способы лечения и/или подавления прироста массы

Формула изобретения

1. Соединение, имеющее следующую общую формулу:

2. Соединение по п.1, используемое в качестве селективного модулятора рецептора эстрогена.

3. Соединение по п.1, используемое для лечения или снижения риска возникновения инсулинорезистентности.

4. Фармацевтическая композиция для селективной модуляции рецептора эстрогена, включающая фармацевтический наполнитель, разбавитель или носитель и терапевтически эффективное количество ЕМ-652-HCl

5. Композиция по п.4, используемая для лечения или снижения риска возникновения инсулинорезистентности.

Описание изобретения к патенту

Эта заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США No. 60/142407, поданной 6 июля 1999.

Область техники

Данное изобретение относится к способу лечения и/или профилактики ожирения (особенно абдоминального ожирения) и к способу лечения или подавления супрессии приобретения аномальной инсулинорезистентности у восприимчивых теплокровных животных, включая людей. Способы включают введение соединений общей формулы 1, приводимой ниже, или фармацевтических композиций на их основе. В других вариантах осуществления способы включают введение селективного модулятора рецептора эстрогена ("СМРЭ", "SERM") в сочетании с предшественником полового стероидного гормона.

Предшествующий уровень техники

Ожирение, состояние, характеризуемое избыточной жировой массой тела, представляет общеизвестный фактор риска для развития многих заболеваний, таких как сердечно-сосудистые заболевания, гипертензия, диабет и рак молочной железы. Кроме того, персональный внешний вид составляет существенную часть комфортного благополучия большинства людей.

Обычными способами лечения ожирения, такими как разнообразные диеты (включая диеты с ограничением в питании), программы, обеспечивающие потерю излишней массы, и физическая нагрузка, для многих людей удается достичь успеха с разной степенью конечного результата. Однако остается потребность в других способах для тех, кто испытывает неудовлетворенность в результатах при использовании способов (лечения) предшествующего уровня техники, или способах, используемых в качестве дополнения к способам предшествующего уровня техники.

За последнее время для лечения или профилактики ожирения были предложены некоторые агонисты/антагонисты эстрогена: Ралоксифен (Raloxifene) и родственные соединения в европейской патентной заявке № 0659423А1; агонисты эстрогена, имеющие бензотиофеновое ядро, в европейской патентной заявке № 0716855А2; 3,4-дифенилхроманы в международной заявке № PCT/DK96/00011; агонист/антагонист нафтилэстрогена в международной заявке № PCT/IB95/00286.

Сообщалось также, что Тамоксифен (Tamoxifen), другой агонист/антагонист эстрогена, предотвращает увеличение массы тела, индуцированное сульпиридом, у крыс-самок (Baptista et al., Pharmacol., Biochem. Behav. (1997), 57(1/2), 215-222). Кроме того, сообщалось, что тамоксифен имитирует действие эстрадиола на потребление корма, массу тела и структуру тела у крыс (Wade et al., American Journal of Physiology 1993, 33(6), R1219-1223).

Кроме того, ДГЭА (DHEA) оказывает полезное действие при лечении и/или для профилактики ожирения. У взрослых крыс Sprague-Dawley, Шварц (см. Kent, Geriatrics 37: 157-160, 1982) наблюдал уменьшение массы тела с 600 до 550 г под действием ДГЭА без влияния потребления пищи. Шварц (Cancer 39: 1129-1132, 1979) наблюдал, что мыши линии С3Н, получавшие ДГЭА (450 мг/кг, 3 раза в неделю), прибавляют в весе значительно меньше и стареют быстрее, чем контрольные животные, и имеют меньше жира и более активны. Уменьшение массы тела достигалось без потери аппетита или ограничения пищи. Кроме того, ДГЭА может предотвратить прирост массы тела у животных, имеющих склонность к ожирению в зрелом возрасте (см. Kent, Geriatrics 37:157-160, 1982).

Введение ДГЭА тощим крысам Zucher приводило к уменьшению массы тела, несмотря на увеличение приема пищи. Животные, подвергнутые лечению, имели меньшие жировые прослойки, в целом, тем самым указывая на то, что ДГЭА увеличивает пищевой метаболизм, что приводит к меньшему приросту массы тела и уменьшению накопления жира (Svec et al., Proc. 2^nd Int. Conf. Cortisol and Anti-Cortisols, Las Vegas, Nevada, USA, p. 56 abst., 1997).

Было установлено, что ожирение приостанавливается у А^vy мутантной мыши (Yen et al., Lipids 12: 409-413, 1977) и у крысы Zucker (Cleary and Zisk, Fed. Proc. 42: 536, 1983). Мыши линии СЗН, подвергнутые лечению ДГЭА, выглядели моложе, чем контрольные (Schwartz, Cancer Res. 39: 1129-1132, 1979).

Абдоминальный жир ассоциируется с метаболическими факторами риска развития коронарной болезни молочной железы (Imbault et al. Metabolism 1999, 48 (3), 355 - 62; Ledoux et al. (CMAJ 1997, 157 Suppl. 1; 46-53).

Сущность изобретения

Соответственно, цель данного изобретения состоит в обеспечении уменьшения жировой ткани, в частности абдоминального жира.

Другая цель данного изобретения заключается в достижении уменьшения риска развития коронарной болезни сердца и других заболеваний и состояний, для которых развитие ожирения и появление превышающей норму жировой ткани являются факторами риска.

В одном варианте осуществления данное изобретение заключается в разработке нового способа лечения или подавления прироста массы тела у восприимчивых теплокровных животных, включая людей, и этот указанный способ включает введение субъекту, при необходимости такого лечения или подавления, терапевтически эффективного количества, с или без фармацевтического разбавителя или носителя, по крайней мере, одного соединения общей формулы I:

где R₁ и R ₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, гидроксила, -ОМ (причем М выбран из группы, состоящей из прямого или разветвленного C₁-C ₄ алкила, прямого или разветвленного С₃ - С₄ алкенила, прямого или разветвленного С₃ - С₄ алкинила) и части, превращаемой in vivo в гидроксил, где G представляет -Н или -СН₃; и где R₃ обозначает тип (заместителя), выбранный из группы, состоящей из пирролидинила, пиперидино, морфолино и NRaRb (причем Ra и Rb представляют, независимо, водород, прямой или разветвленный C₁-C₆ алкил, прямой или разветвленный С₃ - С ₆ алкенил и прямой или разветвленный С₃ - С₆ алкинил).

Способ лечения или подавления развития ожирения, включающий введение субъекту, при необходимости такого лечения или подавления, терапевтически эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли нижеследующей общей формулы:

где R₁ и R ₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, гидроксила, -ОМ (причем М выбран из группы, состоящей из прямого или разветвленного C₁-C ₄ алкила, прямого или разветвленного С₃ - С₄ алкенила, прямого или разветвленного С₃ - С₄ алкинила) и части, превращаемой in vivo в гидроксил, где G представляет -Н или -СН₃; и где R₃ обозначает заместитель, выбранный из группы, состоящей из пирролидинила, пиперидино, морфолино и NRaRb (причем Ra и Rb представляют, независимо, водород, прямой или разветвленный C₁-C ₆ алкил, прямой или разветвленный С₃ - С₆ алкенил и прямой или разветвленный С₃ - С₆ алкинил), где R₁ или R₂ не являются пивалоилокси группой.

В другом варианте осуществления селективный модулятор рецептора экстрогена или его фармацевтически приемлемую соль вводят для уменьшения абдоминального жира или уменьшения накопления абдоминального жира.

В другом варианте осуществления для лечения ожирения или подавления прироста массы помимо селективного модулятора рецептора эстрогена (СМРЭ, SERM) вводят предшественник полового стероидного гормона (например, дегидроэпиандростерон, дегидроэпиандростерон сульфат, андрост-5-ен-3b, 17b-диол). Человек, в возрасте пятидесяти или свыше лет, как полагают, хорошо реагирует на комбинированную терапию, вероятно из-за того, что уровни предшественника имеют тенденцию с возрастом нежелательно снижаться.

Таким образом, в данном аспекте, изобретение обеспечивает способ лечения или подавления прироста массы, включающий введение субъекту, при необходимости такого подавления или лечения, терапевтически эффективного количества, с или без фармацевтического разбавителя или носителя, по крайней мере, одного СМРЭ (SERM) и эффективного количества, по крайней мере, одного предшественника полового стероидного гормона, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростерон сульфата, андрост-5-ен-3b, 17b-диола и соединений, превращаемых in vivo в любой из упомянутых выше предшественников.

В другом аспекте изобретение обеспечивает способ лечения или уменьшения риска развития инсулинорезистентности, включающий введение субъекту, при необходимости такого лечения или уменьшения, терапевтически эффективного количества, по крайней мере, одного СМРЭ. В некоторых вариантах осуществления изобретения в качестве части комбинированной терапии вводят также эффективное количество, по крайней мере, одного предшественника полового стероидного гормона, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростерон сульфата, андрост-5-ен-3b, 17b-диола и соединений, превращаемых in vivo в тот или другой из них.

В другом аспекте, изобретение обеспечивает набор для лечения ожирения, имеющий первый контейнер, который включает, по крайней мере, один СМРЭ, и второй контейнер, который включает, по крайней мере, один предшественник полового стероидного гормона, выбранный из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростерон сульфата, андрост-5-ен-3b, 17b-диола и соединений, превращаемых in vivo в тот или другой.

Кроме того, в одном или нескольких контейнерах может быть предусмотрен фармацевтический наполнитель, носитель или разбавитель и они могут включать консерванты и другие добавки, известные в данной области. Вышеупомянутые вспомогательные вещества могут быть включены с любым активным компонентом, используемым в любом варианте воплощения описанных здесь различных изобретений.

Используемый здесь селективный модулятор рецептора эстрогена (СМРЭ, SERM) представляет соединение, которое либо непосредственно, либо через свой активный метаболит функционирует как антагонист рецептора эстрогена ("антиэстроген") в ткани молочной железы, кроме этого, это соединение оказывает эстрогенподобное действие на жир тела, на костную ткань и на уровни холестерина в сыворотке (т.е. уменьшая сывороточный холестерин). Нестероидальные соединения, которые функционируют как антагонисты рецептора эстрогена in vitro либо в ткани молочной железы человека, либо в ткани молочной железы крысы (в частности, если соединение действует как антиэстроген на человеческие клетки рака молочной железы), вероятно, функционируют как СМРЭ (SERM). К нестероидным антиэстрогенам, которые были испытаны и, как было установлено, функционируют как СМРЭы (SERMs), относятся ЕМ-800, ЕМ-652, ЕМ-652. HCl (ЕМ-01538), Ра-локсифен, Тамоксифен, Идоксифен, Торимефен, LY 353381, LY 335563, GW 5638 и Дролоксифен (описанные ниже более подробно). СМРЭы (SERMs), в соответствии с любым вариантом воплощения изобретения, предпочтительно вводят при той же самой дозе, как это известно в области применения этих соединений в качестве антиэстрогенов.

Не вдаваясь в теоретические рассуждения, считается, что СМРЭы (SERMs), многие из которых предпочтительно имеют два ароматических кольца, связанные одним-двумя углеродными атомами, предположительно взаимодействуют с рецептором эстрогена посредством вышеупомянутой части молекулы, которая лучше всего распознается рецептором. Кроме того, такие СМРЭы имеют боковые цепи, которые могут селективно проявлять антагонистические свойства в ткани молочной железы и внутриматочной ткани без проявления существенных антагонистических свойств в других тканях, в частности костной. Таким образом, СМРЭы могут функционировать, в соответствии с желанием, как антиэстрогены в молочной железе и эндометрии, проявляя при этом неожиданно и в соответствии с желанием эстрогенподобную активность по отношению к жиру тела.

Кроме того, изобретение включает, в соответствии с желанием, подавление дополнительного прироста массы тела или, в соответствии с желанием, обеспечение уменьшения массы тела, даже если при этом масса, отвечающая норме, не достигается.

Используемый здесь термин ожирение подразумевает избыток жировой ткани, который ведет к увеличению массы тела. Способы профилактики и лечения согласно изобретению включают ингибирование прироста массы тела и индуцирование потери массы тела. Изобретение включает лечение тучных людей, уменьшая их массу до (и поддерживая массу при) отвечающего норме значения. Кроме того, изобретение включает профилактику ожирения для людей, которые являются восприимчивыми к развитию такого заболевания. Пациентами, заинтересованными в данном изобретении, являются те, которые имеют избыточную массу тела (по сравнению с установленными в медицине нормами) или люди с повышенным риском приобрести избыточную массу тела.

Кроме того, в соответствии с изобретением СМРЭ может быть использован для понижения уровней триглицеридов в крови. Например, предполагается, что ЕМ-800 (описанный здесь) является эффективным для этой цели.

В другом варианте воплощения для осуществления изобретения разработаны новые соединения и фармацевтические композиции на их основе.

Пациентом, нуждающимся в таком лечении или снижении риска возникновения указанного заболевания или состояния, является тот, у кого либо диагностировано такое заболевание, либо тот, кто является предрасположенным к развитию такого заболевания. Изобретение, в частности, полезно для индивидуумов, которые вследствие наследственности, факторов окружающей среды или другого признанного фактора риска имеют более высокий риск приобрести состояния, к которым имеет отношение данное изобретение, чем население в целом.

За исключением тех случаев, где оговорено особо, предпочтительная доза активных соединений данного изобретения идентична как для применения в терапевтических целях, так и профилактических. Доза каждого активного компонента, обсуждаемого здесь, является тождественной, независимо от заболевания, подлежащего лечению (или профилактике).

В тех случаях когда рассматриваются два или несколько различных активных средств как часть комбинированной терапии (например, ингибитор фермента и антиандроген), применяют множество различных соединений, а не одно соединение, имеющее разнообразные активности.

Если не оговорено особо, термин "соединение" и любая ассоциированная молекулярная структура могут включать любые возможные его стереоизомеры в форме рацемической смеси или в оптически активной форме.

Если не оговорено особо или там, где очевидно из контекста, дозы, указанные здесь, относятся к массе активных соединений, не включая фармацевтические наполнители, разбавители, носители или другие компоненты, хотя такие дополнительные компоненты включаются, в соответствии с желанием, как показано в прилагаемых примерах. Любая лекарственная форма (капсула, таблетка, инъекция или т.п.), обычно используемая в фармацевтической промышленности, пригодна для использования здесь, а термины "наполнитель", "разбавитель" или "носитель" включают такие неактивные компоненты, которые обычно входят, наряду с активными компонентами, в состав таких лекарственных форм в промышленности. Например, используют обычные капсулы, пилюли, энтерально - активные покрытия, твердые или жидкие разбавители или наполнители, ароматизаторы, консерванты или т.п.

В некоторых вариантах воплощения используют пролекарства активных компонентов, обсуждаемых здесь (т.е. соединения, которые превращаются in vivo в активные компоненты). Как известно в фармацевтической промышленности, многие функциональные группы превращаются in vivo в функциональные группы активных соединений, дискутируемых здесь. Смотри, например, Chapter 5 "Design and Application of Prodrugs", A Textbook of Drug Design & Development, Bundgaard & Larsen, Ed., Harwood Academic Publishers GmbH (Chur, Switzerland, 1991). Пролекарства зачастую могут обеспечить лучшую биологическую доступность, устойчивость при хранении и/или легкость получения соответствующих активных соединений.

Все активные компоненты, используемые в любой из обсуждаемых здесь терапий, могут быть включены в рецептуру фармацевтических композиций, которые, кроме этого, содержат один или несколько других активных компонентов. Альтернативно, они могут быть введены, каждый, раздельно, но по возможности одновременно так, чтобы пациент, в конечном счете, имел повышенные уровни каждого активного компонента в крови или получил пользу в другом отношении от каждого из активных компонентов (или стратегий) одновременно. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения изобретения, например, один или несколько активных компонентов должны быть объединены в рецептуру одной фармацевтической композиции. В других вариантах воплощения изобретения обеспечивается набор, который включает, по крайней мере, два отдельных контейнера, где содержимое, по крайней мере, двух отдельных контейнеров, где содержимое, по крайней мере, одного контейнера отличается, полностью или частично, от содержимого, по крайней мере, одного другого контейнера в отношении активных компонентов, содержащихся в них. В комбинированных терапиях изобретения используют два или несколько различных контейнеров. Комбинированные терапии, изложенные здесь, также включают использование одного активного компонента комбинации для получения лекарственного средства для лечения (или профилактики) рассматриваемого заболевания, и это лечение или профилактика, кроме этого, включает другой активный компонент или стратегию комбинации.

Абдоминальный жир считается отличным от общего ожирения тела, и он может иметь место при отсутствии ожирения. Кроме того, считают, что абдоминальный жир представляет более высокий фактор риска для возникновения заболевания сердца. Абдоминальный жир положительно реагирует на данное изобретение.

Предпочтительные СМРЭы изобретения, например, СМРЭы вышеуказанной формулы I, не оказывают нежелательных эстрогенных действий в эндометрии, очень важное улучшение по сравнению с терапиями с участием СМРЭ, используемыми в некоторых способах предшествующего уровня техники.

СМРЭы, используемые в изобретении, как полагают, благоприятным образом понижают уровни триглицеридов в крови и, к тому же, инсулинорезистентность.

В предпочтительных вариантах воплощения изобретения, обсуждаемых здесь, действие СМРЭ усиливается ДГЭА или подобным предшественником полового стероидного гормона.

Не вникая в подробности теоретического разъяснения, в основе одного из объяснений синергического действия, получаемого при комбинировании СМРЭов и предшественников, могут лежать, по крайней мере, частичные различия в их механизмах действия.

Например, ДГЭА, по-видимому, повышает пищевой обмен, не подавляя аппетит. ЕМ-652.HCl, СМРЭ, вероятно, подавляет потребление пищи.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Показывает действие 35-недельного лечения в зависимости от увеличения доз (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1 мг/кг, перорально, один раз в день) СМРЭов ЕМ-800, ралоксифена, тамоксифена и неактивного энантиомера, ЕМ-776 (энантиомер ЕМ-800) на содержание общего жира у овариэктомированной крысы. Данные выражены как среднее ± SEM (стандартная ошибка средней). **: Р < 0,01 эксперимент против соответствующего контроля.

Фиг. 2. Показывает действие 20-дневного лечения на прирост массы тела (А), увеличение белка (В) и увеличение жира (С) у интактных крыс; овариэктомированных крыс; овариэктомированных крыс, подвергнутых лечению СМРЭ ЕМ-652.HCl или эстра-диолом. Данные выражены в граммах (г) как среднее ± SEM. * р < 0,05 против интактной группы; + р < 0,05 против OVX + Е ₂ группа (для ЕМ-652.HCl группы только).

Фиг. 3. Показывает действие 20-дневного лечения на суммарное потребление корма для интактных крыс, овариэктомированных крыс и овариэктомированных крыс, подвергнутых лечению ЕМ - 652. HCl или эстрадиолом. Данные выражены в граммах (г).

Фиг. 4. Показывает действие 20-дневного лечения на энергию тела (организма) в виде белков (А) и энергию тела в виде жира (В) для интактных крыс, овариэктомированных крыс и овариэктомированных крыс, подвергнутых лечению ЕМ-652.HCl или эстрадиолом. Данные выражены в килоджоулях (кДж, Kj) как среднее ± SEM. * р < 0,05 против интактной группы; +р < 0,05 против OVX + Е₂ группа (для только ЕМ-652.HCl группы).

Фиг. 5. Демонстрирует действие 20-дневного лечения на уровни сывороточного инсулина и уровни сывороточной глюкозы для интактных крыс; овариэктомированных крыс и овариэктомированных крыс, подвергнутых лечению ЕМ-652.HCl или эстрадиолом. Данные выражены в нмоль/л как среднее ± SEM. *р < 0/05 против интактной группы.

Фиг. 6. Демонстрирует действие 20-дневного лечения на характеристики белой жировой ткани: масса паховой (А) и забрюшинной (С) жировой ткани (данные выражены в граммах (г) как среднее ± SEM); активность липопротеинлипазы паховой (В) и забрюшинной (D) белой жировой ткани (данные выражены в мкЕ/г белка как среднее ± SEM; * р < 0, 05 против интактной группы; + р < 0,05 против OVX + Е₂ группы (только для ЕМ-652.HCl группы), для интактных крыс; овариэктомированных крыс и овариэктомированных крыс, подвергнутых лечению ЕМ-652.HCl или эстрадислом.

Фиг. 7. Демонстрирует действие 20-дневного лечения на характеристики межлопаточной бурой жировой ткани (бурый жир): (А) масса бурой жировой ткани (данные выражены в граммах (г) как среднее ± SEM, * р < 0,05 против интактной группы; + р < 0,05 против OVX + E₂ группы (только для ЕМ-652.HCl группы); (В) содержание белка (данные выражены в % массы ткани как среднее ± SEM; * р < 0,05 против интактной группы; + р < 0,05 против OVX + E ₂ группы (только для ЕМ-652.HCl группы) и (С) активность липопротеинлипазы (данные выражены в мкЕ/г белка).

Фиг. 8. Демонстрирует действие 20-дневного лечения на массу камбаловидной мышцы (данные выражены в граммах (г) как среднее ± SEM) и липопротеинлипазу (данные выражены в мкЕ/г белка как среднее ± SEM; * р < 0,05 против интактной группы); для интактных крыс, овариэктомированных крыс и овариэктомированных крыс, подвергнутых лечению эстрадиолом и ЕМ-652.HCl.

Подробное описание изобретения

Предпочтительно введение фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или носитель и терапевтически эффективное количество селективного модулятора рецептора эстрогена, имеющего нижеследующую общую формулу I:

где R₁ и R ₂ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, гидроксила, -ОМ (причем М выбран из группы, состоящей из прямого или разветвленного C₁-C ₄ алкила, прямого или разветвленного С₃ - С₄ алкенила, прямого или разветвленного С₃ - С₄ алкинила) и части, превращаемой in vivo в гидроксил; где G представляет -Н или -СН₃; где R₃ обозначает тип (заместителя), выбранный из группы, состоящей из пирролидинила, пиперидино, морфолино и NRaRb (причем Ra и Rb представляют, независимо, водород, прямой или разветвленный C₁-C₆ алкил, прямой или разветвленный С₃ - С ₆ алкенил и прямой или разветвленный С₃ - С₆ алкинил), и предшественник полового стероидного гормона, выбранного из группы, состоящей из дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростерон сульфата, андрост-5-ен-3b, 17b-диола и соединений, превращаемых in vivo в тот или другой.

СМРЭ вышеупомянутой формулы I обеспечивает неожиданное преимущество, заключающееся в небольшом или полном отсутствии эстрогенного действия на эндометрий, в отличие от СМРЭов, известных из предшествующего уровня техники.

Предпочтительно, чтобы СМРЭ изобретения представлял оптически активное соединение и содержал больше, чем 50% стереоизомера, имеющего абсолютную конфигурацию S на углероде 2.

Кроме того, по причинам стабильности и растворимости в воде (биологическая доступность) предпочтительно, чтобы СМРЭ изобретения представлял соль соединения формулы I и кислоты, выбранной из группы, состоящей из уксусной кислоты, адипиновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, бензойной кислоты, камфорсульфоновой кислоты, лимонной кислоты, фумаровой кислоты, иодисто-водородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, хлористо-водородной кислоты, гидрохлортиазидиновой кислоты, гидроксинафтойной кислоты, молочной кислоты, малеиновой кислоты, метансульфоновой кислоты, метилсерной кислоты, 1,5-нафталиндисульфоновой кислоты, азотной кислоты, пальмитиновой кислоты, пивалиновой кислоты, фосфорной кислоты, пропионовой кислоты, янтарной кислоты, серной кислоты, винной кислоты, терефталевой кислоты, п-толуолсульфокислоты и валериановой кислоты.

Одним предпочтительным соединением изобретения является ЕМ-800, раскрытое в РСТ/СА96/00097 (WO 96/26201). Структура молекулы ЕМ-800 представляет:

Другим более предпочтительным соединением изобретения является ЕМ-652.HCl (также называемый ЕМ-01538):

ЕМ-652.HCl обеспечивает дополнительные преимущества по сравнению с другими СМРЭами, такими как ЕМ-800, потому что он не содержит пивалоильных групп, которые могут повысить риск, связанный с уменьшением уровней сывороточного карнитина.

Другие предпочтительные СМРЭы изобретения включают Тамоксифен ((Z)-2-[4-(1,2-дифенил-1-бутенил)]-N,N-диметилэтанамин) (доступный от Zeneca, UK), Торемифен (доступный от Orion-Farmos Pharmaceutical, Finland, or Schering-Plough), Дролоксифен и СР-336156 (цис-1R-[4'-пирролидино-этоксифенил]-23-фенил-6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидронафталин D-(-)-тартратная соль) (Pfizer Inc., USA, описанная в патенте США 5889042) (также называемая Ласофоксифен), Ралоксифен (Eli Lilly and Co., USA), LY 335563 и LY 353381 (Eli Lilly and Co., USA, описанные в международных публикациях WO 98/45287, WO 98/45288 и WO 98/45286), Идоксифен (SmithKline Beecham, USA), Левормелоксифен (3,4-транс-2,2-диметил-3-фенил-4-[4-(2-(2-(пирролидин-1-ил)этокси)фенил]-7-метоксихроман) (Novo Nordisk, A/S, Denmark), который описан Shalmi et al. в международных публикациях WO 97/25034, WO 97/25035, WO 97/25037, WO 97/25038; и Korsgaard et al. WO 97/25036), GW5638 (описан Willson at al., Endocrinology, 138(9), 3901-3911, 1997) и производные индола (раскрытые Miller et al. ЕР 0802183А1) и TSE 424 и ERA 923, разработанные Wyeth Ayerst (США) и раскрытые в патенте Японии 10036347 (American home products corporation) и нестероидальные производные эстрогена, описанные в WO 97/32837. Другие СМРЭы изобретения изложены в: WO 99/07377; WO 98/48806; ЕР 0823437А2; ЕР 0838464А1; ЕР 0835867А1, ЕР 0835868А1; ЕР 0792641А1; ЕР 0873992А1 и ЕР 0895989А1.

Можно использовать любой СМРЭ, когда требуется достичь эффективности (как рекомендовано производителем для лечения и/или профилактики остеопороза или рака молочной железы). Соответствующие дозы известны в данной области. Согласно изобретению может быть использован любой другой коммерчески доступный нестероидный антиэстроген. Может быть использовано любое соединение, имеющее активность, подобную СМРЭам (например, Ралоксифен).

СМРЭы, применяемые в соответствии с изобретением, предпочтительно вводят в диапазоне доз от 0,01 до 10 мг/кг массы тела в день (предпочтительно от 0,05 до 1,0 мг/кг), причем при пероральном введении для человека средней массы тела предпочтительно 60 мг в день, особенно 20 мг в день, или в диапазоне доз от 0,003 до 3,0 мг/кг массы тела в день (предпочтительно от 0,015 до 0,3 мг/кг массы тела), причем 20 мг в день, особенно 10 мг в день, предпочтительно для человека средней массы тела при парентеральном введении (т.е., внутримышечном, подкожном или чрескожном введении). Предпочтительно СМРЭы вводят вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем, как изложено ниже.

Предпочтительными предшественниками половых стероидных гормонов являются дегидроэпиандростерон (ДГЭА, DHEA) (доступный от Diosynth Inc., Chicago, Illinois, USA), его пролекарства (доступные от Steraloids, Wilton, New Hampshire, USA), 5-андростен-3b, 17b-диол и его пролекарства, андрост -5-ен-3b, 17b-диол 3-ацетат и андрост-5-ен-3b,17b-диол дигемисукцинат (доступные от Steraloids, Wilton, New Hampshire USA).

Предшественник полового стероидного гормона может быть представлен в виде спиртового геля, содержащего от 2,0 до 10% триглицерида каприловой - каприновой кислот (Neobee M-5); от 10 до 20% гексиленгликоля; от 2,0 до 10% диэтиленгликоль монометилового эфира (Transutol); от 2,0 до 10% Циклометикона (Dow Corning 345); от 1,0 до 2% бензилового спирта и от 1,0 до 5,0% гидроксипрогтолцеллюлозы (Klucel HF).

Кроме того, носитель (для либо СМРЭ, либо предшественника) может включать различные добавки, обычно используемые в фармацевтической промышленности. Например, могут присутствовать ароматизирующие вещества, антиоксиданты, отдушки, желирующие вещества, загустители, такие как карбоксиметилцеллюлоза, поверхностно-активные вещества, стабилизаторы, средства для смягчения, красители и другие подобные средства. Когда активные компоненты вводят трансдермально, место нанесения на кожу следует менять для того, чтобы избежать избыточной локальной концентрации активного компонента и возможной сверхстимуляции кожи и сальных желез андрогенными метаболитами предшественника полового стероидного гормона.

В фармацевтической композиции для перорального применения, ДГЭА или другой предшественник предпочтительно присутствует в концентрации в диапазоне от 5 до 98% масс. относительно общей массы композиции, более предпочтительно от 50 до 98% масс., в частности от 80 до 98% масс. Может быть использован один предшественник, такой как ДГЭА, в качестве единственного активного компонента, или альтернативно можно использовать множество предшественников и/или их аналогов (например, комбинацию ДГЭА, ДГЭА - С (DHEA-S), 5-диола, или комбинацию двух или нескольких соединений, превращаемых in vivo в ДГЭА, ДГЭА - С или 5-диол или комбинацию ДГЭА или 5-диола и одного или нескольких их аналогов, которые превращаются в ДГЭА или 5-диол in vivo, и т.д.). Уровень ДГЭА в крови является конечным критерием адекватной дозы с учетом индивидуального варьирования, обусловленного различием в абсорбции и обмене веществ.

Предпочтительно лечащему врачу следует, особенно в начале лечения, следить за общей реакцией индивидуального пациента и уровнями ДГЭА в сыворотке (по сравнению с предпочтительными сывороточными концентрациями, изложенными выше), и контролировать общую реакцию пациента на лечение, регулируя дозы, по мере необходимости, в тех случаях, когда метаболизм данных пациентов или реакция на лечение становится атипичной.

Лечение в соответствии с изобретением применимо на протяжении неопределенного периода времени. Предполагают, что лечение ДГЭА и/или 5-диолом или другим предшественником будет просто поддерживать уровни ДГЭА в пределах диапазона, подобного тому, который имеет место, от природы, у женщин перед менопаузой (концентрация в сыворотке между 4 и 10 микрограммами на литр), или который имеет место, от природы, у молодых взрослых мужчин (концентрация в сыворотке между 4 и 10 микрограммами на литр).

Соединение - СМРЭ и/или предшественник полового стероидного гормона могут быть также введены пероральным путем и могут быть включены в рецептуру таблеток или капсул для перорального введения вместе с обычными фармацевтическими наполнителями, например высушенной распылением лактозой, микрокристаллической целлюлозой и стеаратом магния.

Активное вещество может быть включено в состав таблеток или ядер драже путем смешения с твердыми, измельченными в порошок веществами-носителями, такими как цитрат натрия, карбонат кальция или двухкальциевый фосфат, и связующими, такими как поливинилпирролидон, желатин или производные целлюлозы, кроме того, возможно добавление смазок, таких как стеарат магния, лаурилсульфат натрия, "Carbowax" или полиэтиленгликоль. Конечно, в случае форм для перорального введения можно добавить вещества, улучшающие вкус.

В качестве дополнительных форм можно использовать твердые капсулы, например, из твердого желатина, а также закрытые мягкие желатиновые капсулы, включающие размягчитель или пластификатор, например глицерин. Твердые капсулы содержат активное вещество предпочтительно в форме гранулята, например, в смеси с наполнителями, такими как лактоза, сахароза, маннит, крахмалы, такие как картофельный крахмал или амилопектин, производные целлюлозы или сильно диспергированные кремниевые кислоты. В мягких желатиновых капсулах активное вещество предпочтительно растворено или суспендировано в подходящих жидкостях, таких как растительные масла, или жидких полиэтиленгликолях.

Возможны формы в виде лосьона, мази, геля или крема и их следует тщательно втирать в кожу так, чтобы не было явно видно никакого избытка, и кожу в области нанесения не следует мыть до тех пор, пока большая часть препарата не проникнет внутрь кожи, предпочтительно, по крайней мере, на протяжении 4 часов и более предпочтительно, по крайней мере, 6 часов.

Можно использовать трансдермальный пластырь для доставки предшественника или СМРЭ в соответствии с известными способами. Обычно его применяют на протяжении значительно более длительного периода времени, например от 1 до 4 дней, однако обычно активный компонент контактирует с меньшей площадью поверхности, позволяя медленную и постоянную доставку активного компонента.

Целый ряд трансдермальных систем доставки лекарственных средств, которые были разработаны и которые находят применение, пригодны для доставки активного компонента данного изобретения. Скорость высвобождения обычно контролируется диффузией через матрицу или проходом активного компонента через регулирующую мембрану.

Механические аспекты трансдермальных устройств общеизвестны для крысы (модель), и они изложены, например, в патентах США 5162037, 5154922, 5135480, 4666441, 4624665, 3742951, 3797444, 4568343, 5064654, 5071644, 5071657, описания которых включены здесь в качестве уровня техники. Дополнительные материалы известного уровня техники имеются в европейском патенте 0279982 и заявке на патент Великобритании 2185187.

Устройство может быть любым из общепризнанных в данной области типов, включая трансдермальные устройства доставки на основе адгезивной матрицы и трансдермальные устройства на основе резервуара. Устройство может включать содержащие лекарственное средство матрицы, включающие волокна, которые абсорбируют активный компонент и/или носитель. В устройстве типа резервуара резервуар может быть ограничен полимерной мембраной, непроницаемой для носителя и активного компонента.

В трансдермальном устройстве устройство, само по себе, поддерживает контакт активного компонента с желаемой локализованной поверхностью кожи. В таком устройстве вязкость носителя для активного компонента имеет меньшее значение, чем в случае крема или геля. Система растворителя для трансдермального устройства может включать, например, олеиновую кислоту, лактат линейного спирта и дипропиленгликоль или другие системы растворителя, известные в данной области. Активный компонент может быть растворен или суспендирован в носителе.

Для прикрепления к коже трансдермальный пластырь может монтироваться на хирургическом лейкопластыре, имеющем отверстие, перфорированное в середине. Вышеуказанный адгезив предпочтительно покрывают съемной прокладкой, чтобы защитить его до использования. Обычный материал, подходящий для удаления, включает полиэтилен и бумагу, покрытую полиэтиленом и предпочтительно покрытую силиконом для простоты удаления. В случае применения устройства прокладку, предназначенную для удаления, снимают и адгезив прикрепляют к коже пациента. В патенте США 5135480, раскрытие сущности которого включено в качестве уровня техники, Bannon et al. описывают альтернативное устройство, имеющее неадгезивное средство для обеспечения устройства для кожи.

Кроме того, можно использовать чрескожные системы доставки или системы доставки через слизистую оболочку данного изобретения в качестве новой и улучшенной системы доставки лекарственного средства для профилактики и/или лечения ожирения.

ПРИМЕРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ СПОСОБОВ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1

Эффект 35-недельного лечения соединениями изобретения на общий жир тела и массу тела овариэктомированной (OVX) крысы.

ВЕЩЕСТВА И СПОСОБЫ

Животные и лечение

Были использованы крысы-самки Sprague-Dawley (Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St-Constant, Canada) в возрасте десяти-двенадцати недель, весом приблизительно 225-250 г в начале лечения. Животные были подвергнуты акклиматизации к условиям окружающей среды (температура: 22 ± 3°С; влажность: 50 ± 20%; циклы фотопериода: 12 ч свет - 12 ч темнота, освещение с 07:15 ч) в течение 1 недели перед началом эксперимента. Животных размещали по три в клетку и предоставляли свободный доступ к водопроводной воде и гранулированной сертифицированной пище для грызунов (Lab Diet 5002, Ralston Purina, St-Louis, МО). Эксперимент проводили на оборудовании, одобренном Канадским Советом по уходу за животными в соответствии с руководством ССАС по уходу и использованию экспериментальных животных.

Двести семьдесят шесть крыс были статистически распределены в 23 группы по 12 животных каждая следующим образом: 1) интактный контроль; 2) OVX (овариоэктомированные) контроль; с 3) по 7) OVX + ЕМ-800 (0,01; 0,03; 0,1; 0,3 или 1 мг/кг); с 8) по 12) OVX + Ралоксифен (0,01; 0,03; 0,1; 0,3 или 1 мг/кг); с 13) по 17) OVX + Тамоксифен (0,01; 0,03; 0,1; 0,3 или 1 мг/кг); с 18) по 22) OVX + ЕМ-776 (0,01; 0,03; 0,1; 0,3 или 1 мг/кг); 23) OVX + эстрадиол (E ₂, имплантат). На 1 день исследования животные соответствующих групп были подвергнуты двусторонней овариэктомии (OVX) под анестезией изофлураном. Один имплантат из органосиликонового эластомера с эстрадиолом (E₂) вставляют подкожно в дорсальную область каждого животного группы 13. Имплантаты имели нижеуказанную концентрацию E₂ и размер: Е₂ (Е₂: холестерин (1:100, мас./мас.)), 0,5 см (длина), 0,125 дюйма (0,314 см) (наружный диаметр) и 0,062 дюйма (0,156 см) (внутренний диаметр). В течение эксперимента имплантаты E₂ заменяли раз в месяц. Лечение ЕМ-800, Ралоксифеном, Тамоксифеном, и ЕМ-776 или наполнителем (4% этанол, 4% полиэтиленгликоль-600, 1% желатин и 0,9% NaCl) начинали на 2 день исследования. Соответствующее соединение или только наполнитель вводили один раз в день катетером для перорального введения в количестве 0,5 мл/крыса на протяжении 37 недель. Спустя приблизительно 24 часа после последнего дозирования, животных, лишенных пищи на протяжении ночи, забивали путем обескровливания через брюшную аорту под анестезией изофлураном.

Состав жира тела

После 35-недельного лечения у отдельных крыс, находящихся под наркозом под действием изофлурана, сканированием оценивали полную структуру тела, а также их правое бедро, используя метод двухуровневой рентгеновской абсорбциометрии (DEXA; QDR 4500А, Hologic, Waltham, MA) и программное обеспечение сканирования области тела с высоким разрешением. Размер поля сканирования, используемый для всего тела, составлял 30,492 × 17,912 см, разрешение составляло 0,1512 × 0,0640 см и скорость сканирования составляла 2,499 мм/с. Был определен состав жира всего тела.

Статистический анализ

Данные выражены как среднее ± SEM. Статистическая значимость определялась в соответствии с критерием Дункана - Крамера для множественных диапазонов (1956).

Результаты: Фиг. 1 иллюстрирует действие увеличения ежедневных пероральных доз ЕМ-800, ралоксифена, тамоксифена и ЕМ-776 на жир тела, измеренный in vivo методом DEXA. Можно видеть, что ЕМ-800 при самой низкой дозе 0,01 мг/кг уменьшает на 78% OVX-вызванную стимуляцию жира тела, ралоксифен менее активен, чем ЕМ-800, в то время как ЕМ-776, энантиомер ЕМ-800, не оказывает существенного действия. В Таблице 1 представлены данные о влиянии ЕМ-800 или ралоксифена на массу тела овариэктомированных крыс. Проведено сравнение с интактными и овариэктомированными контрольными крысами. Кроме того, можно видеть, что небольшие дозы ЕМ-800 обеспечивают массу тела, аналогичную которой можно достичь при существенно более высоких количествах ралоксифена (например, 0,03 мг/кг ЕМ-800 дают те же результаты, что и 0,3 мг/кг ралоксифена). Оба основательно изменяют индуцированный овариэктомией прирост массы при значительно более высоких дозах.

Таблица 1
Группа	Масса тела при вскрытии г
Интактный контроль	356 ± 16**
OVX контроль	491 ± 16
OVX + ЕМ -800 (0,01 мг/кг)	385 ± 17**
" (0,03 мг/кг)	364 ± 10**
" (0,1 мг/кг)	369 ± 17**
" (0,3 мг/кг)	359 + 7**
" (1 мг/кг)	368 ± 6**
OVX + Ралоксифен (0,01 мг/кг)	439 ± 13*
" (0,03 мг/кг)	451 ± 14*
" (0,1 мг/кг)	389 ± 14**
" (0,3 мг/кг)	367 + 9**
" (1 мг/кг)	342 ± 12**

Пример 2

11-месячное комбинированное лечение соединениями изобретения

1. Испытываемые вещества

1.1. Испытываемые соединения:

ДГЭА: Доступный от Steraloids Inc. Wilton, NH. Lot: H137;

EM-800 синтезирован в UCPO Department of Lab. of Mol. Endo., CHUL.

1.2. Наполнитель

a) Желатин: Lab-Grade, ACP Chemicals Inc., Montreal, Qc. Lot# F0195

b) Этанол: Commercial Alcohols Inc., Brampton, Ontario. Lot No. 11296

c) Полиэтиленгликоль-600 (ПЭГ-600, PEG-600): Omega Chemical Company Inc., Levis, Quebec. Lotft: 00-0117-EZ

d) Стандартный насыщенный раствор соли: 0,9% хлорид натрия irrigation USP. Abbott Laboratories Limited, St-Laurent, Qc.

e) Пропиленгликоль (1,2-Пропандиол, ПГ (PG)): Sigma Chemical Co., St-Louis, МО.

g) Наполнитель 1: 4% EtOH - 4% ПЭГ- 600 - 1% желатин - 0,9% NaCl-H₂O для подкожной инъекции.

h) Наполнитель 2: 50% EtOH-50 % PPG для местного применения.

2. Характеристики подопытных животных:

2.1. Вид: Rattus norvegicus

2.2. Линия: Sprague-Dawley Крыса (Crl:CD^® (SD) BR VAF/Plus )

2.3. Пол: самка

2.4. Источник: Charles River Canada Inc. 188 Lasalle Road St. Constant, Quebec 1-800-561-4975

2.5. Возраст в начале дозирования: крысы G18-29 в возрасте 16 недель

2.6. Содержание и уход

a) Содержание: Крыс содержали по 2-3 особи в клетке в обувных коробках. Каждая клетка была снабжена соответствующей меткой, указывающей на номер протокола, номер группы и номер животного.

b) Во время исследования условия окружающей среды в помещении обычно находятся под контролем (заданные условия: температура 20 до 25°С; влажность: 50 ± 20%). Фотопериод (длина светового дня) обычно составляет освещение 12 часов: темнота 12 часов.

с) Кормовой рацион и вода: Рацион для грызунов (гранулы), и водопроводная вода представлялись ad libitum.

2.7. Период акклиматизации: По крайней мере, две недели.

2.8. Рандомизация: По прибытии крыс обычно распределяют по группам случайным образом.

2.9. Способ эвтаназии: общий наркоз, индуцированный изофлураном.

3. Способы и план эксперимента

1 Интактный контроль 11 крыс/группа

2 OVX контроль всего 44 крысы

3 OVX + ДГЭА 12,5 мг

4 OVX + ДГЭА 12,5 мг + ЕМ-800 (100 мкг)

3.1. Приготовление носителя и продуктов для испытания

a) Получение ЕМ-800:

ЕМ-800 или оба из них растворяют в Е10 Н: ПЭГ-600 (1:1) при перемешивании на лабораторной нагревательной плитке Fisher, затем добавляют 1% GNS до требуемого объема.

b) Получение ДГЭА:

ДГЭА растворяют в 50% EtOH, 50% ППГ (PPG) при перемешивании.

3.2. Подготовка животных и лечение:

Животных обычно обрабатывают один раз в день, как указано в пункте 6.1. ДГЭА, приготовленный в 50% EtOH, 50% ППГ (PPG), обычно вводят чрескожно (Ч.К., Р.С.) соответствующему животному один раз в день (И.Д., I.D.) в объеме 0/5 мл. ЕМ- 800 обычно приготавливают в 4% EtOH, 4% ПЭГ- 600, 1% желатин, 0,9% NaCl, и вводят подкожно животным соответствующих групп один раз в день (П.К.(S.С.), И.Д. (I.D.)) в объеме 0,5 мл. Крыс подкожно инъецируют 0,5 мл наполнителя 1, если их не обрабатывают подкожно каким-либо испытываемым соединением, и применяют местно 0,5 мл наполнителя 2, если их не обрабатывают 5-диолом и не обрабатывают ДГЭА.

3.3. Наблюдения и измерения

а) Клинические наблюдения:

Каждую крысу подвергают осмотру, по крайней мере, один раз в день с целью обнаружения каких-либо проявлений.

b) Масса тела:

Крыс взвешивают в начале и конце протокола испытаний, и каждые три месяца во время лечения.

4. Результаты:

Как следует из таблицы 2, действие лечения ДГЭА при суточной дозе 12,5 мг заключается в снижении на 87% стимулирования массы тела, вызванного овариэктомией (OVX). Введение ЕМ- 800 при суточной дозе 100 мкг дает синергический эффект и сопровождается 140% ингибированием стимулирования массы тела, вызванного OVX.

Таблица 2
Обработка	Общая масса тела (г)
Интактный	479,5±20,4
OVX	567,4±25,7
OVX+ДГЭА (12,5 г/кг/день/крыса)	490,8±24,1
OVX+ДГЭА (12,5мг/день/крыса)+ЕМ - 800 (100 мкг/день/крыса)	444,5±20,5

Пример 3

Эффект 20-дневного лечения ЕМ-652.HCl на параметры жира тела и массы тела овариэктомированных крыс

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Животные и лечение

Были использованы крысы-самки линии Sprague-Dawley (Crl:CD(SD)Br) (Charles River Laboratory, St-Constant, Canada) в возрасте от восьми до десяти недель, весом приблизительно 200-225 г в начале лечения. Животные были подвергнуты акклиматизации к условиям окружающей среды (температура: 22 ± 3°С; циклы фотопериода: 10 ч свет - 14 ч темнота, освещение с 06:00 ч) в течение 1 недели до начала эксперимента. Животные были размещены индивидуально в клетках из нержавеющей стали стандартной конструкции и имели свободный доступ к водопроводной воде и смешанному обогащенному углеводами рациону питания, состоящему из (г/100 г): кукурузный крахмал, 31,2; декстроза 31,2; казеин 20/0; кукурузное масло 6,4; dl-метионин 0,3; витаминная смесь 1,0; минеральная смесь AIN-76 4,9 и волокно (клетчатка) 5,0. Эксперимент проводят на оборудовании, утвержденном Канадским Советом по уходу за животными в соответствии с требованиями ССАС по уходу и использованию экспериментальных животных.

Сорок крыс статистически были распределены в четыре группы по 10 животных, каждая, следующим образом: 1) интактный контроль; 2) OVX контроль; 3) OVX + ЕМ-652.HCl (0,5 мг/крыса, ˜2,5 мг/кг); 4) OVX + эстрадиол (Е₂ , имплантат). На день 1 исследования животные соответствующих групп были подвергнуты двусторонней овариэктомии (OVX) в условиях анестезии под действием изофлурана. В дорсальную область каждого животного группы 4 подкожно внедряли один имплантат, изготовленный из органосиликонового пластика, с эстрадиолом (Е ₂). Имплантаты, подобранные в предварительных экспериментах так, чтобы обеспечивать физиологические уровни Е ₂, имели нижеследующие концентрации стероида и размер: E₂:холестерин (1:50, мас.:мас.), 0,5 см (длина разбавленного стероида в гибкой трубочке из силастика), 0,125 дюйма (0,314 см) (наружный диаметр гибкой трубочки из силастика) и 0,062 дюйма (0,156 см) (внутренний диаметр гибкой трубочки из силастика). Имплантаты с эстрадиолом выдерживали в 0,9% NaCl при 37°С на протяжении ночи перед их подкожным внедрением животным. Обработку ЕМ-652.HCl или только одним наполнителем (0,4% метилцеллюлоза в воде) начинали на день 2 исследования. Соединение или наполнитель давали один раз в день при помощи перорального катетера в количестве 0,5 мл/крыса на протяжении 20 дней. Массу тела и потребление корма регистрировали каждые 2 дня.

Приблизительно через 24 часа после последнего дозирования животных, лишенных пищи на протяжении ночи, анестезировали кетаминксилазином и отбирали кровь кардиальной пункцией. Собирали кровь, а также извлекали белую и бурую жировые ткани.

Измерения массы тела, расхода корма и увеличения энергии, прироста жира и измерение содержания белка

Массу тела, потребление корма и увеличение энергии тела, прирост жира и содержание белка определяли согласно Deshaies et al. Am. J. Physiol., 1997; 273, E355-E362 (1997).

Измерения тканей

Активности липопротеинлипазы определяли в соответствии с методикой Deshaies et al., Am. J. Physiol., 1997; 273, E355-E362 (1997).

Результаты

На фигурах 2А и С можно видеть, что 20-дневное лечение ЕМ - 652. HCl полностью трансформирует 4-кратный прирост массы тела и 3-кратный прирост жира, соответственно, наблюдаемые после овариэктомии, в то время как этот эффект проявляется в меньшей степени на приросте белка (фигура 2В). Эстрадиол оказывал меньшее влияние. Суммарное потребление продуктов питания представлено на фигуре 3. Действие лечения отразилось на приросте массы тела. Эстрадиол частично предотвращал обусловленное OVX увеличение потребности потребления пищи, в то время как ЕМ-652.HCl был в этом смысле более эффективен, чем эстрадиол, снижая потребление пищи до значения более низкого, чем значение интактных животных.

Основные параметры энергетического баланса суммированы в таблице 3. OVX увеличивает усвояемое количество потребляемой энергии на 44%. Эстрадиол снижает потребление энергии у OVX-животных, однако общее потребление энергии остается на 17% выше, чем общее потребление энергии у интактных животных, в то время как ЕМ - 652. HCl полностью предотвращает OVX-индуцированное увеличение потребления энергии. Прирост энергии пропорционален потреблению пищи. И снова, эстрадиол снижает прирост энергии (до уровней, значимо не отличающихся от уровней интактных крыс), однако ЕМ - 652. HCl оказывается более эффективным (значимо отличается от эстрадиола).

Эффективность питания возрастает при OVX, снижается у OVX-животных под действием Е₂ и еще больше снижается под действием ЕМ - 652. HCl.

Как можно видеть на фигурах 4А и В, при лечении ЕМ - 652. HCl полностью трансформируется 30% увеличение энергии организма, поступающее от белков, после овариэктомии, а также 80% увеличение энергии организма, поступающее от жира. Как показано на фигуре 5А, развитие инсулинорезистентности подтверждается наличием гиперинсулинемии при голодании (которая обычно пропорциональна степени инсулинорезистентности) и проявляющейся натощак гипергликемии (отражение потери эффективности инсулина поддерживать нормальные уровни глюкозы в крови). Как эстрадиол, так и ЕМ - 652. HCl, оба, предотвращают инсулинорезистентность, индуцируемую OVX (овариэктомией).

Фигуры 6А и 6С демонстрируют, что OVX способствует увеличению массы (количеств) паховой и забрюшинной жировых тканей, которые отражают наблюдаемое изменение в содержании общего жира тела. Это увеличение полностью ликвидируется лечением ЕМ - 652. HCl. В случае эстрадиола, такое действие менее существенно. Та же самая картина представлена на Фигуре 6В и 6D, где представлена активность липопротеинлипазы. Этот фермент модулирует внутрисосудистый гидролиз триглицеридов и тем самым поступление жирных кислот в жировые запасы.

Бурая жировая ткань является основным термогенным эффектором у грызунов. Овариэктомия по-разному отражается на параметрах межлопаточной бурой жировой ткани и белой жировой ткани. Масса бурой жировой ткани возрастает в два раза (фигура 7А) по сравнению с массой, наблюдаемой в случае белой жировой ткани. Однако содержание белка (фигура 7В) и активность липопротеинлипазы (фигура 7С) уменьшаются на 33 и 30%, соответственно, после OVX. Относительно этих трех параметров, лечение ЕМ - 652. HCl полностью аннулирует действие овариэктомии.

Масса камбаловидной мышцы обычно является хорошим показателем (индекс) статуса белковой массы организма. Как ожидалось, масса камбаловидной мышцы, как показано на Фигуре 8, возрастает при овариэктомии (увеличение потребности в потреблении корма приводит к увеличению депонирования энергии в виде жира и белка). Лечение как эстрадиолом, так и ЕМ - 652. HCl предотвращало увеличение мышечной массы. Липопротеинлипаза в мышце зачастую непосредственно связана с чувствительностью к инсулину (чем выше чувствительность, тем больше липопротеинлипазы в мышце). OVX понижает активность липопротеинлипазы в камбаловидной мышце, косвенно доказывая развитие инсулинорезистентности в мышце. Как лечение эстрадиолом, так и лечение ЕМ - 652. HCl предупреждает уменьшение липопротеинлипазы в мышце.

Таблица 3
Энергетический баланс
Состояние яичников	Интактный	OVX
Обработка		никакого	Е2	EM - 652
Усвояемое количество потребляемой энергии (кДж)	4708	6758 a	5511a	4479 b
Прирост энергии (кДж)	532	1677 a	903	278 b
Очевидный расход энергии (кДж)	4176	5081 a	4609a	4201b
Эффективность использования продуктов питания (%)	10,2	24,1 a	15,9	5,9b
а Отличный от интактных, р < 0, 05	b Отличный от овариэктомированных + E2, р < 0, 05

Усвояемое количество потребляемой энергии представляет общее количество энергии, поглощаемое на протяжении 20-дневного лечения (с учетом неусвояемых веществ, таких как волокно).

Прирост энергии представляет количество килоджоулей, откладываемых в виде жира + белок на протяжении 20-дневного лечения.

Очевидный расход энергии представляет количество энергии, израсходованной на метаболические потребности и локомоцию (рассчитываемое из потребления энергии и прироста энергии). Ожидается, что он будет больше, когда масса тела без жира больше (как например, у OVX-животных).

Эффективность питания представляет эффективность, с которой поглощаемая энергия откладывается в виде жира и белка (в кДж, откладываемых на 100 кДж поглощаемых).

Пример 4

Пример синтеза предпочтительного соединения изобретения

Синтез гидрохлорида (S)-(+)-7-гидрокси-3-(4'-гидроксифенил)-4-метил-2-(4"-(2"'-пиперидиноэтокси)фенил)-2Н -1- бензопирана ЕМ01538 (ЕМ-652.HCl)

Схема 1

Стадия А: BF₃ Et₂O, толуол; 100°С; 1 час.

Стадия С: 3,4-дигидропиран, п-толуолсульфоновая кислота моногидрат, этилацетат; 25°С в атмосфере азота, 16 часов, и затем кристаллизация в изопропаноле.

Стадии D, Е и F:

(1) пиперидин, толуол, устройство Дина - Старка, кипячение с обратным холодильником в атмосфере азота;

(2) 1,8-диазабицикло[5,4,0]ундек-7-ен, ДМФА (DMF), кипячение с обратным холодильником 3 часа;

(3) СН₃MgCl, ТГФ (THF), -20° до 0°С и затем комнатная температура в течение 24 часов;

Стадии G, Н: (1S)-(+)-10-камфорсульфоновая кислота, ацетон, вода, толуол, комнатная температура, 48 часов.

Стадия НН: 95% этанол, 70°С, затем комнатная температура 3 дня.

Стадия HHR: Рециркулирование маточного раствора и промывка стадии НН.

(S)-10-камфорсульфоновая кислота, кипячение с обратным холодильником; 36 часов, затем комнатная температура в течение 16 часов.

Стадия I:

(1) ДМФА (DMF) водн., Na₂ СО₃, этилацетат;

(2) этанол, разбавленная HCl;

(3) вода.

Синтез 2-тетрагидропиранилокси-4-гидрокси-2'- (4"-тетраги-дропиранилоксифенил)ацетофенона (4)

Суспензию 2,4-дигидрокси-2'- (4"-гидроксифенил)ацетофенона 3 (97,6 г, 0,4 моль) (доступный от Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas) в 3,4-дигидропиране (218 мл, 3,39 моль) и этилацетате (520 мл) обрабатывают моногидратом п- толуолсульфокислоты (0,03 г, 0,158 ммоль) при приблизительно 25°С. Реакционную смесь перемешивают в атмосфере азота без наружного обогрева в течение приблизительно 16 часов. Затем смесь промывают раствором бикарбоната натрия (1 г) и хлорида натрия (5 г) в воде (100 мл). Разделяют фазы и органическую фазу промывают насыщенным раствором соли (20 мл). Каждую промывку вновь экстрагируют 50 мл этилацетата. Все органические фазы объединяют и фильтруют через сульфат натрия.

Растворитель (около 600 мл) удаляют отгонкой при атмосферном давлении и добавляют изопропанол (250 мл). Добавленный растворитель (около 300 мл) отгоняют при атмосферном давлении и добавляют изопропанол (250 мл). Добавленный растворитель (около 275 мл) отгоняют при атмосферном давлении и добавляют изопропанол (250 мл). Раствор охлаждают при приблизительно 25°С при перемешивании и по истечении около 12 часов отфильтровывают кристаллическое твердое вещество, промывают изопропанолом и сушат (116,5 г, 70%).

Синтез 4-гидрокси-4-метил-2- (4'- [2" -пиперидино]этокси) фенил-3-(4"'-тетрагидропиранилокси)фенил-7-тетрагидропиранилокси-хромана (10)

Раствор 2-тетрагидропиранилокси-4-гидрокси-2'- (4"-тетра-гидропиранилоксифенил)ацетофенона 4 (1 кг, 2,42 моль), 4-[2-(1-пиперидино)этокси]бензальдегида 5 (594 г, 2,55 моль) (доступный от Chemsyn Science Laboratories, Lenexa, Kansas) и пиперидина (82,4 г, 0,97 моль) (доступного от Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.) в толуоле (8 л) кипятят с обратным холодильником в атмосфере азота в аппарате Дина - Старка до тех пор, пока не соберут один эквивалент воды (44 мл).

Из раствора дистилляцией при атмосферном давлении удаляют толуол (6,5 л). Добавляют диметилформамид (6,5 л) и 1,8-диазабицикло[5,4,0]ундек-7-ен (110,5 г, 0,726 моль). Раствор перемешивают в течение приблизительно 8 часов при комнатной температуре, чтобы изомеризовать халкон 8 в хроманон 9 и затем добавляют в смесь воды и льда (8 л) и толуола (4 л). Фазы разделяют и толуольный слой промывают водой (5 л). Объединенные водные промывки экстрагируют толуолом (3 × 4 л). В заключение объединенные толуольные экстракты промывают насыщенным раствором соли (3 × 4 л), концентрируют при атмосферном давлении до 5,5 л и затем охлаждают до -10°С.

При непрерывном наружном охлаждении и перемешивании в атмосфере азота добавляют 3 М раствор метилмагнийхлорида в ТГФ (THF) (2,5 л, 7,5 моль) (доступный от Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.), поддерживая температуру ниже 0°С. По завершении добавления реактива Гриньяра наружное охлаждение снимают и смеси дают возможность нагреться до комнатной температуры. Смесь перемешивают при указанной температуре в течение приблизительно 24 часов.

Смесь снова охлаждают до около -20°С и при непрерывном наружном охлаждении и перемешивании медленно добавляют насыщенный раствор (200 мл) хлорида аммония, поддерживая температуру ниже 20°С. Смесь перемешивают в течение 2 часов и затем добавляют насыщенный раствор (2 л) хлорида аммония и толуол (4 л) и перемешивают в течение пяти минут. Фазы разделяют и водный слой экстрагируют толуолом (2 × 4 л). Объединенные толуольные экстракты промывают разбавленной хлористо-водородной кислотой до тех пор, пока раствор не станет гомогенным, и затем промывают насыщенным раствором соли (3 × 4 л). Наконец, толуольный раствор концентрируют при атмосферном давлении до 2 л. Полученный раствор используют непосредственно на следующей стадии.

Синтез соли (1S)-10-камфорсульфоновой кислоты и (2R,S)-7-гидрокси-3- (4'-гидроксифенил) -4-метил-2-(4"- [2'"-пиперидино] этокси)фенил)-2Н-1-бензопирана (±12)

К раствору 4-гидрокси-4-метил-2-(4'-[2"-пиперидино] этокси) фенил)-3-(4"'-тетрагидропиранилокси)фенил-7-тетрагидропиранилоксихромана (10) в толуоле добавляют ацетон (6 л), воду (0,3 л) и (S)-10-камфорсульфоновую кислоту (561 г, 2,42 моль) (доступную от Aldrich Chemical Company Inc., Milwaukee, Wis.). Смесь перемешивают в атмосфере азота в течение 48 часов и по окончании этого времени отфильтровывают твердое вещество, соль (1S)-10-камфорсульфоновой кислоты и (2R, S)-7-гидрокси-3-(4'-гидроксифенил)-4-метил-2-(4"-[2"'-пиперидино]этокси)фенил)-2Н- 1 -бензопирана (12), промывают ацетоном и сушат (883 г). Полученное вещество используют на следующей (НН) стадии без дополнительной очистки.

Синтез соли (1S)-10-камфорсульфоновой кислоты и (2S)-7- гидрокси-3- (4'-гидроксифенил) -4-метил-2- (4"- [2"'-пиперидино ] этокси) фенил)-2Н-1-бензопирана (13, (+)-ЕМ- 652(1S)-соль KCK(CSA)).

Суспензию соли (1S) -10-камфорсульфоновой кислоты и (2R,S)-7-гидрокси-3- (4'-гидроксифенил) -4-метил-2- (4"- [2"'-пиперидино] этокси) фенил)-2Н -1- бензопирана 12 (759 г) в 95% этаноле нагревают при перемешивании до приблизительно 70°С до тех пор, пока твердое вещество не растворится. Раствору дают возможность охладиться до комнатной температуры при перемешивании, затем вносят затравку - несколько кристаллов соли (1S)-10-камфорсульфоновой кислоты и (2S)-7-гидрокси-3-(4'-гидроксифенил)-4-метил-2-(4"-[2'''-пиперидино]этокси)фенил)-2Н -1- бензопирана 13. Раствор перемешивают при комнатной температуре, в итоге, в течение приблизительно трех дней. Кристаллы отфильтровывают, промывают 95% этанолом и сушат (291 г, 76%). De продукта составляет 94,2% и чистота - 98,8%.

Синтез гидрохлорида (S)-(+)-7-гидрокси-3-(4'-гидроксифенил)-4-метил-2-(4"- (2'''-пиперидиноэтокси)фенил)-2Н -1- бенэопирана ЕМ -01538 (ЕМ-652.HCl)

Суспензию соединения 13 (ЕМ -652-(+)-КСК соль, 500 мг, 0,726 ммоль) в диметилформамиде (11 мкл, 0,15 ммоль) обрабатывают 0,5 М водным раствором карбоната натрия (7,0 мл, 3,6 ммоль) и перемешивают в течение 15 минут. Суспензию обрабатывают этилацетатом (7,0 мл) и перемешивают в течение 4 ч. Затем органическую фазу промывают водным насыщенным раствором карбоната натрия (2×5 мл) и насыщенным раствором соли (1×5 мл), сушат над сульфатом магния и концентрируют. Раствор полученной розовой пены (ЕМ - 652) в этаноле (2 мл) обрабатывают 2N хлористо-водородной кислотой (400 мкл, 0,80 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, обрабатывают дистиллированной водой (5 мл) и перемешивают в течение 30 мин. Полученную суспензию фильтруют, промывают дистиллированной водой (5 мл), сушат на воздухе и в условиях высокого вакуума (65°С), получая порошок кремового цвета (276 мг, 77%): тонкоизмельченный беловатый порошок; Сканирующая калориметрия: начало пика плавления при 219°С, ПН (DH, direct heating) = 83 Дж/г; [ ]²⁴ = 154° в метаноле 10 мг/мл; ¹H ЯМР (300 МГц, CD₃ OD) (ч/млн) 1,6 (широкий, 2Н, Н-4'" ), 1,85 (широкий, 4Н, Н-3""и 5""), 2,03 (с, 3Н, СН ₃), 3,0 и 3,45 (широкий, 4Н, Н-2""и 6""), 3,47 (т, J=4,9 Гц, 2Н, Н-3"'), 4,26 (т, J=4,9 Гц, 2Н, Н-2'"), 5,82 (с, 1Н, Н-2), 6,10 (д, J=2,3 Гц, 1Н, Н-8), 6,35 (дд, J=8,4, 2,43 Гц, 1Н, Н-6), 6,70 (д, J=8,6 Гц, 2Н, Н-3', и Н-5'), 6,83 (д, J=8,7 Гц, 2H, Н3" и Н-5"), 7,01 (д, J=8,5 Гц, 2H, Н-2' и Н-6'), 7,12 (д, J=8,4 Гц, 1Н, Н-5), 7,24 (д, J=8,6 Гц, 2H, Н-2" и Н-6'' ) ; ¹³С ЯМР (CD₃OD, 75 МГц) д ч/млн 14,84, 22,50, 23,99, 54,78, 57,03, 62,97, 81,22, 104,38, 109,11, 115,35, 116,01, 118,68, 125,78, 126,33, 130,26, 130,72, 131,29, 131,59, 134,26, 154,42, 157,56, 158,96, 159,33. Элементный состав: С, Н, N, Cl: Теоретически: 70,51, 6,53, 2,84, 7,18, %, найдено: 70,31, 6,75, 2,65, 6,89%.

Пример 5 демонстрирует предотвращения увеличения жира, индуцированного LHRH-A, с помощью ЕМ-652.HCl соединения данного изобретения, одним или в комбинации с ДГЭА, предшественником полового гормона, у интактных крыс-самок. Можно видеть, что 6-месячная обработка LHRH-A увеличивает значительно, на 58%, процентное содержание жира тела интактных крыс-самок, в то время при сопутствующем введении ЕМ-652.HCl или ДГЭА это увеличение составляло только 35% и 19% соответственно. В случае комбинирования обоих лекарственных средств никакого увеличения жира не наблюдалось после обработки LHRH-A.

В примере 6 представлены результаты предотвращения ожирения у крыс-самок на протяжении периода времени 20 дней. Овариэктомия приводит к увеличению процентного содержания общего жира (жировой массы) тела и массы ретроперитонеальной жировой ткани на 20% и 68% соответственно. Эти увеличения удается предотвратить, и даже жир тела и забрюшинная жировая ткань уменьшаются при введении ЕМ-652.HCl, эстрадиола, ДГЭА или комбинации ЕМ-652.HCl и ДГЭА или ЕМ - 652. HCl и эстрадиола: для жира тела на 46%, 46%, 59%, 56% и 45% соответственно и на 59%, 78%, 75%, 69% и 68% соответственно для забрюшинной жировой ткани. Аналогичный эксперимент изложен в примере 7. В этом случае предотвращение ожирения прослеживается в течение 34 недель, и тогда процентное содержание жира тела и забрюшинной жировой ткани составляет приблизительно 60% увеличенного в результате овариэктомии. Это увеличение предотвращается введением этинилэстрадиола, ралоксифена (ЕМ-1105), ЕМ -652.HCl (ЕМ-1538), ДГЭА или комбинации ЕМ-652.HCl и ДГЭА.

В примерах 8А (самец) и 8В (самка) представляются данные эффективности изобретения, заключающиеся в профилактика ожирения, а также в лечении ожирения. Тощим и жирным крысам-самцам и крысам-самкам линии Zucker вводили 2,5 мг/кг/день ЕМ-652.HCl на протяжении 20 дней. Модель предотвращения (профилактики) иллюстрируется на тощих крысах, в то время как модель лечения ожирения иллюстрируется на уже страдающих ожирением крысах. Данные по приросту массы тела, активности липопротеинлипазы в белой забрюшинной жирной ткани и камбаловидной мышце, а также концентрации в плазме инсулина, глюкозы, суммарного холестерина и триглицеридов представлены в таблице 7 для самцов и в таблице 8 для самок (смотри пример 3; стат. значимость этих параметров).

Антиэстроген ЕМ-652.HCl сильно уменьшал прирост массы тела: на 38% для тощих крыс-самцов и на 35% для жирных крыс-самцов, в то время как активность липопротеинлипазы в белой забрюшинной жировой ткани и камбаловидной мышце не изменяется у обоих полов. Инсулин в плазме понижается на 35%, 57% и 48% у тощих самцов, жирных самцов и тощих самок, соответственно, в то время как у жирных самок, которые демонстрируют наиболее высокий уровень инсулина, ЕМ-652.HCl не оказывает существенного влияния на уровень инсулина. Холестерин в плазме, который выше у жирной группы, также понижается при введении ЕМ-652.HCl. Лечение ЕМ-652.HCl не оказывает влияния на сывороточную глюкозу.

Пример 9 иллюстрирует действие ЕМ-652.HCl, ДГЭА или комбинации обоих на интактных или овариэктомированных крысах-самках, получавших обогащенный сахарозой и жиром рацион, на общую массу, массу и активность липопротеинлипазы белой жировой паховой и забрюшинной ткани, бурой жировой ткани, камбаловидной мышцы и латеральной широкой мышцы бедра (VLM). Помимо этого приводятся данные инсулина, глюкозы, суммарного холестерина, триглицеридов и лептина в плазме, а также данные холестерина и триглицеридов в печени.

Пример 10 иллюстрирует действие лечения различными селективными модуляторами рецептора эстрогена, описанными в литературе (TSE424, Ласофоксифен, LY 353381 и Ралоксифен), а также ЕМ - 652. HCl, предпочтительным соединением изобретения, на прирост массы и на липидлипопротеиновый метаболизм крыс. Испытываемые соединения вводили овариэктомированным крысам-самкам с помощью перорального катетера на протяжении 20 дней (0,5 мг/крыса для каждого соединения) в 0,4% метилцеллюлозе. В качестве сравнения используют интактных контрольных, овариэктомированных (OVX) контрольных и OVX крыс, подвергнутых лечению 17 -эстрадиолом (Е₂). Масса тела и потребление корма, которые возрастают при овариэктомии, существенно уменьшались при лечении испытываемыми соединениями, приближаясь к уровню, наблюдаемому для интактных контролей. Масса и активность липопротеинлипазы белой жировой паховой и забрюшинной жировой ткани снижались вышеупомянутым лечением (за исключением TSE 424 и LY 353381 для белой жировой ткани и TSE 424 и Ласофоксифена для активности липопротеинлипазы паховой ткани), в то время как бурая жировая ткань и мышца, по-видимому, не поддаются значимому воздействию. Можно видеть, что все испытываемые соединения понижают в значительной степени концентрацию в плазме холестерина и триглицеридов, но не оказывают действия на уровни глюкозы. Инсулин в плазме уменьшается при лечении OVX крыс ЕМ-652.HCl, TSE 424, Ласофоксифеном, LY 353381 и Ралоксифеном.

В примерах 11 и 12, иллюстрируется in vitro эффективность действия известных антиэстрогенов и соединений данного изобретения в эстрогензависимых клеточных линиях. Действие антиэстрогенов на активность щелочной фосфатазы в Ishikawa клетках эндометриальной аденокарциномы человека представлено в таблице 11 примера 10. Антиэстрогенная активность представлена в последней колонке в виде IC₅₀ , выраженной в нМ ингибирования щелочной фосфатазы, стимулированной 1 нМ E₂, тогда как характеристическая эстрогенная активность испытываемых соединений приведена в предпоследней колонке как процент от активности щелочной фосфатазы, стимулированной 1 нМ E₂. Можно видеть, что наиболее активными антиэстрогенами являются ЕМ-652.HCl, LY 353381, Ралоксифен, Ласофоксифен и TSE 424. Другие, по крайней мере, в десять раз менее активны. Однако среди наиболее активных соединений, некоторые проявляют существенную остаточную нежелательную эстрогенную активность: LY 353381 (16%), Ласофоксифен (18%) и Ралоксифен (13%). Таким образом, вышеупомянутые данные указывают на то, что соединения ЕМ-652.HCl и TSE 424 не демонстрируют существенную эстрогенную активность в Ishikawa клетках. В примере 12 сравнение ЕМ-652.HCl, предлагаемого как предпочтительное соединение, и TSE 424 в клетках MCF-7 рака молочной железы человека демонстрирует преимущество ЕМ-652.HCl. Таким образом, это соединение больше, чем в четыре раза более активно, чем TSE 424 в качестве антиэстрогена (ECso ингибирования 0,8 нМ против 3,7 нМ) (таблица 12).

В примере 13 проведена оценка действия 20-дневного лечения ЕМ-652.HCl, TSE 424 или Ласофоксифеном на массу тела, забрюшинную жировую ткань, маточную массу и уровни холестерина овариэктомированных крыс-самок, получавших коммерческий рацион для грызунов. Овариэктомия индуцирует 17% и 19% увеличения суммарной массы тела и массы забрюшинной жировой ткани соответственно, в то время как введение 0,5 мг ЕМ-652.HCl, TSE 424 или Ласофоксифена предупреждает увеличение массы тела на 64%, 59% и 127% соответственно и приводит к более низким величинам массы жировой ткани, чем наблюдаемые у интактных контрольных животных для всех исследованных соединений. Введение ЕМ-652.HCl и TSE 424 не оказывает влияния на маточную массу по сравнению с OVX контрольными животными. Однако введение 0,5 мг Ласофоксифена вызывало 62% увеличение (р > 0,01) маточной массы, которое полностью трансформировалось одновременным введением 2,5 мг ЕМ-652.HCl, тем самым подтверждая эстрогенную активность Ласофоксифена. Наконец, индуцируемое овариэктомией (OVX) увеличение суммарных уровней сывороточного холестерина полностью предотвращается введением ЕМ-652.HCl, TSE 424 и Ласофоксифена и ведет к существенно более низким значениям холестерина, чем наблюдаемые у интактных контрольных животных.

Пример 5

Действие ЕМ-652.HCl и ДГЭА, вводимых каждый в отдельности или в комбинации, на накопление жира у интактных крыс-самок, получавших или не получавших LHRH-A URMA-r-04-99

Цель данного исследования заключается в определении действия на жир обработки ЕМ-652.HCl и дегидроэпиандростероном (ДГЭА, DHEA) интактных крыс-самок, получавших или не получавших агонист лютеинизирующий гормон - высвобождающего гормона (LHRH-A, LHRH этиламид диацетат). Для этой цели интактным крысам-самкам, обработанным или не обработанным LHRH-A (1 мкг/крыса), вводили ежедневно ЕМ-652.HCl (2,5 мг/кг) и ДГЭА (100 мг/кг), каждый в отдельности или в комбинации, в течение 6 месяцев. ЕМ-652.HCl вводили перорально, ДГЭА применяли местно, в то время как LHRH-A инъецировали подкожно. Все обработки проводили один раз в день.

Подопытное животное:

Вид: Rattus norvegicus

Линия: Крыса Sprague-Dawley (Crl:CD^® (SD) BR VAF/Plus )

Пол: самка

Возраст: В начале дозирования, крысы имели возраст приблизительно 10-12 недель.

Содержание и уход

a) Содержание:

На протяжении периода акклиматизации и периода исследования крысы содержались в клетках из нержавеющей стали, каждая отдельно.

b) Температура и влажность:

Условия окружающей среды (температура, влажность) в помещении для крыс находились под непрерывным контролем, используя автоматическую оснащенную вычислительной техникой систему. Заданными условиями были температура: 22 ± 3°С и относительная влажность: 50 ± 20%.

c) Цикл чередования света и темноты:

Фотопериодический цикл составлял 12 часов света и 12 часов темноты. Эти параметры непрерывно регистрировались, используя сертифицированную автоматическую оснащенную вычислительной техникой систему. Освещение было с 07:15 до 19:15.

d) Рацион:

Сертифицированный корм для грызунов (Lab Diet ft 5002, гранулы) и водопроводная вода предоставлялись ad libitum. Крысы голодали (с доступом только к воде) вечер перед вскрытием.

Рандомизация;

Крыс распределяли по группам статистически во время периода акклиматизации:

Методы и план эксперимента

Группы для испытаний:

Сто двадцать крыс были распределены в 8 групп по 15 животных, каждая, для проведения исследования, описанного в общих чертах ниже:

Обработка	Суспензии для дозирования, вводимые перорально		Растворы для дозирования, применяемые местно		LHRH-A (Инъецируемый п. к.)
	Доза (мг/кг)	Об./крыса (мл)	Доза (мг/кг)	Об./крыса (мл)	Доза, 1 мкг/крыса
Интактные	-	0,5	-	0,5	-
ЕМ-652.HCl	2,5	0,5	-	0,5	-
ДГЭА	-	0,5	100	0,5
ДГЭА + ЕМ-652.HCl	2,5	0,5	100	0,5	-
LHRH-A	-	0,5	-	0,5	0, 5 мл
LHRK-A + ЕМ-652.HCl	2,5	0,5	-	0,5	0, 5 мл
LHRH-A + ДГЭА	-	0,5	100	0,5	0,5 мл
LHRH-A + ДГЭА + ЕМ-652.HCl	2,5	0,5	100	0,5	0, 5 мл

Приготовление образцов для испытания

LHRH-A доступен в растворе при концентрации 1,0 мг/мл. Этот концентрированный раствор разбавляется (чтобы получить конечную концентрацию 0,002 мг/мл), используя нижеследующий наполнитель: 0,3% хлорид натрия и 0,25% одноосновной фосфат натрия, моногидрат в воде. Для доведения значения рН 5,6-6,2 использовали гидроксид натрия (водный).

Суспензии/растворы для дозирования готовили каждые две недели с учетом самого последнего значения массы тела (среднее для группы), кроме LHRH-A раствора. Для ЕМ-652.HCl, вводимого перорально, к испытываемому соединению, предварительно взвешенному в стеклянной бутылке, добавляли наполнитель (0,4% метилцеллюлозы), по крайней мере, за 48 часов до первого дня дозирования. Чтобы гарантировать гомогенность суспензии для дозирования, ее перемешивают, по крайней мере, на протяжении 48 часов при температуре от 2 до 8°С. Суспензию для дозирования хранят при температуре 2-8°С. Для раствора ДГЭА, применяемого местно, к ДГЭА добавляют этанол и смесь перемешивают до растворения ДГЭА. Затем добавляют полипропиленгликоль и раствор перемешивают до достижения его гомогенности. Раствор для дозирования хранят при температуре от 2 до 8°С (часть раствора можно хранить при комнатной температуре, чтобы облегчить местное применение на животном). Для раствора LHRH-A, инъецируемого подкожно, каждый месяц осуществляют разбавление концентрированного раствора, используя соответствующий наполнитель. Раствор для дозирования хранят при температуре 2-8°С.

Подготовка животных:

До дня введения первой дозы и по мере необходимости на протяжении исследования, участок дорсальной кожи (приблизительно 5×5 см) бреют для местного нанесения ДГЭА.

Дозирование:

Введение испытываемых соединений или наполнителя начинают на день 1 исследования по протоколу. Испытываемые соединения давали в виде суспензии в 4% метилцеллюлозе при помощи перорального катетера (0,5 мл/катетер/крыса) один раз в день или применяли местно в смеси 50% этанол - 50% пропиленгликоль (0,5 мл/нанесение/крыса) один раз в день. Кроме того, крысы групп 5-8 обычно получали LHRH-A один раз в день подкожной инъекцией (0,5 мл/инъекция/крыса). Крысы, не получавшие испытываемое соединение перорально и/или местно, обычно получали только соответствующий наполнитель.

Измерение жира тела:

Состав тела определяли, оценивая полную структуру тела и правое бедро животного, находящегося под наркозом под действием изофлурана, используя двухуровневую рентгеновскую абсорбциометрию (DEXA; QDR 4500A, Hologic), во время периода акклиматизации и спустя 6 месяцев после лечения.

Результаты

Таблица 4
Обработка	ЖИР (%)
Интактные	231±16
ЕМ-652.HCl	191+14
ДГЭА	202+23
ДГЭА + ЕМ-652.HCl	188±13
LHRH-A	364+22
LHRH-A + ЕМ-652.HCl	312±20
LHRH-A + ДГЭА	274±21
LHRH-A + ДГЭА + ЕМ-652.HCl	250+17

Пример 6

Эффект 20-дневного воздействия ЕМ-652.HCl, эстрадиола и ДГЭА на параметры жира тела и массы тела у овариэктомированных крыс-самок URMA-r-27-00

Цель данного исследования заключалась в оценке действия на параметры жира тела и массы тела ЕМ-652.HCl, эстрадиола и ДГЭА, вводимых перорально, каждый в отдельности, или в комбинации, овариэктомированным (OVX) крысам-самкам, получающим обогащенный углеводами рацион.

Подопытное животное:

Вид: Rattus norvegicus

Линия: Крыса Sprague-Dawley (Crl:CD ^® (SD) BR VAF/Plus )

Пол: самка

Масса тела: На начало дозирования, массы тела составляли приблизительно 200-250 г. Содержание и уход

a) Содержание:

Крысы содержались в клетках из нержавеющей стали, каждая отдельно, на протяжении периода акклиматизации и периода исследования.

b) Температура и влажность:

Условия окружающей среды (температура, влажность) в помещении для крыс непрерывно регистрировали, используя автоматическую оснащенную вычислительной техникой систему. Заданными условиями были температура: 22 ± 3°С и относительная влажность: 50 ± 20%.

c) Цикл чередования света и темноты:

Фотопериодический цикл составлял 12 часов света и 12 часов темноты. Эти параметры непрерывно регистрировались, используя сертифицированную автоматическую оснащенную вычислительной техникой систему. Освещение было с 07:15 до 19:15.

d) Рацион:

Сертифицированный корм для грызунов (Lab Diet и 5002, гранулы) и водопроводная вода предоставлялись ad llbltum на протяжении периода акклиматизации. Во время периода исследования, крысы получали обогащенный углеводами рацион ad libitum. Обогащенный углеводами рацион (рацион #3) состоял из (г/100 г): кукурузный крахмал 31,2; декстроза 31,2; казеин 20,0; кукурузное масло 6,4; dl-метионин 0,3; витаминная смесь 1,0; минеральная смесь AIN-76 4,9; волокно 5,0.

За день до аутопсии, крысы голодали (с доступом только к воде) до конца полудня (приблизительно 16.00 ч).

Рандомизация:

Крыс распределяли по группам статистически на день 0 исследования. Методы и план эксперимента

Группы для испытаний:

80 крыс были распределены в 8 групп по 10 крыс, каждая, для проведения исследования, описанного в общих чертах ниже:

Обработка	Суспензии для дозирования
	Доза (мг/крыса)	Об./крыс а (мл)
Интактные	0	0,5 мл
OVX	0	0,5 мл
OVX + ЕМ-652.HCl	0,5	0,5 мл
OVX+E2	0,5	0,5 мл
OVX + ДГЭА	100	0,5 мл
OVX + ЕМ-652.HCl + ДГЭА	0,5 +100	0 5 мл +0,5 мл
OVX + ЕМ-652.HCl + Е2	0,5 +0,5	0,5 мл + 0,5 ml

Подготовка животных:

На день 0 исследования крыс групп 2-8 подвергали овариэктомии, при помощи двустороннего бокового разреза, в условиях анестезии, индуцированной изофлураном. Крыс группы 1 подвергали фиктивной операции.

Дозирование:

Введение испытываемых продуктов или наполнителя начинали на день 1 исследования (день после овариэктомии). Испытываемые соединения давали в виде суспензии в 0,4% метилцеллюлозе при помощи перорального катетера (0,5 мл/катетер) на протяжении 20 дней.

Измерение состава тела:

Чтобы оценить эффект от обработки на процентное содержание жира, на день 21 исследования (до аутопсии) определяли состав тела, оценивая полную структуру тела животных, находящихся под наркозом под действием изофлурана, используя двухуровневую рентгеновскую абсорбциометрию (DEXA; QDR 4500A, Hologic).

Извлекаемые органы и ткани

Извлекали и взвешивали правую и левую забрюшинную жировую ткань.

Результаты

Таблица 5
Обработка	Жир, %	Забрюшинная жировая ткань; г
Интактные	15,7±0,8	2,20±0,20
OVX	18,9±1,5	3,70+0,41
OVX + SM-652.HCl	10,2±1,2	1,52+0,18
OVX + Е2	10,3±0,6	0,81+0,17
OVX + ДГЭА	7,8±0,8	0,92±0,17
OVX + ЕМ-652.HCl + ДГЭА	8,4+0,9	1,15+0,17
OVX EM-652.HCl + Е2	10,4±0,7	1,17±0,19

Пример 7

Эффект 34-недельного воздействия этинилэстрадиолом, ЕМ- 652. HCl, ралоксифеном и ДГЭА на параметры жира тела и массы тела овариэктомированных крыс-самок URMA-r-42-98

Цель данного исследования состояла в оценке действия комбинированного лечения ЕМ - 652. HCl и ДГЭА на параметры жира тела и массы тела овариэктомированных крыс. Для этой цели овариэктомированным крысам ежедневно вводили ЕМ - 652. HCl (1 мг/кг) и ДГЭА (80 мг/кг), по отдельности или в комбинации, на протяжении 34 недель. ЕМ - 652. HCl вводили перорально, в то время как ДГЭА наносили местно на дорсальную кожу. Одну группу животных обрабатывали перорально 17 -этинилэстрадиолом (0,1 мг/кг) и Ралоксифеном (ЕМ - 1105; 1 мг/кг) для сравнения.

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Животные и лечение

Были использованы крысы-самки линии Sprague-Dawley (Crl:CD(SD)Br) возраста от десяти до двенадцати недель, весом приблизительно 235-250 г на начало лечения. Восемьдесят крыс были распределены статистически в 7 групп по 11-12 животных на группу следующим образом: 1) интактный контроль; 2) OVX контроль; 3) OVX + EE₂; (0,1 мг/кг); 4) OVX + Ралоксифен (1 мг/кг); 5) OVX + ЕМ - 652. HCl (1 мг/кг); 6) OVX + ДГЭА (80 мг/кг); 7) OVX + EM-652. HCl + ДГЭА. На день 1 исследования животных соответствующих групп подвергали двусторонней овариэктомии (OVX) под наркозом под действием изофлурана. ЕМ - 652. HCl, Ралоксифен и ЕЕ₂ (Стералоиды) вводили один раз в день при помощи перорально го катетера в виде суспензии в 0,4% метилцеллюлозе (0,5 мл/крыса) в течение 34 недель, в то время как ДГЭА наносили местно один раз в день на дорсальную кожу в виде раствора в смеси 50% этанол-50 % пропиленгликоль (0,5 мл/крыса) на протяжении такого же периода времени. Спустя приблизительно 24 часа после последнего дозирования, лишенных пищи на протяжении ночи животных забивали обескровливанием через абдоминальную аорту в условиях наркоза под действием изофлурана. Извлекали левую и правую забрюшинные жировые ткани и взвешивали.

Измерение состава тела

После 34-недельной обработки у индивидуальных крыс под наркозом изофлураном путем сканирования оценивали полную структуру тела, используя двухуровневую рентгеновскую абсорбциометрию (DEXA; QDR 4500A, Hologic, Waltham/ MA) программное обеспечение сканирования области тела с высоким разрешением. Определяли структуру тела (включая процент жира).

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± SEM.

Результаты

Таблица 6
Обработка	Правая забрюшинная жировая ткань, г	Левая забрюшинная жировая ткань, г	Жир, %
Иктактный контроль	1,43+0,12	1,80+0,26	25,7±2,5
OVX контроль	2,53±0,24	2,64±0,18	42,1±1,5
OVX + ЕЕ2 (0,1 мг/кг)	1,29±0,22	1,15±0,18	19,8±1,9
OVX-Ралоксифен (1 кг/кг)	1,2±0,12	1,41±0,13	22,8±1,6
OVX + ЕМ-652.HCl (1 мг/кг)	2,07±0,18	2,19±0,2В	27,7+1,8
OVX + ДГЭА (SO мг/кг)	2,16±0,25	1,98±0,17	26,8±2,3
OVX + ЕМ-652.HCl + ДГЭА	1,62+0,18	1,47±0,18	25,1±1,8

Пример 8А

Действие ЕМ - 652. HCl на энергетический баланс, липид-липопротеиновый метаболизм тощих и тучных крыс-самцов линии Zucker. URMA-r-61-99

Цель данного исследования заключалась в обнаружении действия ЕМ - 652. HCl на энергетический баланс и липид-липопротеиновый метаболизм тощих и тучных (жирных) крыс-самцов линии Zucker. Для этой цели ЕМ - 652. HCl (2,5 мг/кг) вводили перорально (через катетер) один раз в день на протяжении 14 дней интактным тощим и тучным крысам-самцам Zucker.

Подопытное животное:

Вид: Ruttus norvegicus

Линия: Zucker

Пол: самец

Масса тела: В начале дозирования массы тела составляли приблизительно: тощие крысы: 175 ± 15 г; тучные крысы: 235 ± 15 г

Акклиматизация

Крыс акклиматизировали к лабораторным условиям, по крайней мере, на протяжении пяти дней до начала эксперимента.

Содержание и уход

а) Содержание:

Крыс помещали индивидуально в клетки из нержавеющей стали стандартной конструкции на период акклиматизации и период проведения исследования.

b) Температура:

Температура в помещении для крыс регистрировалась ежедневно. Установленная температура составляла 22 ± 3°С.

c) Цикл чередования света и темноты:

Фотопериодический цикл составлял 10 часов света и 14 часов темноты. Освещение начиналось в 07:00 и прекращалось в 17:00.

d) Рацион:

Во время периода акклиматизации крысы получали коммерческий рацион для грызунов (Purina, # 5075) и водопроводную воду ad libitum. Во время периода исследования крысы получали следующий рацион (рацион #3), состоящий из (г/100 г): крахмал 31,2; декстроза, 31,2; казеин 20,0; кукурузное масло 6,4; dl-метионин 0,3; витаминная смесь 1,0; минеральная смесь AIN-76 4,9; волокно 5,0.

Крысы голодали (с доступом только к воде) приблизительно до 07.00 ч, утром в день их вскрытия.

Рандомизация:

За день до первого дня дозирования крыс взвешивали и распределяли по группам так, чтобы получить группы животных с эквивалентной средней массой тела.

Методы и план эксперимента

Группы для испытаний:

Шестнадцать тощих и шестнадцать тучных интактных крыс были распределены в 4 группы по 8 крыс, каждая, для проведения исследования, описанного в общих чертах ниже:

Число крыс /группа	Состояние крысы	Лечение	Доза (мг/кг)
8	Тощая	ЕМ-652.HCl	2,5
8	Жирная	ЕМ-652.HCl	2,5
8	Тощая	КОНТРОЛЬ	0
8	Жирная	КОНТРОЛЬ	0

Дозирование:

Введение испытываемого соединения или наполнителя начинали на день 1 исследования. Испытываемое соединение ЕМ-652.HCl давали в виде суспензии в 0,4% метилцеллюлозе при помощи перорального катетера (0,5 мл/катетер/крыса) один раз в день на протяжении 14 дней. Крысы из контрольных групп получали только наполнитель (0,5 мл/катетер/крыса) на протяжении такого же периода времени.

Массы тела:

Во время периода акклиматизации животные были взвешены за день до начала дозирования для рандомизации. Затем крыс взвешивали в первый день дозирования и каждые 2 дня после этого, а также в день вскрытия. Массы тела регистрировались с точностью 1 г.

Потребление (расход) корма:

Потребление корма оценивали каждые 2 дня на протяжении периода исследования.

Способ умерщвления:

После приблизительно 6-часового периода голодания животных подвергали аутопсии (приблизительно 30 часов после последнего дозирования). Их анестезировали кетамин-ксилазином и отбирали кровь кардиальной пункцией.

Пробы крови:

Липиды (суммарный холестерин (ХОЛ, CHOL) и триглицериды (ТГ, TG)) и глюкозу в крови измеряли в замороженных пробах плазмы, используя Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911 Анализатор (Boehringer Mannheim Лабораторные системы диагностики). Циркулирующие гормоны и субстраты определяли в замороженных пробах плазмы, используя следующие наборы:

Лептин: набор для PMA(RIA) Linco

Инсулин: набор для PMA(RIA) Linco Извлекаемые органы и ткани

Кусочек печени (˜1 г) замораживали в жидком азоте для последующего определения содержания ТГ и ХОЛ (метод Фолча (Folch's)). Извлекали забрюшинную жировую ткань и камбаловидную мышцу и замораживали в жидком азоте для последующего определения активности липопротеинлипазы (ЛПЛ, LPL). Извлекают вентральную простату, яички и семенные везикулы. Взвешивают простату, яички (правое и левое вместе) и правую семенную везикулу (без жидкости). Правые семенные везикулы отбрасывают.

Таблица 7 Крысы-самцы линии Zucker
ГРУППА		Масса	Активность липопротеинлипазы Белая забрюшинная жировая ткань	Активность липопротеинлипаэы камбаловидной мышцы	Инсулин плазмы	Глюкоза плазмы	Общее содержание холестерина	Триглицериды плазмы
фенотип	обработка	г	мкЕ/г белка	мкЕ/г белка	нмоль/л	ммоль/л	ммоль/л	ммоль/л
тощий	контроль	73,0±4,2	2066±353	71,7±7,9	0,095± 0,025	10,74± 0,87	2,10±0,15	1,47±0,20
тощий	ЕМ-652.HCl 2,5 мг/кг	44,9±3,5	1701±348	69,5±8,4	0,062± 0,005	9,35± 0,51	1,18±0,09	1,52±0,13
тучный	контроль	110,5±6,7	7233± 511	51,9±8,8	1,092+ 0,369	11,06+ 0,84	3,07±0,28	4,21±0,78
тучный	ЕМ-652.HCl 2,5 мг/кг	71,6±3,3	70461 1185	58,1±4,6	0,475± 0,087	11,84± 0,62	2,28±0,25	7,16±1,06

Пример 8В

Действие ЕМ-652.HCl на энергетический баланс и липид-липопротеиновый метаболизм тощих и тучных крыс-самок линии Zucker. LRMA-r-47-99

Цель данного исследования состояла в определении действия ЕМ-652.HCl на энергетический баланс и липидлипопротеиновый метаболизм тощих и тучных (жирных) крыс-самок линии Zucker. Для этой цели интактным тощим и тучным крысам-самкам линии Zucker вводили ЕМ-652.HCl (2,5 мг/кг) перорально (катетер) один раз в день на протяжении 14 дней.

Спецификация подопытных животных:

Вид: Ruttus norvegicus

Линия: Zucker

Пол: самка

Масса тела: В начале дозирования массы тела составляли приблизительно: тощие крысы: 114 ± 2 г; тучные крысы: 182 ± 6 г

Акклиматизация:

Крыс акклиматизировали к лабораторным условиям, по крайней мере, на протяжении пяти дней до начала эксперимента.

Содержание и уход

а) Содержание:

Крыс помещали индивидуально в клетки из нержавеющей стали стандартной конструкции на период акклиматизации и период проведения исследования.

b) Температура:

Температура в помещении для крыс регистрировалась один раз в день. Установленная температура составляла 22 ± 3°С.

c) Цикл чередования света и темноты:

Фотопериодический цикл составлял 10 часов света и 14 часов темноты. Освещение начиналось с 07:00 и прекращалось в 17:00.

d) Рацион:

Во время периода акклиматизации крысы получали коммерческий рацион для грызунов (Purina, # 5075) и водопроводную воду ad libitum. Во время периода исследования крысы получали нижеследующий рацион (рацион #3), состоящий из (г/100 г): крахмал 31,2; декстроза 31,2; казеин 20,0; кукурузное масло 6,4; dl-метионин 0,3; витаминная смесь 1,0; минеральная смесь AIN-76 4,9; волокно 5,0. Крысы голодали (с доступом только к воде) примерно до 07.00 ч, утром в день вскрытия.

Рандомизация:

За два дня до первого дня дозирования крыс взвешивали и распределяли по группам так, чтобы получить группы животных с эквивалентной средней массой тела.

Методы и план эксперимента

Группы для испытаний:

Шестнадцать тощих и шестнадцать тучных интактных крыс-самок были распределены в 4 группы по 8 крыс, каждая, для проведения исследования, описанного в общих чертах ниже.

Число крыс/группа	Состояние крысы	Обработка	Доза (мг/кг)
8	Тощая	ЕМ-652.KCl	2,5
8	Жирная	ЕМ-652.HCl	2,5
8	Тощая	КОНТРОЛЬ	0
8	Жирная	КОНТРОЛЬ	0

Дозирование:

Введение испытываемого соединения или наполнителя начинали на день 1 исследования. Испытываемое соединение ЕМ - 652. HCl давали в виде суспензии в 0,4% метилцеллюлозе при помощи перорального катетера (0,5 мл/катетер/крыса) один раз в день на протяжении 14 дней. Крысы из контрольных групп получали только наполнитель (0,5 мл/катетер/крыса) на протяжении такого же периода времени.

Массы тела:

Во время периода акклиматизации животные были взвешены за два дня до начала дозирования для рандомизации. Затем крыс взвешивали в первый день исследования и каждые 2 дня во время периода исследования, а также в день вскрытия. Массы тела регистрировали с точностью 1 г.

Потребление (расход) корма:

Потребление корма оценивали каждые 2 дня на протяжении периода исследования.

Способ умерщвления:

После приблизительно 6-часового периода голодания животных подвергали аутопсии (приблизительно через 30 часов после последнего дозирования). Их анестезировали кетамин-ксилазином и извлекали кровь кардиальной пункцией.

Пробы крови

Липиды (суммарный холестерин (ХОЛ, CHOL) и триглицериды (ТГ, TG)) и глюкозу в крови измеряли в замороженных пробах плазмы, используя Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911 Анализатор (Boehringer Mannheim Лабораторные системы диагностики). Циркулирующие гормоны и субстраты (лептин, инсулин, кортикостерон) определяли в замороженных образцах плазмы, используя следующие наборы:

Лептин: набор для РИА(RIA) Linco

Инсулин: набор для РИА(RIA) Linco Извлекаемые органы и ткани

Печень извлекали и взвешивали. Кусочек печени (˜ 1 г) замораживали в жидком азоте для последующего определения содержания ТГ и ХОЛ (метод Фолча). Извлекали надпочечники, взвешивали (левый и правый вместе) и отбрасывали. Извлекали матку и яички, взвешивали и хранили в 10% буферном формалине для дальнейшей гистологической экспертизы. Левый и правый яичники (без маточной трубы) взвешивали вместе.

Таблица 8 Крысы-самки штамма Zucker
ГРУППА		Масса	Активность липопротеинлипазы Белая забрюшинная жировая ткань	Активность липопротеинлипазы камбаловидной мышцы	Инсулин плазмы	Глюкоза плазмы	Общее со держание холестерина	Триглицериды плазмы
фенотип	обработка	г	мкЕ/г белка	мкЕ/г белка	нмоль/л	ммоль/л	ммоль/л	ммоль/л
тощий	контроль	175±4	1586±155	55,8±8,1	0,122± 0,022	9,45±0,68	2,33±0,10	1,25±0,16
тощий	ЕМ - 652.HCl 2,5 мг/кг	154±5	134 9±246	60,8±11,1	0,063± 0,012	9,60±0,41	1,57±0,14	0,83±0,07
тучный	контроль	313±9	3980± 327	36,9±8,6	0,410± 0,033	10,63+0,55	4,83+0,2-7	12,51±3,25
тучный	ЕМ - 652.HCl 2,5 мг/кг	291±9	3819± 485	36,6±7,1	0,515± 0,091	11,7±0,47	2,37±0,97	22,20±4,44

Пример 9

Действие ЕМ - 652. HCl и ДГЭА, вводимых, каждый в отдельности или в комбинации, на энергетический баланс и липид-липопротеиновый метаболизм у крыс.

URMA-r-03-99

Цель данного исследования заключалась в обнаружении действия ЕМ - 652. HCl и ДГЭА, вводимых каждый в отдельности или в комбинации, на энергетический баланс и липид-липопротеиновый метаболизм у крыс. Эффект действия оценивали по многим параметрам после 20-дневного воздействия ЕМ - 652. HCl (0,5 мг/крыса -2,5 мг/кг, per os) и ДГЭА (20 мг/крыса, ˜100 мг/кг, местное применение), вводимых каждый в отдельности или в комбинации, интактным (ИНТ, (INT)) и овариэктомированным (OVX) крысам-самкам, получавшим рацион с высоким содержанием сахарозы и высоким содержанием жира. Для сравнения, одна интактная и овариэктомированная контрольная группа получает обогащенный рацион, в то время как другие контрольные животные (интактные и OVX) обычно получают коммерческий рацион для грызунов.

Животное для испытания:

Вид: Rattus norvegicus

Линия: Крыса Sprague-Dawley (Crl:CD® (SD) BR VAF/Plus**)

Пол: самка

Масса тела: В начале дозирования массы тела составляли приблизительно 190-220 г.

Акклиматизация:

Крыс акклиматизировали к лабораторным условиям, по крайней мере, на протяжении пяти дней до начала эксперимента.

Содержание и уход

a) Содержание:

Крыс помещали индивидуально в клетки из нержавеющей стали стандартной конструкции на период акклиматизации и период проведения исследования.

b) Температура:

Температуру в помещении для крыс регистрировали один раз в день. Установленная температура составляла 22 ± 3°С.

c) Цикл чередования света и темноты:

Фотопериодический цикл составлял 10 часов света и 14 часов темноты. Освещение начинали с 06:00 и прерывали в 16:00.

d) Рацион:

Во время периода акклиматизации крысы получали коммерческий рацион для грызунов (Purina, # 5075) и водопроводную воду ad libitum. Во время периода исследования группы 1 и 2 обычно продолжали получать коммерческий рацион, в то время как группы 3-10 обычно получали рацион с высоким содержанием сахарозы и высоким содержанием жира, состоящий из (г/100 г): сахарозы 45; кукурузного масла 10; топленого свиного жира 10; казеина 22,5; dl-метионина 0,3; витаминной смеси 1,2; минеральной смеси AIN-76 5,5; волокна 5,5.

Крысы голодали (с доступом только к воде) примерно с 22.00 ч ночи до вскрытия.

Рандомизация:

Спустя несколько дней после их прибытия, крыс взвешивали и распределяли по группам так, чтобы получить группы животных с эквивалентной средней массой тела.

Способы и план эксперимента

Группы для испытаний:

80 крыс были распределены в 10 групп по 8 крыс, каждая, для проведения исследования, описанного в общих чертах ниже:

Рацион	Обработка	Доза (мг/крыса)
		Per os	Местно
Корм1	ИНТ	0	0
	OVX ИНТ	0 0	0 0
	ИНТ + ЕМ-652.HCl	0,5	0
Специальный рацион 2	ИНТ + ДГЭА	0	20
	ИНТ + ЕМ-652.HCl + ДГЭА OVX OVX + ЕМ-652.HCl	0,5 0	20
		0,5	0
	OVX + ДГЭА	0	20
	OVX + ЕМ-652.KCl + ДГЭА	0,5	20

¹: Коммерческий корм для грызунов

²: Рацион с высоким содержанием сахарозы и высоким содержанием жира

Подготовка животных:

На день 0 исследования крыс из соответствующих групп подвергали овариэктомии (двусторонним боковым разрезом) под наркозом под действием изофлурана. Интактных крыс подвергали фиктивному оперированию.

Дозирование:

Введение испытываемых соединений или наполнителя начинали на следующий день после овариэктомии (День 1). Испытываемое соединение ЕМ-652.HCl давали в виде суспензии в 0,4% метилцеллюлозе при помощи перорального катетера (0,5 мл/катетер/крыса) один раз в день на протяжении 20 дней, в то время как ДГЭА применяли местно на дорсальную кожу (0,5 мл/нанесение/крыса) один раз в день на протяжении такого же периода времени. Крысы из контрольных групп получали только наполнитель (per os или местно). Крыс забивали на день 21 исследования через приблизительно 24 часа после последнего дозирования.

Массы тела:

Крыс взвешивали на день 0 (оперативное вмешательство), каждые 2 дня на протяжении периода исследования и в день вскрытия. Массы тела регистрировали с точностью 1,0 г.

Потребление (расход) корма:

Потребление корма оценивали каждые 2 дня на протяжении периода исследования.

Способ умерщвления:

На день 21 исследования голодавших на протяжении ночи крыс забивали спустя приблизительно 24 часа после последнего дозирования. Их анестезировали кетамин-ксилазином и извлекали кровь пункцией сердца.

Пробы крови:

Липиды (суммарный холестерин и триглицериды в крови определяли в замороженных пробах сыворотки, используя Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911 Анализатор (Boehringer Mannheim Лабораторные системы диагностики). Циркулирующие гормоны и субстраты (инсулин, лептин, глюкозу) определяли в пробах сыворотки, как указано ниже:

Инсулин: набор для PMA(RIA) Linco

Глюкоза: Автоматический анализатор глюкозы Beckmann Лептин: набор для PMA(RIA) Linco

Извлекаемые органы и ткани

У всех животных извлекали и взвешивали нижеследующие ткани:

Мышца (камбаловидная и латеральная широкая мышца бедра (VLM)), жир (забрюшинный и паховый), сердце, бурая жировая ткань. Кроме того, обычно извлекают мозг.

Кусочек печени замораживали для последующего определения содержания ТГ и ХОЛ (метод Фолча), а другие ткани подвергали обработке для определения активности ЛПЛ (LPL). Удаляли матку (и яичники у интактных групп), сдирали оставшийся жир, взвешивали и хранили в 10% буферном формалине.

Результаты

Таблица 9
ГРУППА		Общая масса	Белая жировая ткань паховая		Белая жировая ткань забрюшинная		Бурая жировая ткань
			масса	активность липопротеинлипаэы	масса	активность липопротеинлипазы	масса	активность липопротеинлипзы
рацион	Обработка	г	г	мкЕ/г белка	г	мкЕ/г белка	г	мк Е/г белка
корм	фикт. Контроль	239±6	0,410± 0,043	252±55	0,983± 0,104	1526± 217	0,329± 035	1053±138
корм	OVX контроль	294±6	0,888± 0,146	570±100	1,472± 0,199	2415± 147	0,466± 0,041	688±88
Сахароза + жир	фикт. Контроль	257±10	0,716± 0,107	344±73	1,765± 0,292	1470± 242	0,376± 0,033	1073±152
Сахароза + жир	фикт+ЕМ -652. HCl	238±5	0,435± 0,043	160±23	1,058± 0,162	1277±56	0,306± 0,044	1196±83
Сахароза + жир	Фикт + ДГЭА	252±5	0,659± 0,075	194±45	1,067± 0,149	1177± 188	0,373± 0,036	982±72
Сахароза + жир	Фикт + ЕМ - 652. HCl + ДГЭА	249±4	0,489± 0,083	224±45	0,909± 0,124	1349± 133	0,322± 0,026	885±78
Сахароза + жир	OVX контроль	316±8	1,800± 0,251	725±106	3,058± 0,297	2503± 215	0,519± 0,064	867±99
Сахароза + жир	OVX + ЕМ -652. HCl	268±5	0,709± 0,085	310±63	1,370± 0,211	1612± 186	0,408± 0,025	678±65
Сахароза + жир	OVX + ДГЭА	274±9	0,885± 0,156	583±134	1,699± 0,151	1905± 112	0,342± 0,049	1069±96
Сахароза + жир	OVX + ЕМ -652. HCl + ДГЭА	263±5	0,658± 0,088	306±42	1,436± 0,162	1542± 118	0,373± 0,040	876±75

ГРУППА		Камбаловидная мышца		Латеральная широкая мышца бедра		Печень
		масса	активность липопротеинлипаэы	масса	активность липопротеинлипазы	суммарный холестерин	триглицериды
рацион	лечение	г	мкЕ/г белка	г	мкЕ/г белка	ммоль/л	ммоль/л
Корм	фикт. контроль	0,106± 0,002	62,7± 3,0	0,872± 0,027	11,7± 3,5	0,076± 0,004	0,134± 0,019
Корм	OVX контроль	0,116± 0,005	43,8± 3,3	1,000± 0,042	13,1± 3,7	0,082± 0,004	0,16 9± 0,027
Сахароза + жир	фикт. контроль	0,096± 0,005	55,0± 5,1	0,927± 0,040	13,1± 3,2	0,083± 0, 002	0,123± 0, 014
Сахароза + жир	фикт. + ЕМ-652. HCl	0,098± 0,005	53,9± 3,3	0,965± 0,034	16,2± 3,1	0,096± 0, 011	0,360± 0,102
Сахароза + жир	фикт. + ДГЭА	0,105± 0,004	53,6± 7,5	0,893± 0,043	11,5+ 2,0	0,068± 0,003	0,038± 0,007
Сахароза + жир	фикт. + EM-652. HCl + ДГЭА	0,098± 0,005	56,6± 4,5	0,971± 0,029	19,5± 3,5	0,101± 0,008	0,184± 0,033
Сахароза + жир	OVX контроль	0,110± 0,004	39,2± 3,9	16037± 0,026	10,9± 1,82	0,097± 0,007	0,262± 0,052
Сахароза + жир	OVX + EM -652.HCl	0,104± 0,004	39,1± 5,0	0,944± 0,030	10,8± 3,2	0,092± 0,006	0,348± 0,078
Сахароза + жир	OVX+ДГЭА	0,103± 0,005	45,9± 4,7	0,920± 0,049	13,1± 5,4	0,079± 0,005	0,165± 0,047
Сахароза + жир	OVX+EM-652.HCl+ ДГЭА	0,101± 0,001	48,4± 4,8	0,929± 0,038	11,0± 4,1	0,106± 0,008	0,273± 0,031

ГРУППА		Инсулин плазмы	Глюкоза плазмы	Суммарный холестерин плазмы	Триглицериды плазмы	Лептин плазмы
рацион	лечение	нмоль/л	ммоль/л	ммоль/л	ммоль/л	нг/мл
Корм	фикт. контроль	0,071± 0,010	7,56+ 0,24	1,61± 0,17	0,49± 0,12	1,404± 0,224
Корм	OVX контроль	0,146± 0,027	8,69+ 0,57	2,10± 0,10	0,68± 0,10	2,388± 0,737
Сахароза + жир	фикт. контроль	0,079± 0,013	9,07± 0,48	1,60± 0,12	0,66± 0,17	3,572± 0,699
Сахароза + жир	фикт. + ЕМ- 652.HCl	0,057± 0,004	9,03± 0,49	1,15±0,06	0,60± 0,12	2,019± 0,402
Сахароза + жир	фикт. + ДГЭА	0,048± 0,012	8,05± 0,51	1,59+ 0,17	0,61± 0,11	1,977± 0,255
Сахароза + жир	фикт. + ЕМ- 652.HCl + ДГЭА	0,049± 0,013	7,99± 0,44	0,93± 0,08	0,95± 0,21	1,071± 0,162
Сахароза + жир	OVX контроль	0,125± 0,022	10,46± 0,72	1,62± 0,26	0,83± 0,13	7,900± 1,982
Сахароза + жир	OVX + EM-652.HCl	0,089± 0,013	9,06± 0,30	1,15± 0,11	0,97± 0,16	1,989± 0,326
Сахароза + жир	OVX + ДГЭА	0,052± 0,009	8,64± 0,24	1,57± 0,12	0,62± 0,08	2,757± 0,631
Сахароза + жир	OVX + EM-652.HCl +ДГЭА	0,060± 0,010	8,65± 0,38	0,87± 0,09	0,92± 0,21	1,672± 0,327

Пример 10

Действие ЕМ - 652. НС, TSE 424, Ласофоксифена, LY 353381 и Ралоксифена на энергетический баланс и липид-липопротеиновый метаболизм овариэктомированных крыс-самок. URMA-r-45-00

Цель данного исследования заключалась в обнаружении действия на энергетический баланс и липид-липопротеиновый метаболизм у крыс, подвергшихся обработке различными селективными модуляторами рецептора эстрогена, описанными в литературе, и в сравнении полученных результатов с результатами воздействия ЕМ - 652. HCl. Для этой цели испытываемые соединения вводили пероральным катетером на протяжении 20 дней (0,5 мг/крыса для каждого соединения; 0,5 мл/крыса) овариэктомированным крысам-самкам. Для сравнения использовали интактный контроль, овариэктомированный (OVX) контроль и OVX крыс, обработанных 17 -эстрадиолом (E₂).

Подопытное животное:

Вид: Rattus norvegicus

Линия: Крыса Sprague-Dawley (Crl:CD^® (SD) BR VAF/Plus )

Пол: самка

Масса тела: В начале дозирования массы тела составляли приблизительно 200-225 г.

Содержание и уход

а) Содержание:

Крыс помещали индивидуально в клетки из нержавеющей стали стандартной конструкции на период акклиматизации и период проведения исследования.

b) Температура:

Условия окружающей среды (температура, влажность) в помещении для крыс непрерывно регистрировались, используя автоматическую оснащенную вычислительной техникой систему. Заданными условиями были: температура 22 ± 3°С и относительная влажность 50 ± 20%.

c) Цикл чередования света и темноты:

Фотопериод составлял 10 часов света и 14 часов темноты. Освещение начинали в 07.15 и прерывали в 17.15.

d) Рацион:

Во время периода акклиматизации крысы получали сертифицированный рацион для грызунов (Lab Diet, # 5002, гранула) и водопроводную воду ad libitum, в то время как на протяжении периода исследования крысы получали рацион с высоким содержанием углеводов (рацион #3) и водопроводную воду ad libitum. Рацион состоял из (г/100 г): кукурузного крахмала 31,2; декстрозы 31,2; казеина 20,0; кукурузного масла 6,4; dl-метионина 0,3; витаминной смеси 1,0; минеральной смеси AIN-76 4,9; волокна, 5,0. Крысы голодали (с доступом только к воде) примерно до 07.00 ч в утро дня вскрытия.

Рандомизация:

Крыс распределяли по группам так, чтобы в каждой группе иметь животных с эквивалентной средней массой тела.

Способы и план эксперимента

Группы для испытаний:

Для проведения исследования, описанного в общих чертах ниже, семьдесят семь крыс были распределены в 8 групп по 9-10 крыс каждая.

Число крыс	Обработка	Суспензии дозирования
		Доза (мг/крыса)	Об./крыса (мл)
9	Интактный	0	0, 5 мл
9	OVX	0	0, 5 мл
10	OVX + EM-652.HCl	0,5	0, 5 мл
10	OVX + TSE 424 (EM - 3527)	0,5	0,5 мл
10	OVX + Ласофоксифен (ЕМ - 3555)	0,5	0,5 мл
10	OVX + LY 353381 (EM - 1665)	0,5	0, 5 мл
10	OVX + Ралоксифен (ЕМ - 1105)	0,5	0, 5 мл
9	OVX + E2	0,5	0,5 мл

Подготовка животных:

На день 0 исследования крыс из групп 2-8 подвергали овариэктомии (двусторонним боковым разрезом) под наркозом под действием изофлурана. Крыс из группы 1 подвергали фиктивному оперированию.

Массы тела:

Крыс взвешивали на день 0 (оперативное вмешательство) и затем каждые 2 дня на протяжении периода исследования, а также в день вскрытия.

Потребление корма:

Потребление корма оценивали каждые 2 дня.

Состав тела (процентное содержание жира)

Для того чтобы определить действие лечения на (процентное) содержание жира, определяли состав тела на день 17 исследования, используя двухуровневую рентгеновскую абсорбциометрию (DEXA; QDR 4500A, Hologic, Waltham, MA).

Способ умерщвления:

На день 21 исследования через приблизительно 24 часа после последнего дозирования и 6 часов голодания животных, находящихся под наркозом кетамин-ксилазина, забивали обескровливанием через абдоминальную аорту.

Пробы крови:

Липиды (суммарный холестерин и триглицериды) и глюкозу в крови определяли в замороженных пробах сыворотки, используя Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911 Анализатор (Boehringer Mannheim Лабораторные системы диагностики). Циркулирующие гормоны и субстраты (инсулин и лептин) определяли в пробе сыворотки, используя следующие наборы:

Инсулин: набор для РИА(RIA) Linco

Лептин: набор для РИА Linco

Извлекаемые органы и ткани

Извлекали и взвешивали нижеследующие ткани:

Мышца (правая камбаловидная и правая латеральная широкая мышца бедра (VLM)), жир (правая забрюшинная и правая паховая ткань), бурая жировая ткань, сердце, печень, матка и влагалище.

Кусочек печени (˜0,5 г) замораживали в жидком азоте для последующего определения содержания ТГ и ХОЛ (метод Фолча). Кусочки ˜0,1 г всех тканей (кроме матки и влагалища) замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С для последующего определения активности липопротеинлипазы (ЛПЛ/ LPL). Матку и влагалище хранили в 10% буферном формалине для последующей гистологической экспертизы. Тело животных помещали в металлическую коробку и хранили при -20°С до измерений энергетического баланса.

Результаты

Таблица 10
Обработка	Суммарная масса	Белая жировая ткань паховая		Белая жировая ткань забрюшинная		Бурая жировая ткань
		масса	активность липопротеинлипазы	масса	активность липопротеинлипазы	масса	активность липопротеинлипазы
	Г	г	мкЕ/г белка	г	мкЕ/г белка	г	мкЕ/г белка
Интактный	232±7	0,350± 0,037	379±69	1,31± 0,09	15371± 253	0,410± 0,030	973±115
OVX	284±5	0,320± 0,048	797±97	1,55± 0,15	2664± 338	0,380± 0,027	880±130
OVX + ЕМ -652. KCl	252±4	0,244± 0,028	684±216	1,32± 0,21	1917± 365	0,339± 0,038	900±91
OVX+ TSE 424	260±5	0,326± 0,042	766±173	1,27± 0,15	1750± 140	0,350± 0,019	1017±83
OVX + Ласофоксфен	210±2	0,187± 0,023	801±138	0,867± 0,132	1417± 163	0,244± 0,022	982±98
OVX + LY 353381	231±4	0,290± 0,038	5591165	0,968± 0,120	1365± 119	0,368± 0,031	888±65
OVX + Ралоксифен	230±3	0,245± 0,047	579±46	1,32± 0,24	1510± 52	0,307± 0,26	960±116
OVX+E2	198±4	0,158± 0,019	416±74	0,550± 0,102	1442± 243	0,211± 0,021	1198±62

Обработка	Кзмбаловидная мышца		Латеральная широкая мышца бедра
	масса	активность липопротеинлипазы	масса	активность липопротеинлипазы
	Г	Мк Е/г белка	г	мкЕ/г
Интактный	0,113±0,020	17,2±2,2	0,924±0,031	не опред.
OVX	0,108±0,006	17,6±3,9	0,963±0,045	не опред.
OVX + EM -652. HCl	0,118±0,018	14,5±4,1	1,00+0,047	не опред.
OVX+TSE424	0,100±0,004	11,7±1,9	0,993±0,33	не опред.
OVX+Ласофоксифен	0,096±0,003	10,9±1,5	0,800±3,048	не опред.
OVX+LY 353381	0,092+0,002	10,1±1,0	0,955±0,20	не опред.
OVX+Ралоксифен	0,099+0,003	10,2±2,0	0,795±0,055	не опред.
OVX + Е 2	0,086±0,003	10,9±2,0	0,718±0,026	не опред.

Обработка	Общее потребление корма	Инсулин плазмы	Глюкоза плазмы	Суммарный холестерин плазмы	Триглицериды плазмы	Лептин плазмы
	г	нмоль/л	ммоль/л	ммоль/л	ммоль/л	нг/мл
Интактный	332±14	0,086± 0,11	13,6± 10,7	2,41±0,16	0,62±0,07	2,46± 0,37
OVX	389±8	0,178± 0,030	15,9± 1,9	2,58±0,11	0,63±0,05	3,48± 0,40
OVX - EM-652.HCl	324±5	0,122± 0,021	15,9± 1,4	1,41±0,09	0,91±0,17	1,10± 0,22
OVX + TSE 424	347±9	0,113± 0,029	16,5± 2,7	1,66±0,16	0,93±0,24	2,12± 0,44
OVX+Ласофоксифен	283±1	0,095± 0,017	15,8± 1,32	1,29±0,06	0,81±0,21	0,97± 0,29
OVX+LY 353381	312±7	0,104± 0,11	17,1± 0,72	1,15±0,08	1,23+0,28	1,22± 0,21
OVX+Ралоксифен	307±8	0,077± 0,10	13,8± 1,2	1,19±0,08	1,20±0,35	1,39±0,30
OVX+E;	255±9	0,070± 0,007	11,8± 1,35	2,03±0,15	0,43±0,04	0,309± 0,097

Пример 11

Действие соединений изобретения, а также соединений предшествующего уровня техники на активность щелочной фосфатазы в Ishikawa клетках внутриматочной аденокарциномы человека.

Материалы

Поддержание чистых клеточных культур

Линия Ishikawa клеток человека, извлеченная из основательно дифференцированной внутриматочной аденокарциномы, была любезно предоставлена Dr. Eriio Gurpide, The Mount Sinai Medical Center, New York. NY. Ishikawa клетки, как заведено, поддерживают в минимальной поддерживающей среде Игла (MEM), содержащей 5% (об./об.) FBS (фатальная телячья сыворотка) и дополненной 100 Е/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,1 мМ неподдерживающим раствором аминокислот. Клетки высевают в флаконы Falcon Т75 при плотности 1,5 × 10⁶ клеток при 37°С.

Эксперименты с клеточными культурами

За двадцать четыре часа до начала эксперимента среду близких к конфлюэнтности Ishikawa клеток заменяют свежей, не содержащей эстрогена, базальной средой (EFBM), состоящей из смеси 1:1 (об./об.), не содержащей фенола красного Ham's F-12 среды и среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 100 Е/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глутамина и 5% FBS, дважды обработанной нагруженной декстраном угольной пылью, чтобы удалить эндогенные стероиды. Затем клетки собирают 0,1% панкреатином (Sigma) и 0,25 мМ HEPES, ресуспендируют в EFBM и высевают в 96-луночные плоскодонные титрационные микропланшеты Falcon при плотности 2,2 × 10⁴ клеток/лунка в объеме 100 мкл и дают возможность адгезировать к поверхности планшетов на протяжении 24 ч. После этого среду заменяют свежей EFBM, содержащей указанные концентрации соединений, в конечном объеме 200 мкл. Клетки инкубируют в течение пяти дней с заменой среды через 48 часов.

Анализ щелочной фосфатазы

В конце инкубационного периода титрационные микропланшеты переворачивают и питательную среду декантируют. Планшеты промывают 200 мкл на лунку PBS (0,15 М NaCl, 10 мМ фосфат натрия, рН 7,4). Затем PBS (ЗФР) удаляют с планшетов, осторожно оставляя небольшое количество остаточного ЗФР, и эту процедуру промывки повторяют еще раз. Затем забуференный фосфатом раствор соли декантируют и инвертированные планшеты осторожно промокают бумажной салфеткой. После замены покрытия планшеты выдерживают при -80°С в течение 15 мин с последующим оттаиванием при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем планшеты помещают на лед и добавляют 50 мкл охлажденного льдом раствора, содержащего 5 мМ п-нитрофенилфосфата, 0,24 мМ MgCl₂ и 1 М диэтаноламина (рН 9,8), Затем планшеты нагревают до комнатной температуры, и дают возможность развиться желтой окраске, связанной с получением п-нитрофенила (8 мин). Планшеты контролируют при 405 нм в спектрофотометре для прочтения планшетов твердофазного иммуноферментного анализа (BIO-RAD, model 2550 EIA Reader).

Вычисления

Кривые доза-ответ, а также значения IC₅₀ были вычислены, используя метод взвешенной итеративной нелинейной квадратичной регрессии.

Таблица 11
НАЗВАНИЕ	НАЗВАНИЕ КОДА	СТРУКТУРА	Стимулирование щелочной фосфатазы испытываемыми соединениями	Ингибирование щелочной фосфатазы, стимулированной 1 нМ E2 испытываемыми соединениями
			% от стимулирования 1 нМ Е2 * (число экспериментов)	IC 50 (нМ) (число экспериментов)
ЕМ - 652. HCl	ЕМ-652. HCl; ЕМ- 1538		1,88±0,26 (22)	1,52±0,22 (18)
ОН -Тамоксифен	ЕМ-882		32,4±2,2 (8)	31,9±6,0 (5)
ОН -Торемифен	ЕМ-880		2 9,6±2, 1 (6)	72,1±7,6 (3)
Идоксифен	ЕМ-750		25,1±1,5 (5)	> 1000 (2)
GW-5638	ЕМ-1796		7,75±5,5 (2)	Нет ингибировакия
Дролоксифен	ЕМ-835		23,8±3,1 (7)	291±115 (4)
ралоксифен LY 156758	ЕМ-1105		12, 8±1,7 (8)	3,39±0,9 (6)
LY 353381	ЕМ-1665		15,5±0,25 (5)	1,87±0,07 (2)
Ласофоксифен (свободное основание )	ЕМ-3114		17,9 (1)	4,24 (1)
TSE 424	ЕМ-3527		0,6 (1)	5,84 (1)

% стимулирования 1 нМ E ₂ = ОП 405 нм соединение- ОП 405 нм базальная/ОП 405 нм 1 нМ Е₂- ОП 405 нм базальная. См. также Labric et al. EM-652 (SCH 57068), а third generation SERM acting as pure antiestrogen in the mammary gland and endometrium, J. Steroid Biochem. and Mol. Bio. 69,51-84, 1999.

Пример 12

Действие EM-652.HCl и FCE 424 на пролиферацию клеточной линии MCF-7 рака молочной железы человека.

Способы

Поддержание чистой клеточной культуры

MCF-7 раковые клетки молочной железы человека получают из Американской коллекции типовых культур #HTB 22 при пассаже 147 и, как обычно, культивируют в не содержащей фенола красного среде Игла - Хема F12 в модификации Дульбекко, с вышеупомянутыми дополнениями и 5% FBS. Клеточную линию MCF-7 аденокарциномы молочной железы человека получают из плеврального выпота пациентки, 69-летней женщины. Используют клетки MCF-7 между пассажами 148 и 165 и пересеивают еженедельно.

Исследование пролиферации клеток

Клетки в их последней логарифмической фазе роста собирают 0,1% панкреатином (Sigma) и ресуспендируют в соответствующей среде, содержащей 50 нг бычьего инсулина/мл и 5% (об./об.) FBS, дважды обработанной нагруженной декстраном угольной пылью, чтобы удалить эндогенные стероиды. Клетки высевают в 24-луночные культуральные планшеты Falcon из пластика (2 см ²/лунка) при заданной плотности и дают возможность адгезировать к поверхности планшетов на протяжении 72 ч. После этого среду заменяют свежей средой, содержащей указанные концентрации соединений, разбавленных в 1000 раз относительно исходных растворов в 99% дважды перегнанном этаноле в присутствии или отсутствие E ₂. Контрольные клетки получали только этанольный наполнитель (0,1% EtOH, об./об.). Клетки инкубируют на протяжении определенных интервалов времени с заменой среды через интервалы в 2 или 3 дня. Число клеток определяли измерением содержания ДНК.

Вычисления и статистический анализ

Кривые доза-ответ, а также значения IC₅₀ рассчитывали, используя метод взвешенной итеративной нелинейной регрессии наименьших квадратов. Все результаты представлены как среднее ± SEM.

Таблица 12
Название	Название кода	Стимулирование ДНК испытываемыми соединениями	Ингибирование 1 нМ Е2 * стимулирования ДНК испытываемыми соединениями
		% от стимуляции 1 нМ Е2 *	IC50 (нМ)
ЕМ-652.HCl	ЕМ-652.HCl; ЕМ-1538	нет стимуляции	0,796
TSE 424	ЕМ-3527	нет стимуляции	3,68

Пример 13

Сравнительное действие на маточную массу, жир и липид ЕМ - 652. HCl, TSE 424 и Ласофоксифена, вводимых каждый в отдельности или в комбинации с ЕМ - 652. HCl, овариэктомированным крысам-самкам.

URMA-r-44-00

Цель данного исследования заключалась в сравнении влияния на маточную и влагалищную гистологию нижеследующего воздействия ЕМ - 652. HCl, TSE 424 и Ласофоксифеном, вводимых каждый в отдельности или в комбинации с ЕМ - 652. HCl, овариэктомированным крысам-самкам. Для этой цели каждое соединение вводят перорально на протяжении 20 дней овариэктомированным крысам-самкам и по окончании периода лечения извлекают матку и жир и взвешивают.

Спецификация подопытных животных:

Вид: Ruttus norvegicus

Линия: Крыса Sprague-Dawley (Crl:CD^® (SD) BR VAF/Plus )

Пол: самка

Масса тела: В начале дозирования, массы тела составляли приблизительно 225-250 г.

Содержание и уход

а) Содержание:

Крыс помещали индивидуально в клетки из нержавеющей стали стандартной конструкции на период акклиматизации и период проведения исследования.

b) Температура и влажность:

Условия окружающей среды (температура, влажность) в помещении для крыс непрерывно регистрировали, используя автоматическую оснащенную вычислительной техникой систему. Заданными условиями были: температура 22 ± 3°С и относительная влажность 50 ± 20%.

c) Цикл чередования света и темноты:

Фотопериодический цикл составлял 12 часов света и 12 часов темноты. Эти параметры непрерывно регистрировали, используя утвержденную автоматическую оснащенную вычислительной техникой систему. Освещение было с 07:15 до 19:15.

d) Рацион:

Сертифицированный корм для грызунов (Lab Diet # 5002, гранулы) и водопроводная вода предоставлялись ad libitum.

Рандомизация:

Крыс распределяли в каждую группу произвольно во время овариэктомии.

Группы для испытаний:

Семьдесят крыс распределяют в 7 групп по 9-11 животных каждая для проведения исследования, описанного в общих чертах ниже:

ОБРАБОТКА	СУСПЕНЗИИ ДЛЯ ДОЗИРОВАНИЯ Доза (мг/крыса)
Интактные	-
OVX	-
OVX + ЕМ-652.HCl	0,5
OVX + ЕМ-3527	0,5
OVX + ЕМ-652.HCl + ЕМ-3527	2,5 + 0,5
OVX + ЕМ-3555	0,5
OVX + ЕМ-652.HCl + ЕМ-3555	2,5 + 0,5

Подготовка животных:

Животных из групп 2-9 подвергали овариэктомии под наркозом, индуцированным изофлураном, на день 1 исследования.

Дозирование:

Наполнитель или испытываемые соединения давали в виде суспензии в 0,4% метилцеллюлозе при помощи перорального катетера (0,5 мл/катетер/крыса), начиная со дня 2 по день 21 исследования.

Массы тела:

Крыс взвешивали на день 1 исследования и при вскрытии (ДИ 22, SD 22).

Способ умерщвления:

Спустя 24 часа после последнего дозирования, голодавших на протяжении ночи крыс, находящихся под наркозом, индуцированным изофлураном, забивали кровопусканием через абдоминальную аорту.

Извлекаемые органы и ткани

Маточную и забрюшинную жировые ткани извлекают и взвешивают.

Таблица 13
Обработка	Конечная масса тела (г)	Забрюшинная жировая ткань (г)	Масса матки (мг)	Холестерин (ммоль/л)
Интакный	222±5**	1,04±0,13*	485,8±28,4**	1,52± 0,03**
OVX	266±5	1,42±0,24	152,9±4,7	1,9110,09
OVX+EM-652.HCl	238±4**	0,63±0,08**	173,0±7,1	1,00±0,11**
OVX+TSE 424	248±5**	0,84±0,09**	162,6±5,2	1,20±0,10**
OVX+TSE 424+ЕМ-652. HCl 12,5 мг)	241±1**	0,31±0,17**	180,2±5,2	0, 99±0,0**
OVX+Ласофоксифен	210±3**	0,52±0,05**	247,4±9,1**	0,95±0,09*
OVX+Ласофоксифен+ЕМ-652.HCl (2,5 мг)	234±3**	0,74±0,10**	182,3±4,6	0,95±0,07**

*р < 0,05; **р <0,001, экспериментальная группа против OVX контрольной.

ПРИМЕРЫ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ КОМПОЗИЦИЙ

В качестве примера, а не ограничения ниже приводятся несколько фармацевтических композиций, использующих предпочтительный активный SERM ЕМ-800 или ЕМ-652.HCl, каждый в отдельности или в комбинации с одним из предпочтительных активных предшественников полового стероидного гормона ДГЭА, андрост-5-ен-3b, 17b-диол 3-ацетата или андрост-5-ен-3b, 17b-диол дигемисукцината. Вместо (или в дополнение к) ЕМ-800 или ЕМ-652.HCl, ДГЭА, андрост-5-ен-3b, 17b-диол 3-ацетата или андрост-5-ен-3b, 17b-диол дигемисукцината могут быть использованы другие соединения данного изобретения или комбинация их. Концентрацию активного компонента можно варьировать в широком диапазоне, как дискутируется здесь. Количества и типы других компонентов, которые могут быть включены, общеизвестны в данной области.

Пример А

Предпочтительные СМРЭы (SERMs) данного изобретения вводят перорально.

Таблетка
Компонент	% мас. (от массы общей композиции)
ЕМ-652.HCl	5,0
Желатин	5,0
Лактоза	73,5
Крахмал	16,5

Пример В

Капсулы
Компонент	% мас. (от массы общей композиции)
ЕМ-652.HCl	5,0
Лактоза водная	80,0
Крахмал	4,8
Микрокристаллическая целлюлоза	9,8
Стеарат магния	0,4

Фармацевтическая композиция для комбинированной терапии

Пример С

Таблетка
Компонент	% мас. (от массы общей композиции)
ЕМ-652.HCl	5,0
ДГЭА	15,0
Желатин	5,0
Лактоза	58,5
Крахмал	16,5

Пример D

Желатиновая капсула
Компонент	% мас. (от массы общей композиции)
ЕМ-652.HCl	5,0
ДГЭА	15,0
Лактоза водная	65,0
Крахмал	4,8
Микрокристаллическая целлюлоза	9,8
Стеарат магния	0,4

ПРИМЕРЫ НАБОРОВ

В качестве примера, а не ограничения приводятся несколько наборов, использующих предпочтительный активный СМРЭ ЕМ-800 или ЕМ-652.HCl, и предпочтительный предшественник полового стероидного гормона ДГЭА, андрост-5-ен-3b, 17b-диол 3-ацетат или андрост-5-ен-3b, 17b-диол дигемисукцинат.

Вместо (или в дополнение к) ЕМ- 800 или ЕМ - 652. HCl, ДГЭА, андрост-5-ен-3b, 17b-диол 3-ацетата или андрост-5-ен-3b, 17b-диол дигемисукцината могут быть использованы другие соединения данного изобретения или их комбинация. Концентрацию активного(ых) компонента(ов) можно варьировать в широком диапазоне, как показывалось здесь. Количества и типы других компонентов, которые могут быть включены, общеизвестны в данной области.

Пример А

СМРЭ (SERM) данного изобретения вводят перорально, в то время как предшественник полового стероидного гормона вводят чрескожно.

Композиция на основе СМРЭ (SERM) для перорального введения (капсулы)
Компонент	% масс. (от массы общей композиции)
ЕМ-652.HCl	5,0
Лактоза водная	80,0
Крахмал	4,8
Микрокристаллическая целлюлоза	9,8
Стеарат магния	0,4

Композиция на основе предшественника полового стероидного гормона для местного применения (гель)
Компонент	% масс. (от массы общей композиции)
ДГЭА	10,0
Триглицерид гсаприловой - каприновой кислот (Neobee M-5)	5,0
Гексиленгликоль	15,0
Transcutol (монометиловый эфир диэтиленгликоля)	5,0
Бензиловый спирт	2,0
Циклометикон (Dow corning 345)	5,0
Этанол (абсолютный)	56,0
Гидроксипропилцеллюлоза (1500 сантипуаз) (KUJCEL)	2,0

Пример В

СМРЭ (SERM) и предшественник полового стероидного гормона вводят перорально

Композиция нестероидального антиэстрогена для перорального введения (капсулы)
Компонент	% мас. (от массы общей композиции)
ЕМ-652.HCl	5,0
Лактоза водная	80,0
Коахмал	4,8
Микрокристаллическая целлюлоза	5,8
Стеарат магния	0,4

Композиция предшественника полового стероидного гормона для перорального введения (желатиновые капсулы)
Компонент	% мас. (от массы общей композиции)
ДГЭА	15,0
Микрокристаллическая целлюлоза	84,6
Стеарат магния	0,4

В вышеупомянутых композициях ЕМ-800 или ЕМ-652.HCl можно заменить другими СМРЭами, а также ДГЭА, андрост-5-ен-3b, 17b-диол 3-ацетат или андрост-5-ен-3b, 17b-диол дигемисукцинат можно заменить другими ингибиторами полового стероидного гормона. Представленные выше рецептуры могут включать в себя больше, чем один СМРЭ, или больше, чем один предшественник, и в этом случае предпочтительно, чтобы объединенный массовый процент (по активному компоненту) соответствовал массовому проценту одного предшественника или одного СМРЭ, приведенного в вышеупомянутых примерах.

Данное изобретение было описано в виде предпочтительных вариантов осуществления и примеров и не ограничивается ими. Для специалистов в данной области очевиден более широкий диапазон применимости и объема данного изобретения, который ограничивается только прилагаемой здесь формулой изобретения.