устройство для фильтрации тангенциального потока и способы обогащения лейкоцитов

Формула изобретения

1. Устройство для фильтрации тангенциального потока, предназначенное для приготовления популяции клеток, обогащенных лейкоцитами, содержащее устройство для удаления нелейкоцитарных компонентов крови, имеющее поперечноточную камеру, фильтратную камеру и фильтр, расположенный между ними, причем фильтр гидравлически сообщен с поперечноточной камерой и с фильтратной камерой, при этом поперечноточная камера имеет вход и выход, причем вход установлен для введения пробы компонентов крови, содержащей лейкоциты, в поперечноточную камеру и параллельно поверхности фильтра, выход расположен в центре части поперечноточной камеры против поверхности фильтра, фильтратная камера имеет фильтратный выход, а фильтр имеет средний размер пор приблизительно 1-10 мкм, с возможностью обогащения компонентов крови лейкоцитами при прохождении потока пробы крови через фильтр.

2. Устройство по п.1, дополнительно содержащее средство для обеспечения заданной входной скорости пробы на входе поперечноточной камеры, средство для регулирования скорости фильтрации фильтрата через фильтр и в фильтратной камере, в котором средство для регулирования скорости фильтрации выполнено с возможностью ограничения скорости фильтрации до скорости, меньшей скорости фильтрации без сопротивления.

3. Устройство по п.1 или 2, дополнительно содержащее регенерационный блок, содержащий вход и выход, причем поперечноточная камера и регенерационный блок соединены между собой в виде петли, в которой вход поперечноточной камеры гидравлически сообщен с выходом регенерационного блока, а выход поперечноточной камеры гидравлически сообщен с входом регенерационного блока.

4. Устройство по п.3, в котором регенерационный блок дополнительно содержит вход для пробы и вход для промывочной жидкости.

5. Устройство по п.4, дополнительно содержащее источник возвратной жидкости, гидравлически сообщенный с входом для промывочной жидкости.

6. Устройство по п.5, в котором возвратной жидкостью является изотонический буферный раствор или тканевая культурная среда.

7. Устройство по п.1, в котором поперечноточная камера является цилиндрической, а выход расположен против центра фильтра и перпендикулярно поверхности фильтра.

8. Устройство по п.1, дополнительно содержащее устройство для продуцирования клеток, гидравлически сообщенное с устройством для удаления нелейкоцитарных компонентов крови.

9. Устройство по п.8, в котором устройство для продуцирования клеток содержит гранулы.

10. Устройство по п.8 или 9, в котором устройство для продуцирования клеток содержит средство для культивации популяции клеток, обогащенной лейкоцитами.

11. Устройство по п.10, в котором средство для культивации содержит сосуд, имеющий первый канал и второй канал, подложку, сцепляющую моноцитные предшественники дендровидных клеток и гидравлически сообщенную с первым каналом и вторым каналом, экран для удерживания подложки в сосуде, имеющий размер пор, достаточный для обеспечения возможности прохождения моноцитных предшественников дендровидных клеток и дендровидных клеток через него, дренажную линию, гидравлически сообщенную с первым каналом, сточную линию, гидравлически сообщенную с первым каналом.

12. Устройство по п.11, дополнительно содержащее множество источников жидкости, гидравлически сообщенных с первым каналом или вторым каналом.

13. Устройство по п.11 или 12, дополнительно содержащее герметизируемый сосуд для культивирования тканевой культуры, адаптированный для асептического приема моноцитных предшественников дендровидных клеток.

14. Устройство по п.13, в котором герметизируемым сосудом для культивирования тканевой культуры является мешок, колба или биореактор для культивирования тканевой культуры.

15. Устройство по п.12, в котором источники жидкости содержат связующую среду, промывочный буферный раствор и элюэнтный буферный раствор.

16. Устройство по п.12, дополнительно содержащее насос, гидравлически сообщенный с множеством источников жидкости и первым каналом.

17. Устройство по п.1, дополнительно содержащее средство для регулирования температуры для поддерживания подложки при заданной температуре.

18. Устройство по п.17, в котором средством для регулирования температуры является нагреватель.

19. Устройство по п.1, в котором размер пор фильтра составляет приблизительно 3-7 или приблизительно 3-5,5 мкм.

20. Устройство по п.1, дополнительно содержащее источник компонентов крови, гидравлически сообщенный с входом поперечноточной камеры.

21. Устройство по п.20, в котором источником компонентов крови является устройство для лейкофореза.

22. Устройство для фильтрации тангенциального потока, предназначенное для обогащения пробы компонентов крови лейкоцитами, содержащее устройство для удаления нелейкоцитарных компонентов крови, содержащее поперечноточную камеру и фильтратную камеру, разделенные фильтром, в котором поперечноточная камера имеет вход и выход, причем выход расположен в центре верхней части камеры, а вход расположен над фильтром и для введения жидкости в поперечноточную камеру, по существу, параллельно фильтру, а фильтратная камера имеет фильтратный выход, средство для обеспечения заданной входной скорости пробы через вход поперечноточной камеры и средство для уменьшения скорости фильтрации через фильтр, в котором фильтр имеет размер пор приблизительно 3-7 мкм; с возможностью обогащения компонентов пробы крови лейкоцитами в ретентате в поперечноточной камере.

23. Устройство по п.22, в котором заданная скорость фильтрации составляет приблизительно от одной пятой до одной сотой заданной входной скорости, и дополнительно содержащее средство для обеспечения заданной концентрации клеток крови в пробе, в котором заданная концентрация клеток крови составляет приблизительно 10⁷-10¹⁰ клеток на миллилитр.

24. Способ отделения лейкоцитов от пробы компонентов крови из субъекта, причем проба содержит лейкоциты, предусматривающий

(1) введение пробы в устройство для удаления нелейкоцитарных компонентов крови по любому из пп.1-23 через вход в устройство для удаления нелейкоцитарных компонентов крови;

(2) подачу пробы в поперечном потоке, по существу, параллельном фильтру, имеющему размер пор приблизительно 1-10 мкм;

(3) подвергание жидкости фильтрации через фильтр и

(4) селективное удаление нелейкоцитарных компонентов крови из пробы для образования популяции клеток, обогащенной лейкоцитами.

25. Способ по п.24, дополнительно предусматривающий приготовление пробы из субъекта посредством лейкофереза, ценрифугирования в градиенте плотности дифференциального лизиса, фильтрации или приготовление светлого слоя кровяного сгустка для введения в устройство для удаления нелейкоцитарных компонентов крови.

26. Способ по п.24 или 25, в котором нелейкоцитарные компоненты крови включают в себя плазму, тромбоциты, эритроциты и/или моноциты.

27. Способ по п.24, дополнительно предусматривающий повторение, по меньшей мере, два раза этапов (1), (2) и (3) для образования популяции клеток, обогащенной лейкоцитами.

28. Способ по п.24, в котором обогащенная популяция клеток содержит, по меньшей мере, приблизительно 20% лейкоцитов или, по меньшей мере, приблизительно 60% лейкоцитов.

29. Способ по п.24, дополнительно предусматривающий индуцирование вихревого движения пробы в поперечноточной камере.

30. Способ по п.24, дополнительно предусматривающий промывание популяции клеток, обогащенной лейкоцитами, промывочным раствором.

31. Способ по п.24, дополнительно предусматривающий приготовление моноцитных предшественников дендровидных клеток из популяции клеток, обогащенных лейкоцитами.

32. Способ по п.31, в котором отделение моноцитных предшественников дендровидных клеток предусматривает контактное взаимодействие моноцитного предшественника дендровидной клетки, сцепляющегося с подложкой, с популяцией клеток, обогащенной лейкоцитами;

обеспечение возможности моноцитным предшественникам дендровидных клеток в популяции клеток обратимо сцепляться с подложкой для образования комплексов, содержащих моноцитные предшественники дендровидных клеток и подложку;

отделение комплексов от несцепляющихся лейкоцитов для получения комплексов, содержащих моноцитные предшественники дендровидных клеток; и

культивацию моноцитных предшественников дендровидных клеток для дифференцировки предшественников для образования незрелых или зрелых дендровидных клеток.

33. Способ по п.32, в котором моноцитные предшественники дендровидных клеток элюируют из подложки перед культивацией или культивируют на подложке.

34. Способ по п.33, в котором подложка содержит стеклянные, полистироловые, пластмассовые или покрытые стеклом полистироловые микрогранулы.

35. Способ обогащения пробы компонентов крови лейкоцитами, предусматривающий

(1) введение пробы в устройство для фильтрации тангенциального потока по любому из пп.1-23;

(2) рециркуляцию пробы через устройство для фильтрации тангенциального потока с заданной входной скоростью и заданной скоростью фильтрации, причем заданная входная скорость, по меньшей мере, в пять раз больше заданной скорости фильтрации; при этом заданная скорость фильтрации меньше скорости фильтрации без сопротивления;

(3) отделение популяции клеток, обогащенной лейкоцитами.

36. Способ по п.35, в котором обогащенная популяция клеток, по существу, свободна от нелейкоцитарных компонентов крови.

37. Способ по п.35, дополнительно предусматривающий собирание крови из субъекта и приготовление пробы из крови посредством лейкофереза, уплотнительного центрифугирования в градиенте плотности дифференциального лизиса, фильтрации или приготовление светлого слоя кровяного сгустка.

38. Способ по любому из пп.35-37, в котором нелейкоцитарные компоненты крови включают в себя плазму, тромбоциты, эритроциты и/или моноциты.

39. Способ по п.35, в котором обогащенная популяция клеток содержит, по меньшей мере, приблизительно 20% лейкоцитов или, по меньшей мере, приблизительно 60% лейкоцитов.

40. Способ по п.35, в котором поток пробы крови проходит в вихревом движении в поперечноточной камере.

41. Способ по п.35, дополнительно предусматривающий промывание обогащенной популяции клеток промывочным раствором.

42. Способ по п.35, дополнительно предусматривающий приготовление дендровидных клеток из обогащенной популяции клеток.

43. Способ по п.42, в котором дендровидные клетки готовят путем контактного взаимодействия моноцитного предшественника дендровидной клетки, сцепляющегося с подложкой, с обогащенной популяцией клеток;

обеспечения возможности моноцитным предшественникам дендровидных клеток в обогащенной популяции клеток обратимо сцепляться с подложкой для образования комплексов, содержащих моноцитные предшественники дендровидных клеток и подложку;

отделения комплексов от несцепляющихся лейкоцитов для получения комплексов, содержащих моноцитные предшественники дендровидных клеток; и

культивации моноцитных предшественников дендровидных клеток для дифференцировки предшественников для образования незрелых или зрелых дендровидных клеток.

44. Способ по п.43, в котором подложка содержит стеклянные, полистироловые, пластмассовые или покрытые стеклом полистироловые микрогранулы.

45. Способ по п.43 или 44, дополнительно предусматривающий отделение незрелых или зрелых дендровидных клеток.

46. Способ по п.38, в котором моноциты культивируют с цитокинами, которые содействуют дифференцировке моноцитов в дендровидных клетках.

47. Способ по п.46, в котором цитокинами являются G-CSF, GM- CSF и IL-4.

48. Способ по п.46 или 47, в котором дендровидные клетки созревают до зрелых дендровидных клеток.

49. Способ по п.46, в котором дендровидные клетки культивируют с антигеном в условиях, благоприятных для продуцирования антигена для образования насыщенных антигеном дендровидных клеток.

50. Способ по п.35, в котором фильтр имеет размер пор приблизительно 3-5,5 мкм.

51. Способ по п.50, в котором лейкоциты содержат клетки CD34 ⁺.

52. Способ по п.50 или 51, в котором проба компонентов крови взята у донора, который был обработан, по меньшей мере, одним агентом, мобилизующим стволовые клетки.

53. Способ по п.52, в котором агентом, мобилизующим стволовые клетки, является G-CSF или циклофосфамид.

54. Способ по п.50, дополнительно предусматривающий обогащение лейкоцитов клетками CD34 ⁺.

55. Способ по п.54, в котором обогащение лейкоцитов клетками CD34⁺предусматривает использование антитела анти-СD34, сопряженного с магнитными гранулами.

56. Способ по п.50, дополнительно предусматривающий увеличение объема клеток CD34⁺ ex vivo.

57. Способ по п.50, дополнительно предусматривающий приготовление моноцит-производных плюрипотентных стволовых клеток из популяции клеток, обогащенной лейкоцитами.

58. Способ по п.57, дополнительно предусматривающий индуцирование дифференцировки клетки-предшественника или стволовой клетки.

59. Способ по п.50, дополнительно предусматривающий индуцирование трансдифференцировки дифференцированной клетки.

Описание изобретения к патенту

Текст описания приведен в факсимильном виде.