модуль инактивации лейкоцитов (lim)

Формула изобретения

1. Применение лиганда, связанного с носителем, где лигандом является белок FasL или антитело против Fas-рецептора лейкоцитов, для изготовления модуля для уменьшения активности лейкоцитов при экстракорпоральном использовании.

2. Применение по п.1, где лиганд связан с медиатором связывания, связанным с носителем.

3. Применение по п.2, где медиатором связывания является клетка.

4. Применение по п.3, где медиатором связывания является клетка, а лигандом является белок FasL.

5. Применение по любому из пп.1-3, где указанный лиганд является антителом против рецептора лейкоцитов.

6. Применение по п.5, в котором указанный лиганд является антителом против белка Fas-лейкоцитов.

7. Способ уменьшения активности лейкоцитов путем контактирования с лигандами в модуле, охарактеризованном в любом из пп.1-6.

8. Способ по п.7, в котором лейкоциты после контактирования с указанными лигандами секретируют цитокины, и/или ферменты, и/или радикалы кислорода в меньшем количестве, чем перед контактированием.

9. Способ по п.6 или 7, в котором взаимодействие лиганда, связанного с клеткой, с рецептором лейкоцитов уменьшает активность лейкоцитов в переводе на аффинность связывания с данной клеткой.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к модулю инактивации лейкоцитов (МИЛ) и способу уменьшения активности лейкоцитов.

Уровень техники

Остро увеличивающаяся патологическая клеточная иммунная реакция часто встречается в различных клинических ситуациях. Примерами таких ситуаций являются:

- артериальный или венозный трубопровод аппарата "сердце-легкие" во время кардиохирургии;

- синдром системной иммунной реакции (SIRS) после множественных повреждений или сепсиса (септического шока);

- синдром дисфункции множественных органов (MODS) вследствие избыточной иммунной активности.

Во время вышеупомянутых хирургических вмешательств или клинических осложнений встречается нежелательная активация лейкоцитов, приводящая к тяжелым патологическим осложнениям у пациента. Во избежание этого, активированные лейкоциты (в частности, нейтрофилы) должны быть немедленно удалены из кровотока и инактивированы. В доступных в настоящее время лейкоцитарных фильтрах увеличенное количество активированных лейкоцитов отфильтровывают из крови. Однако все еще живые клетки продуцируют и секретируют патогенные вещества (нитокины, ферменты, радикалы кислорода и т.д.), которые ответственны за имеющий место патогенез. Имеются указания на то, что лейкоциты в фильтровальной сетке дополнительно активируются предположительно посредством механического стресса и посредством контакта клеток с чужеродной поверхностью. Например, фермент эластаза, продуцируемый активированными нейтрофилами, секретируется в более высоком количестве. Эластаза, по мнению прочего, действует на внеклеточный матрикс стенки сосуда и расщепляет контакты между эндотелиальными клетками, приводя к увеличенной проницаемости стенок сосудов, к отеку, к усиленному воспалению и т.п.

Апоптоз является одним из наиболее важных элементов регуляции иммунной системы. Апоптоз связанных с иммунной системой клеток приводит к нормализации активности иммунной системы после иммунного ответа, например, против микробных патогенов. Во время развития индивидуума иммунная система также должна убивать иммунные клетки, действующие на эндогенные структуры или на природные антигены из окружающей среды (например, в случае аутоиммунных заболеваний или аллергий). Т-клетки, активируемые посредством так называемых антигенпрезентирующих клеток (арс), обычно получают несколько порций информации. Антиген, обработанный арс, презентируется группой молекул MHC-I или MHC-II. Если аффинность Т-клеточного рецептора в отношении данного антигена является слишком слабой или отсутствуют костимулирующие сигналы (например, через молекулы адгезии), то клетка становится апоптотической. Другой существенный механизм, приводящий к апоптозу, начинается через путь Fas/FasL. В этом механизме например, эндотелиальные клетки стенок сосудов или другие эпителиальные клетки могут экспрессировать FasL, защищая таким образом данную ткань от вхождения в нее активированных иммунных клеток.

Раскрытие изобретения

Целью данного изобретения является обеспечение устройства, пригодного для уменьшения активности лейкоцитов с уменьшением посредством этого секреции патогенных веществ лейкоцитами. Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ уменьшения активности лейкоцитов с использованием такого устройства.

Авторы данного изобретения проводили исследования с инфицированными цитомегаловирусом ретинальными пигментными эпителиальными клетками из глаза человека и обнаружили, что, вследствие контакта с FasL эпителиальных клеток, активированные нейтрофилы теряли свою способность поддерживать или увеличивать адгезию с эпителиальными клетками. Было сделано предположение, что этот неожиданный результат является защитным механизмом эндотелия и соответствующей ткани против воспалительных событий. Функциональную утрату эффекторных механизмов нейтрофилов можно было наблюдать в пределах минут после межклеточного контакта, и, по-видимому, она в сильной степени не зависима от пути передачи апоптотического сигнала в нейтрофилах. На основании этих неожиданных открытий, например, путь Fas/FasL или другие более ранние ингибиторные механизмы эффекторных функций лейкоцитов могут быть использованы для экспериментального и клинического применения при острых избыточных иммунных реакциях.

Данное изобретение обеспечивает модуль для уменьшения активности лейкоцитов, который содержит носитель и лиганд, который связан с носителем, и является пригодным для взаимодействия с рецептором лейкоцитов. Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ уменьшения активности лейкоцитов при помощи указанного модуля.

Преимущество данного изобретения заключается в том, что после связывания активированных лейкоцитов в модуле инактивации лейкоцитов (МИЛ) повреждающая активность этих клеток ингибируется в пределах минут. Это обусловлено контактом специфических рецепторов на клеточной мембране лейкоцитов с соответствующими лигандами в МИЛ. Эти лиганды могут быть белками, индуцирующими, после контакта с рецептором на клеточной мембране, сигнал, который стимулирует лейкоциты к уменьшению секреторной активности и иммуногенности. Возможностью для достижения этого является индукция апоптоза через взаимодействия релевантного рецептора-лиганда, например, Fas/FasL.

Осуществление изобретения

Модуль данного изобретения пригоден для введения в кровоток пациента с использованием катетера Шелдона или в систему кровообращения в аппарате «сердце-легкие» (аппарат искусственного кровообращения).

Этот модуль предпочтительно состоит из изготовленного из пластика корпуса с диаметром, например, 10 см. Наконечник для входа крови и наконечник для выхода крови подогнаны к трубчатым соединениям аппарата искусственного кровообращения. В модуле содержится носитель, например, трехмерно уложенная полиэфирная мембрана с модифицированной поверхностью для адгезии активированных лейкоцитов и для их инактивации и убивания (например, индукцией апоптоза) посредством индуцированных рецептором сигналов. Материалом носителя может быть любой материал, который пригоден для связывания лигандов. Термин "связывание", применяемый здесь, включает в себя как ковалентное связывание, так и нековалентное связывание, например, ионное связывание, гидрофобные взаимодействия и аффинное связывание, лиганда с носителем. Кроме того, лиганд может быть связан прямо или непрямо (опосредованно) с носителем. Непрямое связывание включает в себя связывание через медиатор (посредник) связывания, например, длинноцепочечную молекулу для лучшей презентации лиганда, или через клетку, содержащую этот лиганд и связанную с носителем через другое связывающее взаимодействие.

МИЛ в соответствии с данным изобретением является пригодным для любых лейкоцитов, т.е. для В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, гранулоцитов, нейтрофилов.

Другие параметры этого модуля, определяющие кровоток, давление или реологические свойства, являются такими же, какие существуют в обычных лейкоцитарных фильтрах, которые уже используются клинически.

Пример 1.

Лунки 12-луночного культурального планшета выстилали полиэфирными мембранами (с размером пор 40 мкм) и инкубировали в течение ночи с различными концентрациями функционально активированного антитела IgM против Fas (CD95). Использовали следующие контроли:

- лунки без мембраны;

- лунки с мембраной без проведения предынкубации с антителом;

- лунки с мембраной с проведением предынкубации с посторонними антителами IgM.

Экспрессирующие Fas (Fas+) и имеющие делецию Fas (Fas-; не экспрессируют Fas на поверхности) клетки Jurkat в качестве тест-клеток добавляли в эти лунки в концентрации 1×10⁶/мл и выдерживали в течение 24 часов.

Степень апоптоза и степень некроза определяли количественно проточной цитометрией с использованием анализа связывания аннексина.

Результаты: Fas-клетки Jurkat не обнаруживали значимого увеличения связывающей способности аннексина V после культивирования в предобработанных лунках. В противоположность этому, значимая индукция апоптоза проявлялась в зависимости от концентрации IgM-антитела.

	Fas+	Fas-
0 нг	24,81%	24,29% (контроль)
10 нг	31,38%	27,57%
50 нг	40,95%	26,20%
100 нг	89,31%	29,65%

В упомянутых выше контролях не смогли обнаружить индукцию апоптоза. Сходные результаты получали со свежевыделенными нейтрофилами.

Чертеж показывает результаты этого примера данного изобретения.