способ получения трипаносомного антигена для серологической диагностики у животных

Формула изобретения

Способ получения трипаносомного антигена для серологической диагностики у животных, включающий подбор лабораторных животных, заражение возбудителем трипаносомоза лошадей, выделение трипаносом из крови путем центрифугирования при 3000 об/м - 10-15 мин, определение активности в РДСК, отличающийся тем, что полученную плазму, после отделения ее из крови и удаления осадка трипаносом, обрабатывают 20-25% раствором полиэтиленгликоля, взятого в равном объеме с плазмой крови; далее полученную смесь оставляют при комнатной температуре на 12-15 мин, повторно центрифугируют при 6000 об/м 15-20 мин, после чего надосадочную жидкость удаляют, а полученный осадок используют как трипаносомный экзоантиген в серологических реакциях, при этом активность его должна составлять 95-97%.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарной протозоологии, в частности к способам приготовления трипаносомного антигена для серологической диагностики у животных. Трипаносомозы - протозойные болезни животных и человека, протекающие остро и хронически, возбудителями которых являются различные виды рода Trypanosoma. Из этого рода на территории нашей страны распространены возбудители случной болезни однокопытных (T. equiperdum), сурры (Су-ауру) лошадей и верблюдов (Т. evansi).

От 30 до 50%, а иногда и больше заболевших лошадей погибает. Заболевания являются бичом коневодства, подрывая и парализуя работу хозяйств, т.к. поражают наиболее ценное племенное поголовье, чем наносят большой ущерб животноводству, складывающийся из высокой смертности заболевших животных, абортов у кобыл и потери воспроиводительной способности у жеребцов, снижения молочной и ухудшения мясной продуктивности, потери веса, расходов на борьбу с болезнью (убой больных и положительно реагирующих в РСК животных). Для ликвидации этих болезней, особенно случной болезни лошадей, требуется длительное время, затраты значительных средств и энергии.

По данным Международного эпизоотического бюро неблагополучны по случной болезни лошадей Ботсвана, Лесото, Намибия, ЮАР, Эфиопия, Китай, Иран, Пакистан, Киргизия, Узбекистан. В последние годы на территории России в 16 административных округах отмечены случаи случной болезни. Все лошади, экспортируемые из этих стран, по международным правилам подлежат обязательному исследованию на случную болезнь.

Мировая практика борьбы с трипаносомозами показала, что наиболее эффективным способом является убой больных и положительно реагирующих в РСК животных. Лечение дает временный положительный эффект и не позволяет искоренить болезнь. В связи с этим разработка и внедрение новых способов изготовления диагностикумов трипаносомозов является весьма актуальной проблемой.

Известен способ приготовления трипаносомных диагностикумов, представляющий собой выделение T. equiperdum или Т. evansi из крови зараженных мышей или крыс с последующей 2-3-кратной отмывкой их с помощью центрифугирования, разрушения путем 2-3-кратного замораживания и оттаивания, концентрированием полученного материала и титрацией его в РДСК с положительными и отрицательными сыворотками. Таким образом получают соматический трипаносомный антиген для серологической диагностики в РДСК случной болезни и сурры (Су-ауру) лошадей во всем мире. Плазму крови зараженных животных, которая образуется после первого центрифугирования, выбрасывают, а из осадка после соответствующей обработки готовят соматический антиген. Прототип. [2].

Известен также способ приготовления экзогенного токсоплазменного антигена из перитонеального экссудата белых мышей, зараженных эталонным штаммом токсоплазм (RZ) или одним из вирулентных штаммов, выделенных от сельскохозяйственных животных.

Собранный перитонеальный экссудат, содержащий токсоплазмы, центрифугировали в стерильных пробирках в течение 30-45 минут при 3000-4000 об/ мин. Полученный осадок удаляли, а перитонеальный экссудат, содержащий экскреты-секреты токсоплазм, подвергали дальнейшей очистке и концентрации и использовали в качестве антигена.

Автором доказана высокая эффективность и специфичность антител выявляемого при иммуноферментном анализе при постановке его с экзогенным антигеном для ранней прижизненной диагностики токсоплазмоза животных [1].

В задачу наших исследований входила разработка нового способа приготовления антигеноспецифического, высокоактивного и дешевого в изготовлении трипаносомного антигена для серологической диагностики у животных.

Предложенный способ приготовления трипаносомного антигена состоит в следующем: мышей или крыс, зараженных T. equiperdum или Т. evansi, обескровливают с добавлением в пробирки 20%-ного раствора цитрата натрия. Собранную кровь центрифугируют в течение 10-15 минут при 3000 об/мин. Полученную плазму собирают в стерильные пробирки. Осадок трипаносом удаляют для приготовления соматического антигена. Далее из плазмы крови выделяют экзогенные антигены посредством осаждения в 20-25%-ном растворе полиэтиленгликоля. Для этого смешивают равные объемы полиэтиленгликоля с плазмой крови мышей, крыс, после чего полученную смесь оставляют при комнатной температуре на 12-15 мин, повторно центрифугируют при 6000 об/мин 15-20 мин, затем надосадочную жидкость удаляют, а полученный осадок используют как трипаносомный зкзоантиген в серологических реакциях. Активность антигена в РДСК должна составлять 95-97%.

Трипаносомный антиген, приготовленный предложенным способом, испытан на специфичность и чувствительность в РСК (РДСК) с сыворотками крови от лошадей, зараженных случной болезнью, суррой (Су-ауру), нутталлиозом, сапом, ИНАН, ринопневмонией, вирусным артериитом, а также от здоровых лошадей, мышей и собак.

Ни в одном случае эти сыворотки, кроме сывороток от зараженных случной болезнью и суррой животных, не реагировали с растворимыми антигенами T. equiperdum и Т. evansi.

Трипаносомный антиген, приготовленный предложенным способом, испытан на чувствительность сравнительно с соматическим антигеном, изготовленным традиционным способом. Сравнительное испытание трипаносомного экзоантигена, приготовленного предложенным способом, отражено в конкретных примерах (Табл.1 и 2).

Таблица 1
Результаты титрования экзогенного и соматического антигенов Trypanosoma evansi в РДСК
Происхождение сыворотки	Разведение экзогенного антигена						Разведение соматического антигена						БА
	1:4	1:8	1:1	1:3	1:6	1:1	1:4	1:8	1:1	1:3	1:6	1:1
			6	2	4	28			6	2	4	28
Фабричная (Омская) №1 от лошади, зараженной T. equiperdum	4+	4+	4+	4+	3+	2+	4+	4+	4+	4+	3+	2+	-
От кролика, зараженного Т. evansi	4+	4+	4+	4+	4+	3+	4+	4+	4+	4+	3+	3+	-
От лошади, зараженной Т. evansi из Китая	4+	4+	4+	4+	4+	2+	4+	4+	4+	4+	4+	2+	-
От лошади, зараженной Т. evansi из ЮАР	4+	4+	4+	4+	3+	2+	4+	4+	4+	4+	3+	2+	-
От здоровой лошади	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
От здоровой лошади	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
От лошади, переболевшей сапом	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
От лошади, переболевшей нутталлиозом	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
От лошади, переболевшей ИНАНом	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
От лошади, переболевшей ринопневмонией	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
От лошади, переболевшей вирусным артериитом	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
От лошади, зараженной T. equiperdum, Армавир 1	4+	4+	4+	4+	4+	3+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	-
От лошади, зараженной T. equiperdum, Армавир 2	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	4+	3+	-

Таблица 2

Результаты титрования экзогенного и соматического Trypanosoma eguiperdum в РДСК

Происхождение сыворотки

Разведение экзогенного антигена

Разведение соматического антигена

БА

1:4

1:8

1:1 6

1:3 2

1:6 4

1:1 28

1:4

1:8

1:1 6

1:3 2

1:6 4

1:1 28

Фабричная (Омская) №1 от лошади, зараженной T. equiperdum

4+

4+

4+

4+

3+

2+

4+

4+

4+

4+

3+

2+

-

От кролика, зараженного Т. evansi

4+

4+

4+

4+

4+

3+

4+

4+

4+

4+

3+

3+

-

От лошади, зараженной Т. evansi из Китая

4+

4+

4+

4+

4+

2+

4+

4+

4+

4+

4+

2+

-

От лошади, зараженной Т. evansi из ЮАР

4+

4+

4+

4+

3+

2+

4+

4+

4+

4+

3+

2+

-

От здоровой лошади

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

От здоровой лошади

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

От лошади, переболевшей сапом

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

От лошади, переболевшей нутталлиозом

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

От лошади, переболевшей ИНАНом

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

От лошади, переболевшей ринопневмонией

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

От лошади, переболевшей вирусным артериитом

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

От лошади, зараженной T. equiperdum, Армавир 1

4+

4+

4+

4+

4+

3+

4+

4+

4+

4+

4+

4+

-

От лошади, зараженной T. equiperdum, Армавир 2

4+

4+

4+

4+

4+

4+

4+

4+

4+

4+

4+

3+

-

Из приведенных таблиц видно, что предложенный трипаносомный экзоантиген является специфичным, высокоактивным и не требует больших затрат, поскольку в качестве исходного сырья берут ранее выбрасываемую плазму крови.

Предложенный способ получения антигена апробирован нами с положительным результатом в лабораторных условиях ВИЭВ 1998-2005 г.

Предложенный способ получения антигена найдет применение в вет. лабораториях, занимающихся диагностикой инфекционных и протозойных болезней животных и тем самым позволит своевременно выявить больных животных и принять экстренные меры по ликвидации данных инвазий.

Способ найдет применение при экспорте племенных лошадей на международных аукционах, спортивных и развлекательных мероприятиях.

Источники информации

1. Автореферат канд. дисс. Ефремова Н.А. Антиген для иммуноферментного анализа при диагностике токсоплазмоза животных. Республика Казахстан, Алма-Аты, 1998, с.10-12.

2. Office International des Epizooties. Mannual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines 2000. Chapter 2.5.2 /Dourine, p.528-531/