нуклеотидная последовательность кодирует слитый белок, включающий трансмембранный белок, содержащий, по меньшей мере, одну NLS и обнаруживаемую часть молекулы, причем трансмембранный белок дикого типа содержит NLS, или же трансмембранный белок дикого типа лишен NLS и нукпеотидная последовательность, кодирующая трансмембранный белок, модифицирована так, чтобы кодировать NLS, предпочтительно NLS, выбранную из Таблицы 1 или из группы, состоящей из KKFKR (последовательность ID №158), PKKKRKV (последовательность ID №154) и AFSAKKFKR (последовательность ID №159).

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что клетка представляет собой прокариотическую клетку или эукариотическую клетку, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из клетки млекопитающего (предпочтительно выбранной из группы, состоящей из клеток НЕК, COS и СНО), дрожжевой клетки, клетки насекомого, клетки нематоды, клетки растения и клетки гриба.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что обнаруживаемой частью молекулы является антигенный пептид и при этом распределение в клетке антигенного пептида определяют, давая ему возможность связываться с основанной на применении антител системой детектирования, содержащей антитела, специфичные к антигенному пептиду, предпочтительно с основанной на применении антител системе детектирования, которая содержит первичные антитела, специфичные к антигенному пептиду, и вторичные антитела, несущие обнаруживаемую метку и специфичные к первичным антителам, или с основанной на применении антител системе детектирования, которая содержит первичные антитела, специфичные к антигенному пептиду и несущие обнаруживаемую метку, предпочтительно обнаруживаемую оптическим способом метку и более предпочтительно - люминесцентную метку или флуоресцентную метку, или же обнаруживаемой частью молекулы является полипептид, выбранный из группы, состоящей из зеленого флуоресцирующего белка, красного флуоресцирующего белка и их модифицированных вариантов.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что трансмембранный белок выбран из группы, состоящей из сопряженного с белком G рецептора (G protein coupled receptor, GPCR), предпочтительно рецептора дофамина D1, рецептора дофамина D2, рецептора дофамина D3, рецептора дофамина D5, рецептора гистамина-1, рецептора-1 цистеинил-лейкотриена, рецептора-2 цистеинил-лейкотриена, опиоидного рецептора, мускаринового рецептора, рецептора серотонина, бета2-адренергического рецептора и рецептора метаботропного глутамата-4; переносчика, предпочтительно переносчика дофамина или переносчика серотонина; рецептора цитокина, предпочтительно рецептора эритропоэтина или рецептора инсулина; тирозин-киназного рецептора, предпочтительно рецептора фактора роста эпидермиса или рецептора инсулина, и рецептора липопротеина низкой плотности (LDL).

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что клетку трансфицируют несколькими нуклеотидными последовательностями, причем каждая из указанных последовательностей кодирует белок, включающий свой трансмембранный белок, содержащий, по меньшей мере, одну NLS, при этом предпочтительно, чтобы каждая из указанных нуклеотидных последовательностей кодировала белок, содержащий свою обнаруживаемую часть молекулы, или чтобы, по меньшей мере, одна обнаруживаемая часть молекулы являлась одинаковой, по меньшей мере, для двух кодируемых белков.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетку перед контактом с соединением-кандидатом приводят в контакт с соединением, про которое известно, что оно взаимодействует, по меньшей мере, с одним трансмембранным белком, при этом определение измененного распределения в клетке обнаруживаемой части молекулы по сравнению с распределением обнаруживаемой части молекулы в контрольной клетке, приведенной в контакт с соединением, про которое известно, что оно взаимодействует, по меньшей мере, с одним трансмембранным белком, но не бывшей в контакте с соединением-кандидатом, указывает на то, что соединение-кандидат взаимодействует с трансмембранным белком.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что определение измененного распределения в клетке обнаруживаемой части молекулы включает определение сниженного уровня содержания или повышенного уровня содержания обнаруживаемой части молекулы, ассоциированной с клеточной мембраной или находящейся в клеточном ядре.

9. Способ отбора соединения-кандидата по его способности взаимодействовать, по меньшей мере, с одним трансмембранным белком, включающий трансфекцию клетки, по меньшей мере, одной нуклеотидной последовательностью, кодирующей содержащий NLS трансмембранный белок и обеспечивающей экспрессию в клетке кодируемого белка; приведение клетки в контакт с соединением-кандидатом; определение уровня содержащего NLS трансмембранного белка, остающегося на клеточной мембране, путем выделения из клетки фракции клеточной мембраны, приведения фракции в контакт с меченым лигандом трансмембранного белка и определения уровня связывания лиганда с фракцией; причем определение измененного уровня трансмембранного белка на клеточной мембране по сравнению с его уровнем на клеточной мембране в контрольной клетке, не имевшей контакта с соединением-кандидатом, указывает на то, что соединение взаимодействует с трансмембранным белком.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что меченый лиганд представляет собой несущий радиоактивную метку лиганд и при этом трансмембранный белок дикого типа содержит NLS, или же трансмембранный белок дикого типа лишен NLS, и нуклеотидную последовательность, кодирующую трансмембранный белок, модифицируют так, чтобы она кодировала NLS, предпочтительно NLS, выбранную из таблицы 1 или из группы, состоящей из KKFKR (последовательность ID №158), PKKKRKV (последовательность ID №154) и AFSAKKFKR (последовательность ID №159).

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что клетка представляет собой прокариотическую клетку или эукариотическую клетку, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из клетки млекопитающего (предпочтительно выбранной из группы, состоящей из клеток НЕК, COS и СНО), дрожжевой клетки, клетки насекомого, клетки нематоды, клетки растения и клетки гриба.

12. Способ по любому из пп.9-11, отличающийся тем, что трансмембранный белок выбран из группы, состоящей из сопряженного с белком G рецептора (GPCR), предпочтительно рецептора дофамина D1, рецептора дофамина D2, рецептора дофамина D3, рецептора дофамина D5, рецептора гистамина-1, рецептора-1 цистеинил-лейкотриена, рецептора-2 цистеинил-лейкотриена, опиоидного рецептора, мускаринового рецептора, рецептора серотонина, бета2-адренергического рецептора и рецептора метаботропного глутамата-4; переносчика, предпочтительно переносчика дофамина или переносчика серотонина; рецептора цитокина, предпочтительно рецептора эритропоэтина или рецептора инсулина; тирозин-киназного рецептора, предпочтительно рецептора фактора роста эпидермиса или рецептора инсулина, и рецептора липопротеина низкой плотности (LDL).

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что клетку трансфицируют несколькими нуклеотидными последовательностями, причем каждая из указанных последовательностей кодирует белок, включающий свой трансмембранный белок, содержащий, по меньшей мере, одну NLS, при этом предпочтительно, чтобы каждая из указанных нуклеотидных последовательностей кодировала белок, содержащий свою обнаруживаемую часть молекулы, или чтобы, по меньшей мере, одна обнаруживаемая часть молекулы являлась одинаковой, по меньшей мере, для двух кодируемых белков.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что определение измененного распределения обнаруживаемой части молекулы представляет собой определение сниженного уровня содержания или повышенного уровня содержания обнаруживаемой части молекулы, ассоциированной с клеточной мембраной.

15. Изолированная клетка, трансфицированная, по меньшей мере, одной нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, включающий трансмембранный белок, содержащий, по меньшей мере, одну NLS и обнаруживаемую часть молекулы, для применения в способе по п.1.

16. Клетка по п.15, отличающаяся тем, что обнаруживаемой частью молекулы является обнаруживаемый пептид, включающий антигенную часть аминокислотной последовательности трансмембранного белка, и/или тем, что нуклеотидная последовательность кодирует слитый белок, включающий трансмембранный белок, содержащий, по меньшей мере, одну NLS и обнаруживаемую часть молекулы, и при этом трансмембранный белок дикого типа содержит NLS или же трансмембранный белок дикого типа лишен NLS, и нуклеотидную последовательность, кодирующую трансмембранный белок, модифицируют так, чтобы она кодировала NLS, предпочтительно NLS, выбранную из таблицы 1 или из группы, состоящей из KKFKR (последовательность ID №158), PKKKRKV (последовательность ID №154) и AFSAKKFKR (последовательность ID №159).

17. Клетка по п.15, отличающаяся тем, что обнаруживаемой частью молекулы является антигенный пептид, при этом распределение в клетке антигенного пептида определяют, давая ему возможность связываться с основанной на применении антител системой детектирования, содержащей антитела, специфичные к антигенному пептиду, предпочтительно с основанной на применении антител системе детектирования, которая содержит первичные антитела, специфичные к антигенному пептиду, и вторичные антитела, несущие обнаруживаемую метку и специфичные к первичным антителам, или с основанной на применении антител системе детектирования, которая содержит первичные антитела, специфичные к антигенному пептиду и несущие обнаруживаемую метку, предпочтительно обнаруживаемую оптическим способом метку и более предпочтительно люминесцентную метку или флуоресцентную метку, или же обнаруживаемой частью молекулы является полипептид, выбранный из группы, состоящей из зеленого флуоресцирующего белка, красного флуоресцирующего белка и их модифицированных вариантов.

18. Клетка по любому из пп.15-17, отличающаяся тем, что трансмембранный белок выбран из группы, состоящей из сопряженного с белком G рецептора (GPCR), предпочтительно рецептора дофамина D1, рецептора дофамина D2, рецептора дофамина D3, рецептора дофамина D5, рецептора гистамина-1, рецептора-1 цистеинил-лейкотриена, рецептора-2 цистеинил-лейкотриена, опиоидного рецептора, мускаринового рецептора, рецептора серотонина, бета2-адренергического рецептора и рецептора метаботропного глутамата-4; переносчика, предпочтительно переносчика дофамина или переносчика серотонина; рецептора цитокина, предпочтительно рецептора эритропоэтина или рецептора инсулина; тирозинкиназного рецептора, предпочтительно рецептора фактора роста эпидермиса или рецептора инсулина, и рецептора липопротеина низкой плотности (LDL).

19. Клетка по п.18, отличающаяся тем, что клетку трансфицируют несколькими нуклеотидными последовательностями, причем каждая из указанных последовательностей кодирует белок, включающий свой трансмембранный белок, содержащий, по меньшей мере, одну NLS, при этом предпочтительно, чтобы каждая из указанных нуклеотидных последовательностей кодировала белок, содержащий свою обнаруживаемую часть молекулы, или чтобы, по меньшей мере, одна обнаруживаемая часть молекулы являлась одинаковой, по меньшей мере, для двух кодируемых белков.

20. Клетка по п.19, отличающаяся тем, что клетка представляет собой прокариотическую клетку или эукариотическую клетку, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из клетки млекопитающего (предпочтительно выбранной из группы, состоящей из клеток НЕК, COS и СНО), дрожжевой клетки, клетки насекомого, клетки нематоды, клетки растения и клетки гриба.

21. Способ определения того, способны ли первый белок и второй белок олигомеризоваться, включающий трансфекцию клетки первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей содержащий NLS первый белок, и второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей содержащий обнаруживаемую часть молекулы второй белок и обеспечивающей экспрессию в клетке кодируемых первого и второго белка; определение распределения в клетке обнаруживаемой части молекулы, причем детектирование обнаруживаемой части молекулы в ядре или вблизи ядра или детектирование сниженного уровня содержания обнаруживаемой части молекулы на клеточной поверхности в сравнении с контрольной клеткой указывает на то, что первый и второй белки взаимодействуют, при этом первый и второй белки представляют собой разные трансмембранные белки, предпочтительно GPCR, или же первый и второй белки представляют собой один и тот же трансмембранный белок, или же один из первого и второго белков представляет собой трансмембранный белок, а другой не является трансмембранным белком.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что обнаруживаемой частью молекулы является обнаруживаемый пептид, включающий антигенную часть аминокислотной последовательности второго белка и/или тем, что вторая нуклеотидная последовательность кодирует слитый белок, содержащий второй белок и обнаруживаемую часть молекулы.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что первый белок дикого типа содержит NLS или же первый белок дикого типа лишен NLS, и первую нуклеотидную последовательность, кодирующую первый белок, модифицируют так, чтобы она кодировала NLS, предпочтительно NLS, выбранную из таблицы 1 или из группы, состоящей из KKFKR (последовательность ID №158), PKKKRKV (последовательность ID №154) и AFSAKKFKR (последовательность ID №159).

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что клетка представляет собой прокариотическую клетку или эукариотическую клетку, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из клетки млекопитающего (предпочтительно выбранной из группы, состоящей из клеток НЕК, COS и СНО), дрожжевой клетки, клетки насекомого, клетки нематоды, клетки растения и клетки гриба.

25. Способ по п.21, отличающийся тем, что обнаруживаемой частью молекулы является антигенный пептид и распределение в клетке антигенного пептида определяют, давая ему возможность связываться с основанной на применении антител системой детектирования, содержащей антитела, специфичные к антигенному пептиду, предпочтительно с основанной на применении антител системе детектирования, которая содержит первичные антитела, специфичные к антигенному пептиду, и вторичные антитела, несущие обнаруживаемую метку и специфичные к первичным антителам, или с основанной на применении антител системе детектирования, которая содержит первичные антитела, специфичные к антигенному пептиду и несущие обнаруживаемую метку, предпочтительно обнаруживаемую оптическим способом метку и более предпочтительно - люминесцентную метку или флуоресцентную метку, или же обнаруживаемой частью молекулы является полипептид, выбранный из группы, состоящей из зеленого флуоресцирующего белка, красного флуоресцирующего белка и их модифицированных вариантов.

26. Способ по любому из пп.21-25, отличающийся тем, что первый и второй белок - это трансмембранные белки, выбранные из группы, состоящей из сопряженного с белком G рецептора (GPCR), предпочтительно рецептора дофамина D1, рецептора дофамина D2, рецептора дофамина D3, рецептора дофамина D5, рецептора гистамина-1, рецептора-1 цистеинил-лейкотриена, рецептора-2 цистеинил-лейкотриена, опиоидного рецептора, мускаринового рецептора, рецептора серотонина, бета2-адренергического рецептора и рецептора метаботропного глутамата-4; переносчика, предпочтительно переносчика дофамина или переносчика серотонина; рецептора цитокина, предпочтительно рецептора эритропоэтина или рецептора инсулина; тирозинкиназного рецептора, предпочтительно рецептора фактора роста эпидермиса или рецептора инсулина, и рецептора липопротеина низкой плотности (LDL).

27. Способ по п.21, отличающийся тем, что первая нуклеотидная последовательность кодирует первый белок, содержащий обнаруживаемую часть молекулы, отличную от обнаруживаемой части молекулы во втором белке, при этом обнаружение взаимодействия с переносом энергии между обнаруживаемой частью молекулы первого белка и обнаруживаемой частью молекулы второго белка указывает на то, что первый и второй белки олигомеризуются.

Приоритет по пунктам:

12.04.2002 - пп.1-4, 6-8, 15-20;

13.05.2002 - пп.5, 21, 22, 24-27;

01.11.2002 - п.23;

11.04.2003 - пп.9-14.

Описание изобретения к патенту

Текст описания приведен в факсимильном виде.