ингибиторы нуклеозидфосфорилаз и нуклеозидаз

Формула изобретения

1. Соединение формулы (I)

где V выбран из СН₂ и NH;

W выбран из NR¹ и NR ²;

Х выбран из СН₂ и СНОН в R- или S-конфигурации;

Y выбран из водорода и гидрокси;

Z выбран из водорода, галогена и гидрокси, SQ и Q, где

Q представляет собой необязательно замещенную галогеном C ₁-С₆алкильную или бензильную группу;

R¹ представляет собой радикал формулы (II)

R² представляет собой радикал формулы (III)

А выбран из N, СН;

В выбран из ОН, NH ₂ и галогена;

D выбран из NH₂ и водорода;

Е означает N;

G выбран из СН ₂ или G отсутствует,

или его таутомер, или его фармацевтически приемлемая соль, или сложный эфир.

2. Соединение по п.1, где Z выбран из гидрокси и SQ.

3. Соединение по п.1, где Х представляет собой СН₂.

4. Соединение по п.1, где G представляет собой СН₂.

5. Соединение по п.1, где Z представляет собой ОН.

6. Соединение по п.1, где Z представляет собой SQ.

7. Соединение по п.1, где Z представляет собой Q.

8. Соединение по п.1, где W представляет собой NR¹.

9. Соединение по п.1, где W представляет собой NR ².

10. Соединение по п.1, где V, Х и G все представляют собой СН₂, Z представляет собой ОН и W представляет собой NR¹.

11. Соединение по п.1, где V, Х и G все представляют собой СН ₂, Z представляет собой SQ и W представляет собой NR ¹.

12. Соединение по п.1, где Y представляет собой водород.

13. Соединение по п.1, где Y представляет собой гидрокси.

14. Соединение по п.1, где В представляет собой гидрокси.

15. Соединение по п.1, где В представляет собой NH₂.

16. Соединение по п.1, где А представляет собой СН.

17. Соединение по п.1, где А представляет собой N.

18. Соединение по п.1, где D представляет собой Н.

19. Соединение по п.1, где D представляет собой NH ₂.

20. Соединение по п.1, где Е представляет собой N, W представляет собой NR¹ или NR ², V представляет собой СН₂, Х представляет собой СН₂, и G представляет собой СН ₂.

21. Соединение по п.1, которое представляет собой:

(3R,4R)-1-[(9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин;

(3R,4R)-1-[(9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин;

(3R,4R)-1-[(8-аза-9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин;

(3R,4R)-1-[(8-аза-9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин;

(3R,4S)-1-[(9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(2-фенилэтил)пирролидин;

(3S,4R)-1-[(9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-3,4-дигидрокси-4-метилтиометилпирролидин;

(3R,4S)-1-[(9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(метилтиометил)пирролидин;

N-(9-деазагипоксантин-9-ил)-1,4-дидезокси-1,4-имино-D-рибит;

N-(9-деазагипоксантин-9-ил)метил-1,4-дидезокси-1,4-имино-D-рибит;

(3R,4R)-3-гидрокси-4-гидроксиметил-1-(гипоксантин-9-ил)пирролидин;

(3R,4R)-1-[(9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(метилтиометил)пирролидин;

(3R,4S)-1-[(9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(бензилтиометил)пирролидин;

(3R,4S)-1-[(8-аза-9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(бензилтиометил)пирролидин;

(3R,4R)-1-[(9-деазагуанин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин;

(3R,4S)-1-[(9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(4-хлорфенилтиометил)пирролидин;

(3R,4R)-1-[(6-хлор-9-деазапурин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин;

(3R,4R)-1-[(6-азидо-9-деазапурин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин или

(3R,4R)-1-[(9-деазааденин-9-ил)метил]-3-ацетокси-4-(ацетоксиметил)пирролидин, или его фармацевтически приемлемая соль или сложный эфир.

22. Фармацевтическая композиция, обладающая ингибирующим действием в отношении пуринфосфорибозилтрансферазы, пуриннуклеозидфосфорилазы, 5'-метилтиоаденозинфосфорилазы, 5'-метилтиоаденозиннуклеозидазы и/или нуклеозидгидролазы, включающая в себя фармацевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-21.

23. Способ лечения заболевания или состояния, при котором желательно ингибировать пуринфосфорибозилтрансферазу, пуриннуклеозидфосфорилазу, 5'-метилтиоаденозинфосфорилазу, 5'-метилтиоаденозиннуклеозидазу и/или нуклеозидгидролазу, заключающийся во введении пациенту, которому необходимо такое лечение, фармацевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-21.

24. Способ по п.23, где заболевание или состояние представляет злокачественное новообразование, бактериальную инфекцию, протозойную инфекцию или заболевание, опосредованное Т-клетками.

25. Способ по п.24, в котором заболевание, опосредованное Т-клетками, представляет собой псориаз, артрит или отторжение трансплантата.

26. Применение соединения по любому из пп.1-21 для приготовления лекарственного препарата для лечения заболевания или состояния, в котором желательно ингибировать пуринфосфорибозилтрансферазу, пуриннуклеозидфосфорилазу, 5'-метилтиоаденозинфосфорилазу, 5'-метилтиоаденозиннуклеозидазу и/или нуклеозидгидролазу.

27. Соединение, которое представляет собой (3R,4S)-1-[(9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(метилтиометил)пирролидин.

28. Соединение, которое представляет собой (3R,4S)-1-[(9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(метилтиометил)пирролидин или его фармацевтически приемлемую соль.

29. Соединение следующей формулы:

30. Соединение следующей формулы:

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к некоторым нуклеозидным аналогам, которые представляют собой ингибиторы PNP, PPRT, МТАР, MTAN и/или NH, применению данных соединений в качестве фармацевтических препаратов и фармацевтических композиций, содержащих данные соединения. Данное изобретение также относится к способам лечения заболеваний.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Патенты США № 5985848, 6066722 и 6228741 относятся к нуклеозидным аналогам, которые представляют собой ингибиторы пуриннуклеозидфосфорилазы (PNP) и пуринфосфорибозилтрансферазы (PPRT). Данные аналоги могут использоваться при лечении паразитарных инфекций, злокачественных перерождений Т-клеток, аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний. Данные аналоги также могут использоваться для иммуносуппрессии при трансплантации органов.

В PCT/NZ00/00048 описан способ получения некоторых ингибиторных соединений PNP. В данной заявке описаны соединения, которые являются ингибиторами PNP и указывается необходимость в более простых способах их получения. В PCT/NZ01/00174 также представлены дополнительные аналоги нуклеозидов, которые являются ингибиторами PNP и PPRT.

Некоторые аналоги нуклеозидов также были идентифицированы как сильнодействующие ингибиторы 5'-метилтиоаденозинфосфорилазы (МТАР) и 5'-метилтиоаденозиннуклеозидазы (MTAN). Данные соединения являются объектом PCT/NZ03/00050.

Заявители настоящего изобретения также разработали способ получения метиленсвязанных циклических аминодеазапуринов, который заключается во взаимодействии формальдегида или эквивалента формальдегида с циклическим амином и гетероароматическим соединением. Данный способ является объектом патентной заявки Новой Зеландии № 523970.

PNP катализирует фосфоролитическое расщепление рибо- и дезоксирибонуклеозидов, например, производных гуанина и гипоксантина, с получением соответствующего сахар-1-фосфата и гуанина, гипоксантина или других пуриновых оснований.

Люди с дефицитом пуриннуклеозидфосфорилазы (PNP) страдают от специфического Т-клеточного иммунодефицита вследствие накопления dGTP, который предотвращает пролиферацию стимулированных Т-лимфоцитов. Следовательно, ингибиторы PNP являются иммуносуппрессивными и активны против малигнизаций Т-клеток и пролиферативных нарушений Т-клеток.

Нуклеозидгидролазы (NH) катализируют гидролиз нуклеозидов. Данные ферменты не обнаружены у млекопитающих, но необходимы для реутилизации нуклеозидов у некоторых простейших паразитов. Некоторые простейшие паразиты для этой цели используют нуклеозидфосфорилазы либо вместо, либо в дополнение к нуклеозидгидролазам. Можно ожидать, что ингибиторы нуклеозидгидролаз и фосфорилаз влияют на метаболизм паразита и следовательно могут использоваться против простейших паразитов.

МТАР и MTAN задействованы в пути биосинтеза полиаминов, реутилизации пуринов у млекопитающих и в путях "quorum sensing" у бактерий. МТАР катализирует обратимый фосфоролиз 5'-метилтиоаденозина (МТА) до аденина и 5-метилтио- -D-рибоза-1-фосфата (MTR-1P). MTAN катализирует обратимый гидролиз МТА до аденина и 5-метилтио- -D-рибозы и обратимый гидролиз S-аденозил-L-гомоцистеина (SAH) до аденина и S-рибозил-гомоцистеина (SRH). Образующийся впоследствии аденин рециклизуется и преобразутся в нуклеотиды. По существу единственный источник свободного аденина в клетках человека является результатом действия данных ферментов. МТР-1Р последовательно преобразуется в метионин посредством последовательных ферментативных действий.

МТА представляет собой побочный продукт реакции, включающей перенос аминопропильной группы от декарбоксилированного 3-аденозилметионина к путресцину в процессе образования спермидина. Реакция катализируется спермидинсинтазой. Спермидинсинтаза очень чувствительна к ингибированию продуктом посредством аккумуляции МТА. Следовательно, ингибирование МТАР или MTAN жестко лимитирует биосинтез полиаминов и путь реутилизации аденина в клетках. Аналогично, МТА представляет собой побочный продукт бактериального синтеза ацилированных лактонов гомосерина из S-аденозилметионина (SAM) и ацил-ацил переносящих белков, в которых последующая лактонизация вызывает высвобождение МТА и ацилированного лактона гомосерина. Ацилированный лактон гомосерина представляет собой бактериальную молекулу "quorum sensing", которая вовлечена в бактериальную вирулентность против тканей человека. В последних исследованиях была идентифицирована вторая коммуникационная система (аутоиндуктор 2, AI-2), которая является общей как для грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, и таким образом, предполагается в качестве "универсального сигнала" в межвидовой коммуникации "клетка-клетка". И опять, MTAN генерирует S-рибозил-гомоцистеин (SRH), который является предшественником AI-2. Ингибирование MTAN или МТАР у микробов будет предотвращать удаление МТА и обеспечивать ингибирование пути продуктом, таким образом снижая продукцию пути "quorum sensing" и уменьшая вирулентность микробных инфекций. Ингибирование MTAN у микробов будет предотвращать образование SRH, уменьшая продукцию второго пути "quorum sensing".

Во многих случаях малигнизации сообщалось о дефиците МТАР в результате генетического выброса. Известно, что потеря ферментативной функции МТАР в этих клетках происходит в результате гомозиготных делений в хромосоме 9, непосредственно связанной МТАР, и суппрессорного гена опухоли p16/MTS1. Отсутствие pl6/MTS1 вероятно ответственно за опухоль, недостаток активности МТАР является следствием генетического деления и не является причиной рака. Однако отсутствие МТАР изменяет метаболизм пуринов в этих клетках так, что он в основном зависит от пути de novo для обеспечения пуринами. Это придает этим клеткам необычную чувствительность к ингибиторам, таким как метотрексат, аланозин и азасерин, который блокируют путь de novo. Следовательно, комбинационная терапия метотрексатом, аланозином или азасерином вместе с ингибитором МТАР будет обладать необычно эффективными противоопухолевыми свойствами.

Ингибиторы МТАР также могут быть очень эффективными в отношении паразитарной инфекции, такой как малярия, при которой инфицируются красные кровяные клетки (RBC), так как у них отсутствует путь биосинтеза пуринов de novo. Простейшие паразиты полностью зависят от пуринов, продуцируемых посредством пути реутилизации для их роста и размножения. Ингибиторы МТАР следовательно будут уничтожать этих паразитов, не оказывая какое-либо отрицательное действие на RBC хозяина, так как RBC являются терминально дифференцированными клетками и они не синтезируют пурины, продуцируют полиамины или размножаются.

Иминосахарная часть соединений, описанных в большинстве описаний патентов, относящихся к вышеуказанной теме, имеет атом азота, расположенный между С-1 и С-4 таким образом, что образует соединения 1,4-дидезокси-1,4-имино-D-рибита. Расположение атома азота в цикле рибита может быть ключевым для связывания ферментов. Кроме того, расположение связи между сахарной частью и основанием нуклеозидного аналога может быть особо важным для ингибиторной активности фермента. Известные соединения имеют такую связь при С-1 цикла сахара.

При поиске новых и улучшенных ингибиторов нуклеозидфосфорилазы и нуклеозидазы заявители исследовали синтез и биоактивность соединений, в которых расположение атома азота в цикле сахара изменяется и, дополнительно, в которых два атома азота образуют часть сахарного кольца. Также были исследованы альтернативные способы связывания сахарной части и аналога основания.

Заявители неожиданно обнаружили, что некоторые новые соединения проявляют высокую ингибиторную активность в отношении одного или нескольких из PNP, PPRT, МТАР и нуклеозидгидролазы MTAN.

Следовательно, целью настоящего изобретения является соединение, которое является ингибитором PNP, PPRT, МТАР, MTAN и/или NH или, по крайней мере, является препаратом выбора.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте данного изобретения предоставлено соединение формулы (I):

в котором:

V выбран из СН₂ и NH, a W выбран из NR¹ и NR ²; или

V выбран из NR¹ и NR ², a W выбран из СН₂ и NH;

Х выбран из CH₂ и СНОН в R или S-конфигурации;

Y выбран из водорода, галогена и гидрокси, исключая тот случай, когда V выбрано из NH, NR¹ и NR ², тогда Y представляет собой водород;

Z выбран из водорода, галогена и гидрокси, SQ, OQ и Q,

где Q представляет собой необязательно замещенную алкильную, аралкильную или арильную группу;

R¹ представляет собой радикал формулы (II)

R² представляет собой радикал формулы (III)

А выбран из N, СН и CR, где R выбран из галогена, необязательно замещенных алкила, аралкила или арила, ОН, NH ₂, NHR³, NR³ R⁴ и SR⁵, где каждый из R³, R⁴ и R ⁵ представляет собой необязательно замещенные алкильную, аралкильную или арильную группы;

В выбран из ОН, NH ₂, NHR⁶, SH, водорода и галогена, где

R⁶ представляет собой необязательно замещенную алкильную, аралкильную или арильную группу;

D выбран из ОН, NH₂, NHR ⁷, водорода, галогена и SCH₃, где

R⁷ представляет собой необязательно замещенную алкильную, аралкильную или арильную группу;

Е выбран из N и СН;

G выбран из СН₂ и NH или G отсутствует, при условии, что когда W представляет собой NR¹ или NR² , и G представляет собой NH, тогда V представляет собой СН ₂, и, при условии, что когда V представляет собой NR ¹ или NR² и G представляет собой NH, тогда W представляет собой CH₂;

или его таутомер, или его фармацевтически приемлемая соль, или сложный эфир, или пролекарство.

Предпочтительно, Z выбран из водорода, галогена, гидрокси, SQ и OQ. Более предпочтительно, Z представляет собой ОН. Альтернативно, предпочтительно, Z представляет собой SQ. В еще одном предпочтительном варианте осуществления Z представляет собой Q.

Также предпочтительно V представляет собой СН₂. Еще более предпочтительно Х представляет собой СН₂. Дополнительно, предпочтительно, G представляет собой СН₂ .

Предпочтительно W представляет собой NR ¹. Альтернативно, предпочтительно, W представляет собой NR². Также предпочтительно, если W выбран из NH, NR¹ или NR² , то Х представляет собой СН₂.

Предпочтительные соединения изобретения включают соединения, где V, Х и G все представляют собой СН₂, Z представляет собой ОН и W представляет собой NR¹.

Другие предпочтительные соединения изобретения включают соединения, где V, Х и G все представляют собой СН₂ , Z представляет собой SQ и W представляет собой NR ¹.

Предпочтительно, Y представляет собой водород. Альтернативно, предпочтительно, Y представляет собой гидрокси.

Предпочтительно, В представляет собой гидрокси. Альтернативно, предпочтительно, В представляет собой NH₂ .

Предпочтительно, А представляет собой СН. Альтернативно, предпочтительно, А представляет собой N.

Предпочтительно, D представляет собой Н. Альтернативно, предпочтительно, D представляет собой NH₂.

Также предпочтительно Е представляет собой N.

Предпочтительные соединения данного изобретения включают:

(3R,4R)-1-[(9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин;

(3R,4R)-1-[(9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин;

(3R,4R)-1-[(8-аза-9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин;

(3R,4R)-1-[(8-аза-9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин;

(3R,4S)-1-[(9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(2-фенилэтил)пирролидин;

(3S,4R)-1-[(9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-3,4-дигидрокси-4-метилтиометилпирролидин;

(3R,4S)-1-[(9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(метилтиометил)пирролидин;

N-(9-деазагипоксантин-9-ил)-1,4-дидезокси-1,4-имино-D-рибит;

N-(9-деазагипоксантин-9-ил)метил-1,4-дидезокси-1,4-имино-D-рибит;

(3R,4R)-3-гидрокси-4-гидроксиметил-1-(гипоксантин-9-ил)пирролидин;

(3R,4S)-1-[(9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(метилтиометил)пирролидин;

(3R,4S)-1-[(9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(бензилтиометил)пирролидин;

(3R,4S)-1-[(8-аза-9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(бензилтиометил)пирролидин;

(3R,4R)-1-[(9-деазагуанин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин;

(3R,4S)-1-[(9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(4-[хлорфенилтиометил)пирролидин;

(3R,4R)-1-[(6-хлор-9-деазапурин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин;

(3R,4R)-1-[(6-азидо-9-деазапурин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин; или

(3R,4R)-1-[(9-деазааденин-9-ил)метил]-3-ацетокси-4-(ацетоксиметил)пирролидин.

В еще одном аспекте, данное изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей фармацевтически эффективное количество соединения формулы (I), как определено выше.

В еще одном аспекте, данное изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, при котором желательно ингибировать пуринфосфорибозилтрансферазу, пуриннуклеозидфосфорилазу, 5'-метилтиоаденозинфосфорилазу, 5'-метилтиоаденозиннуклеозидазу и/или нуклеозидгидролазу, который заключается во введении пациенту, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтически эффективного количества соединения формулы (I), как определено выше.

Заболевание или состояние представляет собой злокачественное новообразование, бактериальную инфекцию, протозойную инфекцию или заболевание, опосредованное Т-клетками. Заболевание, опосредованное Т-клетками, представляет собой псориаз, артрит или отторжение трансплантата.

В еще одном аспекте изобретение относится к применению соединения формулы (I), как определено выше, для производства лекарственного средства для лечения заболевания или состояния, при котором желательно ингибировать пуринфосфорибозилтрансферазу, пуриннуклеозидфосфорилазу, 5'-метилтиоаденозинфосфорилазу, 5'-метилтиоаденозиннуклеозидазу и/или нуклеозидгидролазу.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Необходимо принять во внимание, что изображение соединения формулы (I), где В и/или D представляет собой гидроксигруппу, является энольным типом таутомерной формы соответствующего амида, и эта форма будет преимущественно существовать в амидной форме. Применение энольного типа таутомерного изображения дано лишь для представления соединений данного изобретения несколькими структурными формулами.

Аналогично, следует учитывать, что изображение соединения формулы (I), где В и/или D представляет собой тиольную группу, является таутомерной формой тиоенольного типа соответствующего тиоамида, и данная форма будет преимущественно существовать в тиоамидной форме. Применение таутомерного изображения тиоенольного типа дано лишь для простого представления соединений данного изобретения несколькими структурными формулами.

Соединения данного изобретения могут быть получены любым подходящим способом. Один подходящий способ включает в себя независимый синтез сахарной части и части основания и затем связывание основной части с атомом азота в сахарной части кольца.

Например, на схеме 1, приведенной ниже, показано получение 1-N-иминосахарной части соединения данного изобретения, где атом азота аналога сахара расположен в таком же положении, как и С-1 аномерной атому углерода в молекуле сахара. Исходное соединение, используемое в синтезе 1-N-иминосахара, представляет собой N-трет-бутоксикарбонил-(3R,4S)-3-гидрокси-4-[(1S)-1,2-дигидроксиэтил]пирролидин. Это исходное соединение может быть получено с помощью способа Filichev et al. (Carbohydrate Res., 2001, 333, 115-122) изменяя только то, что в качестве защитной группы азота используют т-бутоксикарбонильный фрагмент, а не N-(9-флуоренилметоксикарбонильную) группу. Окислительное расщепление диольной группы с последующим восстановлением in situ дает N-защищенный 3-гидрокси-4-гидроксиметилпирролидин (1). Удаление N-защитной группы дает (3R,4R)-3-гидрокси-4-гидроксиметилпирролидин (4). Рацемический 3-гидрокси-4-гидроксиметилпирролидин первоначально был получен Jaeger et al. (J. Org. Chem., 1965, 30, 740-744) и использован для получения 1'-аза карбациклических аналогов тимидина (Lee, Y.H., Kirn, H.K., Youn, I.К., Chae, Y.B., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1991, 1, 287-290) и аза-С-пиримидинов (Sorensen M.D., Khalifa, N.M., Pedersen, E.B.m Synthesis, 1999, 1937-1943).

Также описаны два других способа синтеза (3R,4R)-3-гидрокси-4-гидроксиметилпирролидина. В один из способов, Bols et al. [Bols, M., Hansen, S.U., Acta Chem. Scand., 1998, 52, 1214-1222], включена ферментативная очистка энантиомеров. Другой способ, Ichikawa et al. [Ichikawa, Y., Makino, K., Tetrahedron Lett., 1998, 39, 8245-8248], представляет собой мультиграммовый асимметрический синтез (3R,4R)-3-гидрокси-4-гидроксиметилпирролидина через моноэтиловый эфир фумаровой кислоты. Ichikawa et al. оценили ингибиторную активность (3R,4R)-3-гидрокси-4-гидроксиметилпирролидина против PNP человека и получили IC₅₀, равное 160 мкМ.

Бензилирование гидроксильных групп соединения (1) перед удалением N-защитной группы может быть желательным для получения гидрохлорида (3R,4R)-3-бензилокси-4-бензилоксиметилпирролидина (3) как эффективного соединения, готового к связыванию с подходящим аналогом основания.

Присоединение сахарной части может осуществляться путем восстановительного аминирования соответсвующего альдегида. Примеры подходящих альдегидов, полученных из их соответствующих бромсодержащих предшественников, представлены на схеме 2.

Взаимодействие аналога альдегидного основания с защищенным аналогом сахара (3) показано на схеме 3. Удаление защитной группы дает ингибиторное соединение данного изобретения (3S,4S)-1-[(9-деазагипоксантин-9-ил) метил]-3,4-дигидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин (8).

Необходимо отметить, что любой аналог сахара, имеющий атом азота в любом положении своего цикла, может связываться с любым аналогом основания таким образом. Следует также учитывать, что могут применяться способы, отличные от взаимодействия путем восстановительного аминирования альдегида.

Как показано на схемы 4, приведенной ниже, из промежуточного соединения (7) может быть получено соединение (10)

Другие примеры взаимодействия аналогов основания с аналогом сахара (4) показаны на схеме 5. Данный способ может использоваться для получения соединений (3R,4S)-1-[(8-аза-9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидина; (12) и (3R,4S)-1-[(8-аза-9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидина (13).

Получали промежуточный аналог сахара, содержащий два атома азота в своем кольце. (3R,4S)-4-гидрокси-3-гидроксиметилпиразолидин (21) может быть получен в соответствии с путем, показанным на схеме 6. Кетон (14) получали из D-ксилозы, используя хорошо известную химию (Lin, T-S., Zhu, J-L., Dutschman, G.E., Cheng, Y-C., Prusoff, W.H., J. Med. Chem. 1993, 36, 353-362). Аминирование с последующим восстановлением имина и ацетилирование полученного в результате вторичного амина давало соединение (17). В ключевой стадии кислотного гидролиза с сопутствующей рециклизацией получали иминоцикл (18). Гидрирование с последующим отщеплением диольной группы и удалением ацетата давало требуемый пиразолидин (21).

Пиразолидин (21) или N-ацетатный предшественник (20) могут взаимодействовать с разнообразными аналогами оснований с получением возможных ингибиторов формулы (I) данного изобретения.

Альтернативный способ взаимодействия аналога основания с аналогом сахара показан на схеме 7. Альдегид N-трет-бутоксикарбонил-(3R,4S)-3-гидрокси-4-формилпирролидин (22) использовали в реакции Виттига с получением 5' С-С связанного промежуточного соединения N-трет-бутоксикарбонил-(3R,4R)-3-гидрокси-4-(2-фенилэтенил)пирролидина (23). Последующее гидрирование и отщепление Вос-групп давало гидрохлоридную соль (25), которая может использоваться в реакции Манниха для получения (3R,4R)-1-[(6-хлор-9-деазапурин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(2-фенилэтил)пирролидина (26). Обработка с 7н. аммиаком в метаноле при 130°С в герметично закрытой пробирке с последующим преобразованием в гидрохлоридную соль с помощью 3н. водного раствора HCl получали гидрохлорид (3R,4S)-1-[(9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(2-фенилэтил)пирролидина (27).

Необходимо заметить, что путь, приведенный в качестве примера на схеме 7, может быть использован для взаимодействия разнообразных аналогов 25, изменяющихся по С-4 заместителю, с различными аналогами 9-деазапурина.

На схеме 8 показан еще один альтернативный путь получения некоторых соединений данного изобретения. В этом способе используют исходное соединение D-арабинит, а не N-трет-бутоксикарбонил-(3R,4S)-3-гидрокси-4-[(1S)-1,2-дигидроксиэтил]пирролидин.

Соединения данного изобретения представляют собой сильнодействующие ингибиторы PNP, МТАР и/или MTAN.

В таблице 1 представлены константы ингибирования некоторых соединений данного изобретения PNP человека. В таблице 2 представлены константы ингибирования некоторых соединений против MTAN E. Coli. В таблице 3 представлены константы ингибирования некоторых соединений МТАР человека. В таблице 4 представлены константы ингибирования некоторых соединений против PNP Mycoba ctenuia tuberculosis. В таблице 5 представлены константы ингибирования некоторых соединений против PNP Plasmod.lum falciparum.

Таблица 1
Константы ингибирования против PNP человека
Соединение №	Структура	Ki	Ki*
61		163±25 пМ	6,8±1,2 пМ
8		1100±120 пМ	16,0±1,4 пМ

12		2000±50 пМ	Медленное начало отсутствует
33		433±13 нМ	Медленное начало отсутствует
37		19,6±3,5 пМ	Медленное начало отсутствует
31		14±3 нМ	Медленное начало отсутствует
41		2,8 нМ	Медленное начало отсутствует
40		12,7 мкМ	Медленное начало отсутствует

Таблица 2
Константы ингибирования против MTAN E.Coli
Соединение №	Структура	Ki	Ki*
52		17±2 пМ	160±14 фМ
57		9,0±1 пМ	42±5 фМ
58			190 фМ
62		4,0±0,4 пМ	91±2,0 фМ
27		47,0±8,0 нМ	1,0±0,3 нМ

Таблица 3
Константы ингибирования против МТАР человека
Соединение №	Структура	Ki	Ki*
52		870±110 пМ	22±3 пМ
62		46,0±8,0 пМ	<3 пМ
27		Ингибирование при 10 мкМ отсутствует
57		280±50 пМ	3,0±0,3 пМ
58		51 нМ	Медленное начало отсутствует

Таблица 4
Константы ингибирования против PNP Mycobacterlum tuberculosis
Соединение №	Структура	Ki	Ki*
8		1,3±0,1 нМ	42,2±2 пМ
61		540±40 пМ	24±1 пМ
12		2,1±0,2 нМ	Медленное начало отсутствует
41		7±0,2 нМ	Медленное начало отсутствует

Таблица 5
Константы ингибирования против PNP Plasmodium falclparum
Соединение №	Структура	Ki	Ki*
37		20,4±1,8 нМ	Медленное начало отсутствует
33		45±3 мкМ	Медленное начало отсутствует
8		500 пМ	Медленное начало отсутствует
31		4,3 мкМ	Медленное начало отсутствует

K_i , как показано в таблицах 1, 2, 3, 4 и 5, представляет собой константу первоначального ингибирования образованного комплекса фермент-ингибитор, и K_i* представляет собой равновесную константу диссоциации ингибирования, которое наблюдают после периода медленного начала, ингибирования с прочным связыванием. K_i* представляет собой биологически эффективную константу.

Дополнительные аспекты

Соединения данного изобретения являются эффективными как в форме свободного основания, так и в форме солей. Под термином "фармацевтически приемлемые соли" понимают нетоксичные соли, которые являются производными неорганических или органических кислот, включая, например, следующие кислоты: хлористоводородную, серную, фосфорную, уксусную, молочную, фумаровую, янтарную, винную, глюконовую, лимонную, метансульфоновую и п-толуолсульфоновую кислоты.

Активные соединения могут вводиться пациенту различными путями, включая, пероральное введение, инъекцию или местное нанесение. Количество вводимого соединения будет сильно изменяться в зависимости от особенностей пацента и природы и степени расстройств, на которое направлено лечение. Обычно дозировка для взрослого человека будет находиться в диапазоне, меньшем 1-1000 миллиграмм, предпочтительно, 0,1-100 миллиграмм.

Для перорального введения с соединениями могут быть получены твердые или жидкие препараты, например, таблетки, капсулы, порошки, растворы, суспензии и дисперсии. Такие препараты, хорошо известные в данной области, как и другие пероральные режимы введения дозы, которые не перечислены здесь. В форме таблетки соединения могут быть получены вместе с общепринятыми основаниями для таблеток, такими как лактоза, сахароза и кукурузный крахмал, со связующим агентом, дезинтегратором и смазкой. Связующий агент может представлять собой, например, кукурузный крахмал или желатин, дезинтегратором может быть картофельный крахмал или альгиновая кислота, а смазкой может являться стеарат магния. Могут быть добавлены другие компоненты, такие как красители или отдушки.

Жидкие формы содержат носители, такие как вода и этанол, вместе с другими агентами, такими как фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество или суспендирующий агент, или без этих агентов.

Данные соединения могут также вводиться инъекцией в физиологически приемлемом разбавителе, таком как вода или физиологический раствор. Разбавитель может включать один или несколько ингредиентов, таких как этанол, пропиленгликоль, масло или фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество.

Соединения могут быть ингредиентами в кремах, для местного введения на кожу или мембраны слизистых оболочек. Предпочтительно, кремы включают фармацевтически приемлемый растворитель для способствования прохождения через кожу или мембраны слизистых оболочек. Подходящие кремы являются хорошо известными специалистам в данной области.

Соединения могут затем вводиться посредством систем с отсроченным высвобождением. Например, они могут быть введены в медленно растворяющуюся таблетку или капсулу.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧУРТЕЖЕЙ

На фиг.1 показаны кинетические кривые для PNP человека, ингибируемого соединением (8).

На фиг.2 показано ингибирование мышиной МТАР in vivo.

ПРИМЕРЫ

Следующие далее примеры дополнительно иллюстрируют изобретение. Следует учитывать, что изобретение не ограничивается данными примерами.

Пример 1

N-трет-Бутоксикарбонил-(3R,4R)-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин (1). К перемешиваемому раствору периодата натрия (3,4 г, 16 ммоль) в воде (25 мл) по каплям добавляют N-трет-бутоксикарбонил-(3R,4S)-3-гидрокси-4-[(1S)]-1,2-дигидроксиэтил)пирролидин (3,4 г, 13,7 ммоль) в этаноле (50 мл), поддерживая температуру реакции при 0°С. Реакционную смесь оставляют на дополнительные 20 мин, после чего по частям добавляют боргидрид натрия (2,0 г, избыток), снова поддерживая температуру реакции при 0°С. После добавления твердое вещество отфильтровывают, промывают этанолом (50 мл) и концентрируют в вакууме с получением сиропа. Хроматография давала соединение 1 (2,74 г, 92%) в виде сиропа.

Пример 2

N-трет-Бутоксикарбонил-(3R,4R)-3-бензилокси-4-(бензилоксиметил)пирролидин (2). К перемешиваемому раствору бензилбромида (300 мкл, 2,8 ммоль) и соединения 1 (200 мг, 0,92 ммоль) в ДМФА (10 мл) по частям добавляют гидрид натрия (140 мг, 60% масляной дисперсии, 3,7 ммоль) при 0°С. После добавления полученную суспензию оставляли нагреваться до комнатной температуры, разбавляют толуолом (100 мл), промывают водой (50 мл), насыщенным солевым раствором (50 мл), сушат (MgSO₄) и концентрируют в вакууме с получением сиропа. Хроматография давала соединение 2 (350 мг, 96%) в виде масла, которое использовали в следующей стадии без очистки.

Пример 3

Гидрохлорид (3R,4R)-3-бензилокси-4-(бензилоксиметил)пирролидина (3). К раствору соединения 2

(500 мг, 1,3 ммоль) в метаноле (2 мл) добавляют хлористоводородную кислоту (2 мл, 1М) и полученную смесь перемешивают в течение 1 час при 40°С. После завершения реакционную смесь концентрируют в вакууме с получением соединения 3 в виде гидрохлоридной соли (330 мг, 90%). ¹ Н ЯМР 7,35-7,21 (м, 10Н), 4,48 (м, 4Н), 4,08 (д, J=2,9 Гц, 1Н), 3,53 (м, 1Н), 3,44 (м, 3Н), 3,24 (м, 1Н), 2,65 (м, 1Н). ¹³С ЯМР 138,0, 137,6, 128,9, 128,8, 128,3, 128,2, 79,3, 73,7, 71,9, 68,7, 49,6, 46,4, 44,8.

Пример 4

(3R,4R)-3-Гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин (4). К перемешиваемому раствору соединения 1 (2,3 г, 10,6 ммоль) в метаноле (5 мл) по каплям добавляют хлористоводородную кислоту

(5 мл, 12М) при комнатной температуре. Через 1 час реакционную смесь концентрируют в вакууме с получением соединения 4 (1,63 г, 100%) в виде масла. ¹³С ЯМР 71,9, 60,9, 52,1, 47,9, 46,6.

Пример 5

7-N-Бензилоксиметил-6-трет-бутокси-9-деазапурин-9-карбальдегид (5). 5-Бензилоксиметил-7-бром-4-трет-бутоксипирроло[3,2-d]пиримидин (400 мг, 1,02 ммоль) растворяют в диэтиловом эфире (10 мл) и анизоле (5 мл) и охлаждают до -78°С. Затем по каплям добавляют н-бутиллитий (600 мкл, 2,5 М) с такой скоростью, чтобы поддерживать температуру реакции ниже -70°С, и полученный раствор оставляют на 30 мин при -78°С. Затем добавляют диметилформамид (100 мкл) и реакционную смесь оставляют перемешиваться еще 30 мин и затем гасят водой и оставляют нагреваться до комнатной температуры. Реакционную смесь затем разбавляют этилацетатом (100 мл), промывают водой (30 мл), насыщенным солевым раствором (30 мл), сушат (MgSO ₄) и концентрируют в вакууме с получением сиропа. Очисткой хроматографией получают соединение 5 (270 мг, 78%). ¹H ЯМР 10,29 (с, 1Н), 8,62 (с, 1Н), 7,98 (с, 1Н), 7,34-7,22 (м, 5Н), 5,79 (с, 2Н), 4,53 (с, 2Н), 1,71 (с, 9Н). ¹³С ЯМР 184,8, 156,63, 152,6, 150,0, 136,7, 136,6, 128,9, 128,5, 127,8, 118,4, 84,4, 78,3, 71,0, 29,0.

Пример 6

8-Аза-9-деаза-6-метокси-7-N-(тетрагидропиран-2-ил)пурин-9-карбальдегид (6). К перемешиваемому раствору 8-аза-9-бром-9-деаза-6-метокси-7-N-(тетрагидропиран-2-ил)пурина (530 мг, 1,7 ммоль) в ТГФ (20 мл) по каплям добавляли н-BuLi (0,7 мл, 2,4 М) при -78°С в инертной атмосфере. Реакционную смесь перемешивают еще 30 мин -78°С и затем добавляют ДМФ (1,0 мл) и реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры. Реакцию гасят водой (50 мл), экстрагируют толуолом (2×100 мл), органические слои объединяют, промывают насыщенным солевым раствором, сушат (MgSO₄) и концентрируют в вакууме с получением твердого остатка. Хроматографией получают соединение 6 в виде твердого вещества. ¹ Н ЯМР 10,43 (с, 1Н), 8,71 (с, 1Н), 6,55 (дд, J=10,0, 2,7 Гц, 1Н), 4,25 (с, 3Н), 4,13 (м, 1Н), 3,83 (дт, J=10,8, 2,8 Гц), 2,53-1,65 (м, 7Н). ¹³С ЯМР 5 177,0, 161,5, 154,5, 143,9, 130,2, 128,9, 87,0, 67,4, 53,5, 28,7, 23,7, 21,2.

Пример 7

7-[(3R,4R)]-(3-бензилокси-4-бензилоксиметилпирролидин-1-ил)метил]-5-бензилоксиметил-3Н-пирроло[3,2-d]пиримидин-4-он(3S,4S)-1-[(9-деаза-7-бензилоксиметил-гипоксантин-9-ил)метил]-3-бензилокси-4-(бензилоксиметил)пирролидин (7). К перемешиваемому раствору соединения 5 (220 мг, 0,64 ммоль) и соединения 3.HCl (190 мг, 0,57 ммоль) в метаноле (5 мл) добавляют цианоборгидрид натрия (100 мг, 1,59 ммоль) и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь затем концентрируют в вакууме и перерастворяют в метаноле (2 мл) и HCl (2 мл), перемешивая в течение 1 ч, и затем концентрируют в вакууме с получением твердого осадка. Хроматография полученного осадка дает соединение 7 (202 мг, 63%) в виде твердого вещества. ¹H ЯМР 7,87 (1H, с), 7,32 (1H, с), 7,31-7,23 (м, 5Н), 5,89 (с, 2Н), 4,56 (с, 2Н), 4,50 (с, 2Н), 4,48 (с, 2Н), 4,47 (с, 2Н), 3,87 (м, 2Н), 3,81 (кв, J=13,4 Гц, 2Н), 3,43 (д, J=7,1 Гц, 2Н), 3,01 (т, J=8,1 Гц, 1H), 2,79 (д, J=4,7 Гц, 1H), 2,55 (м, 1H), 2,36 (м, 1H). ¹³С ЯМР 156,2, 145,8, 141,8, 138,9, 138,8, 137,6, 131,4, 128,8, 128,7, 128,7, 128,3, 128,2, 128,1, 128,0, 128,8, 117,9, 115,7, 81,3, 77,1, 73,5, 72,1, 71,4, 70,8, 60,0, 56,4, 48,6, 45,9.

Пример 8

(3R,4R)-1-[(9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин (8). Соединение 7 (120 мг, 0,21 ммоль) и катализатор Пирлмана (120 мг) суспендируют в этаноле (3 мл) и уксусной кислоте (1 мл) и интенсивно перемешивают в атмосфере газообразного водорода в течение 24 час при комнатной температуре. Реакционную смесь затем фильтруют через целит и концентрируют в вакууме с получением твердого вещества. Хроматография и ионный обмен твердого вещества дает соединение 8 (38 мг, 68%) в виде белого твердого вещества с т.пл. 248-250°С. ¹H ЯМР 7,81 (1H, с), 7,34 (1H, с), 3,97 (1H, ушир.с), 3,65 (2Н, с), 3,53 (1H, м), 3,44 (1H, м), 2,93 (1H, т, J=9,0 Гц), 2,77 (1H, м), 2,60 (1H, м), 2,33 (1H, т, J=7,1 Гц), 2,12 (1H, ушир.с). ¹³С ЯМР 155,8, 144,1, 142,8, 130,0, 117,3, 111,1, 72,9, 62,7, 60,2, 54,8, 48,9, 47,3. HRMC (MH+) вычислено для C ₁₂H₁₆N₄O ₃: 265,1301. Найдено: 265,1302. Анализ для С ₁₂Н₁₆N₄О ₃·SH₂О С, 52,7; Н, 6,2; N, 20,5. Найдено: С, 53,0; Н, 5,9; N, 20,4.

Пример 9.1

(3R,4R)-1-[(9-Деаза-7-бензилоксиметиладенин-9-ил)метил]-3-бензилокси-4-(бензилоксиметил)пирролидин (9). Соединение 7 (1,2 г, 2,12 ммоль) добавляют к фосфорилхлориду (20 мл) и полученную суспензию нагревают при кипячении с обратным холодильником. Через 1 час реакционную смесь концентрируют в вакууме, разбавляют хлороформом, промывают насыщенным водным NaHCO₃, насыщенным солевым раствором, сушат (MgSO₄) и концентрируют в вакууме. Полученный остаток перерастворяют в 7н. NH₃ в метаноле и полученный раствор нагревают при 120°С в герметично закрытой пробирке в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и очищают хроматографией с получением соединения 9 (0,83 г, 69%). ¹H ЯМР 8,38 (с, 1Н), 7,76 (ушир.с, 1Н), 7,32-7,25 (м, 15Н), 6,01 (ушир.с, 2Н), 5,51 (д, J=2,3 Гц, 2Н), 4,55 (с, 2Н), 4,51 (с, 2Н), 4,48 (с, 2Н), 4,25 (д, J=2, 9 Гц, 2Н), 4,05 (м, 1Н), 3,50 (д, J=6,5 Гц, 2Н), 3,42 (м, 1Н), 3,31 (м, 1Н), 3,20 (м, 1Н), 3,01 (м, 1Н), 2,71 (м, 1Н). ¹³С ЯМР 152,3, 151,5, 150,1, 138,3, 138,0, 135,7, 134,6, 129,2, 129,0, 128,8, 128,2, 128,1, 115,18, 107,94, 79,7, 77,6, 73,6, 71,9, 70,7, 69,8, 58,6, 58,1, 55,22, 54,9, 48,8, 45,3.

Пример 9.2

(3R,4R)-1-[(9-Деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксилметил)пирролидин (10). Соединение 9 (100 мг, 0,18 ммоль) и Pd/C (50 мг, 10% общ. масс.) суспендируют в этаноле (4 мл) и интенсивно перемешивают в атмосфере водорода в течение 24 час при комнатной температуре. Реакционную смесь затем фильтруют через целит и концентрируют в вакууме с получением сиропа. Хроматография на силикагеле дает соединение 10 в виде твердого вещества. ¹ H ЯМР (D₂O) d 7,83 (с, 1Н), 7,13 (с, 1H), 3,88 (кв, J=4,4 Гц, 1H), 3,56-3,32 (4H, м), 2,78 (т, J=9,0 Гц, 1H), 2,62 (дд, J=10,7, 6,4 Гц, 1H), 2,47 (дд, J=10,7, 4,2 Гц, 1H), 2,16 (дд, J=9,8, 7,0 Гц, 1H), 2,03 (1H, м). ¹³С ЯМР (D₂O) d 150,1, 149,6, 145,1, 129,6, 113,3, 109,8, 72,9, 62,8, 60,3, 54,8, 49,0, 47,3. HRMC (МН⁺) вычислено для C₁₂ H₁₈N₅O ₂: 264,1461. Найдено: 264,1457.

Пример 10

(3R,4R)-1-[(8-Аза-9-деаза-6-метокси-8-(тетрагидропиран-2-ил)пурин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин (11). К перемешиваемому раствору соединения 6 (340 мг, 1,3 ммоль) и соединения 4.HCl (190 мг, 0,57 ммоль) в метаноле (5 мл) добавляют цианоборгидрид натрия (100 мг, 1,59 ммоль) и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Хроматография полученного остатка дает соединение 11 (150 мг, 35%) в виде твердого вещества. ¹Н ЯМР 8,39 (с, 1Н), 5,90 (д, J=9,1 Гц, 1Н), 4,17-3,94 (м, 4Н), 4,12 (с, 3Н), 3,67-3,52 (м, 2Н), 2,94-2,79 (м, 2Н), 2,66-2,52 (м, 2Н), 2,35-2,09 (м, 2Н), 1,70-1,56 (м, 2Н). ¹³С ЯМР 162,6, 152,2, (140,1, 140,0), 133,5, 131,6, (87,0, 86,9), 74,3, (68,3, 68,2), (64,3, 64,2), 62,6, (56,2, 56,1), 54,5, (50,6, 50,7), (47,7, 47,6), 29,7, 25,2, 21,8.

Пример 11

(3R,4R)-1-[(8-Аза-9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин (12). Концентрированную хлористоводородную кислоту (1 мл, 12М) добавляют к раствору соединения 11 (50 мг, 0,14 ммоль) в метаноле и перемешивают в течение ночи и затем концентрируют в вакууме с получением твердого остатка, который растирают с метанолом и фильтруют с получением соединения 12 (38 мг, 92%) в виде твердого вещества. ¹Н ЯМР 8,13 (с, 1Н), 4,35 (д, J=2,7 Гц, 1Н), 3,86 (м, 1Н), 3,66-3,43 (м, 2Н), 3,55 (д, J=5,7 Гц, 2Н), 3,10 (м, 1Н), 2,44 (ушир.с, 1Н). ¹³С ЯМР 154,7, 145,4, 137,1, 134,7, 128,6, 71,4, 60,6, 60,6, 55,0, 48,0, 47,9.

Пример 12

(3R,4R)-1-[(8-Аза-9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин (13). Раствор соединения 11 (100 мг) в 7н. NH ₃ в метаноле (4 мл) нагревают в герметически закрытой пробирке при 120°С в течение ночи. Реакционную смесь затем концентрируют в вакууме и неочищенный остаток еще раз растворяют в метаноле (1 мл) и концентрированной HCl (1 мл) и оставляют отстаиваться в течение ночи. Реакционную смесь снова концентрируют в вакууме и полученный остаток очищают хроматографией с получением соединения 13 (61 мг, 84%). ¹³С ЯМР 152,4, 151,5, 139,1, 134,8, 122,7, 71,7, 61,1, 60,3, 55,0, 48,4, 48,2.

Пример 13

5-О-трет-Бутилдиметилсилил-1,2-O-изопропилиден- -D-эритро-пентафураноз-3-улоза(трет-бутоксикарбонил)гидразон (15). Раствор соединения 14 (11,5 г, 38 ммоль), трет-бутилкарбазат (17 г, 128 ммоль) и п-толуолсульфоната пиридиния (1,15 г, 4,6 ммоль) в толуоле (150 мл) перемешивают в течение ночи при 70°С. После окончания реакционную смесь промывают насыщенным раствором NaHCO₃ и водой, сушат (MgSO ₄) и концентрируют в вакууме с получением сиропа. Очистка хроматографией дает соединение 15 (12,5 г, 79%) в виде масла. ¹H ЯМР 8,43 (ушир.с, 1Н), 5,98 (д, J=4,8 Гц, 1Н), 4,90 (дд, J=4,8, 1,5 Гц, 1Н), 4,76 (кв, J=1,5 Гц, 1Н), 3,77 (м, 2Н), 1,48 (с, 9Н), 1,45 (с, 3Н), 1,41 (с, 3Н), 0,82 (с, 9Н), -0,03 (д, J=5,8 Гц, 6Н). ¹³С ЯМР 153,5, 152,8, 114,3, 105,7, 82,0, 81,7, 76,2, 66,2, 28,6, 28,0, 27,5, 26,2, 18,5. HRMC (МН⁺) вычислено для C₁₉H₃₇N ₂O₆Si: 417,2421. Найдено: 417,2398.

Пример 14

3-(2-трет-Бутоксикарбонилгидразино)-5-O-трет-бутилдиметилсилил-3-дезокси-1,2-O-изопропилиден- -D-рибофураноза (16). К перемешиваемому раствору соединения 15 (12,5 г, 30 ммоль) по каплям добавляли комплекс боран.DMS (15 мл, ˜10М, 150 ммоль) при -78°С в инертной атмосфере. Реакционной смеси позволяют нагреться до комнатной температуры, осторожно гасят метанолом и затем полученный раствор концентрируют в вакууме. Полученный неочищенный сироп совместно дистиллируют с аликвотами метанола (3×100 мл) с получением соединения 16 (12,5 г, 100%) в виде масла, которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки. ¹H ЯМР 6,29 (ушир.с, 1Н), 5,67 (д, J=3,7 Гц, 1Н), 4,62 (т, J=4,3 Гц, 1Н), 4,24 (ушир.с, 1Н), 3,75 (м, 2Н), 3,72 (м, 1Н), 1,46 (с, 3Н), 1,38 (с, 9Н), 1,27 (с, 3Н), 0,82 (с, 9Н), -0,03 (с, 6Н). ¹³С ЯМР 156,9, 112,8, 104,6, 80,7, 80,4, 80,2, 65,0, 63,1, 28,7, 27,1, 26,9, 26,3, 18,7. HRMC (MH⁺) вычислено для C₁₉H₃₈N ₂O₆Si: 418,2499. Найдено: 418,2509.

Пример 15

3-(1-Ацетил-2-трет-бутоксикарбонилгидразино-5-О трет-бутилдиметилсилил-3-дезокси-1,2-O-изопропилиден- -O-рибофураноза (17). К перемешиваемому раствору соединения 16 (12,5 г, 30 ммоль) в пиридине (30 мл) добавляют уксусный ангидрид (10 мл, избыток) и полученную реакционную смесь оставляют перемешиваться в течение ночи при комнатной температуре. После окончания реакционную смесь разбавляют хлороформом (500 мл) и промывают 10% HCl, водой, насыщенным раствором NaHCO₃, насыщенным солевым раствором и затем органический слой сушат (MgSO ₄), фильтруют и фильтрат концентрируют в вакууме с получением неочищенного желтого масла. Очистка хроматографией дает соединение 17 (6,5 г, 47%) в виде бесцветного масла, ¹ Н ЯМР 7,20 (ушир.с, 1Н), 5,75 (д, J=3,8 Гц, 1Н), 5,02 (дд, J=9,8, 5,0 Гц, 1Н), 4,72 (т, J=4,2 Гц, 1Н), 4,04 (дд, J=9,8, 2,2 Гц, 1Н), 3,87 (д, J=11,6 Гц, 1Н), 3,70 (дд, J=11,6, 38 Гц, 1Н), 2,09 (с, 3Н), 1,55 (с, 3Н), 1,42 (с, 9Н), 1,28 (с, 3Н), 0,84 (с, 9Н), -0,03 (с, 6Н). ¹³С ЯМР 174,5, 155,2, 112,7, 104,7, 82,0, 81,0, 77,2, 62,9, 62,0, 55,0, 28,5, 27,0, 26,7, 26,3, 21,1, 18,7. HRMC (MH ⁺) вычислено для C₂₁H ₄₁N₂O₇Si: 461,2683. Найдено: 461,2704.

Пример 16

(3S,4S)-2-Ацетил-3,4-дигидро-3-[(1S)-1,2-дигидроксиэтил]-4-гидроксипиразол (18). Перемешиваемый раствор соединения 17 (2,0 г, 4,3 ммоль) в 70% уксусной кислоте (20 мл) нагревают при 100°С в течение ночи. Полученный раствор оставляют остывать, разбавляют водой (100 мл) и водный раствор экстрагируют хлороформом (2×100 мл), а затем водный слой концентрируют в вакууме с получением сиропа. Продукт очищают хроматографией с получением соединения 18 (380 мг, 47%) в виде масла. ¹³С ЯМР 173,1, 150,5, 112,7, 74,7, 69,6, 65,4, 62,4, 21,4. HRMC (МН⁺) вычислено для C₇ H₁₃N₂O ₄: 189,0875. Найдено: 189,0876.

Пример 17

(3S,4S)-2-Ацетил-3-[(1S)-1,2-дигидроксиэтил]-4-гидроксипиразолидин (19). Катализатор Пирлмана (200 мг) суспендируют в растворе метанола с (3S,4S)-2-ацетил-1,5-дигидро-3-[(1S)-1,2-дигидроксиэтил]-4-гидроксипиразолом (18) (200 мг, 1,11 ммоль) и перемешивают в течение ночи в атмосфере водорода. Реакционную смесь фильтруют через целит и фильтрат концентрируют в вакууме с получением неочищенного масла. Неочищенный продукт очищают хроматографией с получением соединения 19 (85 мг, 43%) в виде бесцветного масла. ¹H ЯМР 4,64 (дд, J=5,7, 3,4 Гц, 1Н), 3,90 (м, 2Н), 3,61 (м, 2Н), 3,36 (дд, J=11,7, 6,5 Гц, 1Н), 2,71 (дд, J=11,7, 6,0 Гц, 1Н), 2,18 (с, 3Н). ¹³С ЯМР 174,5, 75,4, 72,7, 68,2, 65,2, 56,4, 21,5. HRMC (М ⁺) вычислено для C₇H ₁₄N₂O₄: 190,0953. Найдено: 190,0951.

Пример 18

(3S,4S)-2-Ацетил-4-гидрокси-3-гидроксиметилпиразолидин (20). К перемешиваемому раствору перйодата натрия (150 мг, 0,7 мл) в воде (5 мл) по каплям добавляют раствор соединения (19) (80 мг, 0,42 ммоль) в этаноле (5 мл) с такой скоростью, чтобы поддерживать температуру реакции при 5°С. После окончания к полученной суспензии по частям добавляют боргидрмд натрия (135 мг, избыток) с такой скоростью, чтобы поддерживать температуру реакции при 0°С и после добавления реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры. К реакционной смеси добавляют оксид кремния для флэш-хроматографии и полученную суспензию концентрируют в вакууме с получением белого твердого вещества. Твердое вещество очищают хроматографией с получением соединения 20 (51 мг, 76%) в виде бесцветного масла. ¹H ЯМР 4,43 (дд, J=5,7, 3,3 Гц, 1Н), 3,91 (кв, J=4,7 Гц, 1H), 3,75 (д, J=4,7 Гц, 1Н), 3,31 (м, 1Н), 3,28 (дд, J=11,8, 5,7 Гц, 1H), 2,75 (дд, J=11,8, 5,5 Гц, 1H), 2,17 (с, 3Н). ¹³С ЯМР 173,9, 76,5, 68,2, 62,5, 55,8, 21,7. HRMC (МН ⁺) вычислено для С₆Н ₁₃N₂О₃: 161,0926. Найдено: 161,0920.

Пример 19

(3S,4S)-4-гидрокси-3-гидроксиметилпиразолидин (21). К перемешиваемому раствору соединения 20 (15 мг, 0,09 ммоль) в метаноле (1,5 мл) по каплям добавляют концентрированную HCl (1,5 мл) и полученная реакционная смесь находится при 60°С в течение 3 час. Реакционную смесь концентрируют в вакууме с получением соединения 21 (18 мг, 100%) в виде его дигидрохлоридной соли. ¹H ЯМР 4,60 (кв, J=2,4 Гц, 1H), 3,73-3,31 (м, 5Н). ¹³С ЯМР 72,6, 68,3, 60,2, 54,1.

Пример 20

N-трет-Бутоксикарбонил-(3R,4S)-3-гидрокси-4-(2-фенилэтенил)пирролидин (23). К суспензии бромида бензилтрифенилфосфония (1,75 г, 4,97 ммоль) в безводном ТГФ (10 мл) в атмосфере аргона при 0°С добавляют 1,6 М BuLi в ТГФ (2,33 мл, 3,73 ммоль) и темно-красный раствор оставляют перемешиваться без охлаждения в течение 10 мин. После повторного охлаждения до 0°С добавляют альдегид 22 (335 мг, 1,56 ммоль) (Gary В. Evans, Richard H.Furneaux, Andrzej Lewandowicz, Vern L.Schramm, and Peter C.Tyier (2003), Synthesis of Second-Generation Transition State Analogues of Human Purine Nucleoside Phosphorylase, J. Med. Chem., в печати) в ТГФ (5 мл) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 12 час. Реакцию затем гасят водой (1 мл), добавляют дихлорметан (100 мл) и органическую фазу промывают насыщенным раствором гидрокарбоната натрия (15 мл), затем водой (15 мл). Сушка над сульфатом магния и концентрирование в вакууме с последующей хроматографией дает приблизительно 1:3 цис/транс смесь 23 в виде сиропа (290 мг, 64%). ¹H ЯМР (300 МГц, CDCl ₃): м.д.: транс: 7,28 (м, 5Н), 6,49 (д, J=15,9 Гц, 1Н), 6,03 (дд, J=15,9 и 8,1 Гц, 1Н), 4,11 (м, 1Н), 3,67 (м, 2Н), 3,32 (м, 2Н), 2,83 (м, 1Н), 1,46 (с, 9Н), цис: 7,27 (м, 5Н), 6,58 (д, J=11,6 Гц, 1Н), 5,43 (дд, J=11,6 Гц и 10,0 Гц, 1Н), 4,11 (м, 1Н), 3,65 (м, 2Н), 3,21 (м, 2Н), 2,88 (м, 1Н), 1,44 (с, 9Н).

Пример 21

N-трет-Бутоксикарбонил-(3R,4S)-3-гидрокси-4-(2-фенилэтил)пирролидин (24). К раствору N-трет-бутоксикарбонил-(3R,4S)-3-гидрокси-4-(2-фенилэтенил)пирролидина 23 (290 мг, 1,00 ммоль) в этаноле (20 мл) добавляют 10% Pd/C (250 мг) и суспензию перемешивают в атмосфере водорода в течение 12 час. После фильтрации растворитель удаляют в вакууме с получением 254 мг (87%) указанного в заголовке соединения в виде сиропа. ¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃ ): м.д.: 7,10 (м, 5Н), 4,00 (м, 1Н), 3,47 (м, 2Н), 3,07 (м, 2Н), 2,67 (м, 2Н), 2,04 (м, 1Н), 1,83 (м, 1Н), 1,54 (м, 1Н), 1,45 (с, 9Н). ¹³С ЯМР (300 МГц, CDCl ₃): м.д. (обратите внимание, что некоторые пики раздвоены вследствие медленной конверсии ротамеров): 155,17, 142,03, 128,83, 128,71, 126,37, 79,88, (74,94, 71,26), (53,17, 52,90), (49,90, 49,34), (46,11, 45,52), 34,41, 33,69, 28,91.

Пример 22

Гидрохлорид (3R,4S)-3-гидрокси-4-(2-фенилэтил)пирролидина (25). К раствору N-трет-бутоксикарбонил-(3R,4R)-3-гидрокси-4-(2-фенилэтил)пирролидина (24) (254 мг, 0,87 ммоль) в метаноле (10 мл) добавляют конццентрированный HCl (˜12н, 4 мл) и раствор перемешивают при 40°С в течение 30 мин. После удаления растворителя в вакууме и азеотропной перегонки с толуолом, неочищенное, соединение, указанное в заголовке, получают в виде сероватого твердого вещества (202 мг, 0,89 ммоль, 102%). ¹H ЯМР (300 МГц, MeOH-d ₄): м.д.: 7,14 (м, 5Н), 4,22 (м, 1Н), 3,52 (дд, J=11,8 и 7,4 Гц, 1Н), 3,39 (дд, J=12,3 и 4,9 Гц, 1Н), 3,14 (дд, J=12,3 и 2,8 Гц, 1Н), 3,02 (дд, J=11,8 Гц, 1Н), 2,71 (м, 2Н), 2,20 (м, 1Н), 1,84 (м, 1Н), 1,62 (м, 1Н). ¹³С ЯМР (300 МГц, MeOH-d₄): м.д.: 142,94, 129,93, 129,89, 27,56, 75,56, 52,90, 48,55, 47,28, 35,18, 34,44.

Пример 23

(3R,4S)-1-[(9-Деаза-6-хлорпурин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(2-фенилэтил)пирролидин (26). К суспензии неочищенного гидрохлорида (3R,4R)-3-гидрокси-4-(2-фенилэтил)пирролидина 25 (194 мг, 0,85 ммоль) и 6-хлор-9-азапурина (118 мг, 0,76 ммоль) в воде (2,2 мл) добавляют 37% водный раствор формальдегида (70 мкл, 0,94 ммоль) и ацетат натрия (70 мг, 0,85 ммоль). Смесь нагревают при 95°С в герметично закрытой пробирке при перемешивании в течение 12 часов. После охлаждения темно-коричневую взвесь разбавляют 1,4-диоксаном (3 мл) и темно-коричневый раствор преабсорбируют на оксиде кремния. Колоночная хроматография дает указанное в заголовке соединение в виде пленки кремово-коричневатого цвета (104 мг, 38%). ¹H ЯМР (300 МГц, МеОН-d ₄): м.д.: 8,71 (с, 1Н), 8,12 (с, 1Н), 7,17 (с, 5Н), 4,55 (с,, 1Н), 4,18 (м, 1Н), 3,56 (м, 2Н), 3,31 (м, 1Н), 3,04 (дд, J=11,6 и 7,7 Гц, 1Н), 2,64 (м, 2Н), 2,21 (м, 1Н), 1,87 (м, 1Н), 1,61 (м, 1Н). ¹³С ЯМР (300 МГц, MeOH-d4): м.д.: 151,62, 151,35, 145,02, 142,99, 138,11, 129,84, 129,82, 127,46, 126,81, 107,73, 75,68, 61,00, 58,48, 49,51, 47,56, 35,26, 34,88.

Пример 24

(3R,4S)-1-[(9-Деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(2-фенилэтил)пирролидин (27). Раствор 7-(3R,4R)-(3-гидрокси-4-(2-фенилэтил)пирролидин-1-ил)метил]-4-хлорпирроло[3,2-d]пиримидина (26) (70 мг, 0,196 ммоль) в 7н. метанольном растворе аммиака (4 мл) нагревают при в герметично закрытой пробирке при 130°С при перемешивании в течение 3 час. После охлаждения растворитель удаляют в вакууме. Остаток переносят в метанол и неочищенное вещество преабсорбируют на оксиде кремния. Вещество, полученное после колоночной хроматографии, обрабатывают 3н. водным раствором HCl (4 мл) при 40°С в течение 1 час. Лиофилизацией получают 31 мг (39%) указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества кремового цвета. ¹H ЯМР (300 МГц, D₂O): м.д.: 8,40 (с, 1Н), 7,83 (с, 1Н), 7,26 (м, 5Н), 4,33 (м, 4Н), 4,07 (м, 1Н), 3,80 (м, 2Н), 2,75 (м, 2Н), 2,37 (м, 1Н), 1,90 (м, 1Н), 1,66 (м, 1Н). ¹³С ЯМР (300 МГц, D₂O): м.д. (обратите внимание, что некоторые пики раздвоены вследствие медленной конверсии ротамеров): 149,54, 144,47, 142,40, 133,05, 129,05, 128,85, 126,51, 113,64, 103,48, (74,87, 72,96), (55,34, 54,87), (52,59, 52,09), (45,96, 43,65), 33,30, 32,94, 32,33. ES-MC: m/z для C₁₉H ₂₃N₅O: (M+H)⁺ : 338,1979; вычислено 338,4326.

Пример 25

(3S,4S)-1-[(7-N-Бензилоксиметил-6-О-трет-бутил-9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-3,4-дигидрокси-4-гидроксиметил-3,4-O-изопропилиденпирролидин (29). Раствор амина 28 (Bois, M. Tetrahedron Lett. 1996, 37, 2097-2100) (0,50 г, 2,89 ммоль) и альдегида (5, Схема 3) (1,0 г, 2,95 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (50 мл) перемешивают вместе с триацетоксиборгидридом натрия (1,1 г, 5,2 ммоль) в течение 1 часа и затем промывают водным раствором NaHCO ₃, сушат и досуха концентрируют. Хроматография дает указанное в заголовке соединение 29 (1,16 г, 2,34 ммоль, 80%) в виде сиропа. ¹³С ЯМР (CDCl₃) 156,2, 150,3 (С), 150,0 (СН), 137,5 (С), 131,8, 128,8, 128,2, 127,8 (СН), 117,1, 114,6, 113,0, 91,7, 83,2 (С), 82,4 (СН), 77,3, 70,2, 65,7, 62,1, 60,5, 48,4 (CH₂ ), 29,1, 28,3 (СН₃).

Пример 26

(3S,4S)-1-[(6-O-трет-Бутил-9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-3,4-дигидрокси-4-гидроксиметил-3,4-O-изопропилиденпирролидин (30). Раствор 29 (1,1 г, 2,21 ммоль) в этаноле (30 мл) перемешивают в атмосфере водорода в присутствии 10% Pd/C (0,25 г). Через 16 часов добавляют дополнительное количество катализатора и через 24 часа твердые вещества и растворитель удаляют. Хроматография остатка дает указанное в заголовке соединение 30 (0,35 г, 0,93 ммоль, 42%) в виде сиропа. ¹³С ЯМР (CD ₃OD) 157,7 (С), 150,2 (СН), 149,8 (С), 131,0 (СН), 118,2, 113,7, 112,9, 93,1, 83,9 (С), 83,5 (СН), 66,4, 62,7, 61,0, 48,9 (СН ₂), 29,4, 28,2 (СН₃).

Пример 27

(3S,4S)-1-[(9-Деазагипоксантин-9-ил)метил]-3,4-дигидрокси-4-гидроксиметилпирролидин (31). Раствор соединения 30 (0,15 г, 0,399 ммоль) в метаноле (25 мл) и концентрированной HCl (2,5 мл) оставляют отстаиваться в течение 1 часа и затем досуха концентрируют. Хроматографией остатка [СН₂Cl₂/МеОН/водн. NH₃ 10:6:1] получают указанное в заголовке соединение 31 (0,095 г, 0,34 ммоль, 85%) в виде белого твердого вещества. ¹³С ЯМР (D₂ O/DCl) (при 85°С) 153,8 (С), 144,7 (СН), 138,0 (С), 132,8 (СН), 118,5, 103,8, 78,8 (С), 70,1 (СН), 63,5, 59,5, 57,3, 49,3 (СН ₂).

Пример 28

(3S,4R)-1-[(9-Деазагипоксантан-9-ил)метил]-3,4-дигидрокси-4-метилтиометилпирролидин (33). К суспензии соединения 30 (0,14 г) в дихлорметане (5 мл) добавляют этилдиизопропиламин (0,2 мл) с последующим добавлением метансульфонилхлорида (0,045 мл) и смесь перемешивают в течение 1 час. Полученный в результате раствор обрабатывают обычным образом и неочищенный продукт в ДМФА (3 мл) обрабатывают тиометоксидом натрия (0,13 г) и полученную в результате смесь нагревают при 90°С в течение 4 часов и затем распределяют между между толуолом и водой. Органическую фазу промывают водой, сушат и концентрируют. Хроматографией остатка получают 32 (0,075 г). Раствор данного вещества в метаноле (4 мл) и концентрированной HCl (4 мл) оставляют отстаиваться в течение 1 часа и затем досуха концентрируют с получением 33.HCl (0,04 г, 62%) в виде белого твердого вещества. ¹³С ЯМР (D ₂O) 153,4 (С), 145,0 (СН), 135,5 (С), 133,1 (СН), 118,6, 102,9, 79,2 (С), 71,9 (СН), 60,6, 56,7, 48,3, 39,2 (CH ₂), 17,1 (СН₃).

Пример 29

(3R,4S)-1-[(9-Деазагипоксантин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(метилтиометил)пирролидин (37). К раствору соединения 1 (1,0 г) в пиридине (20 мл) добавляют 2,4,6-триизопропилбензолсульфонилхлорид (3,0 г) и раствор перемешивают в течение 16 часов, затем нагревают при 60°С в течение 1 часа. Добавляют хлороформ и раствор промывают водой, 2М водным раствором HCl и водным раствором NaHCO₃ . Обработка в обычных условиях и хроматография дают 1,125 г соединения 34 в виде бесцветного стекловидного вещества. Раствор 0,45 г данного вещества в ДМФА (5 мл) обрабатывают тиометоксидом натрия (0,2 г), и смесь перемешивают в течение 0,5 час. Добавляют толуол, и реакционную смесь обрабатывают в обычных условиях с получением 0,115 г неочищенного вещества. Раствор данного вещества в дихлорметане (5 мл) обрабатывают 4М HCl в диоксане (3 мл). Через 1 час раствор досуха концентрируют. Твердый остаток соединения 35 растворяют в метаноле (3 мл), содержащем 7-N-бензилоксиметил-9-деаза-6-O-метилгипоксантин-9-карбальдегид (0,18 г), и добавляют цианоборгидрид натрия (0,088 г). Смесь перемешивают в течение 3 дней. Добавляют хлороформ и смесь обрабатывают в обычных условиях. Хроматография затем дает соединение 36 (0,178 г). Данное вещество в концентрированной HCl (10 мл) нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 1 часа, затем раствор досуха концентрируют. Остаток обрабатывают смесью метанол/25% водный раствор NH₃ (1:1) в течение 1 часа и затем досуха концентрируют. Хроматографией получают твердое вещество. Данное вещество растворяют в водном растворе HCl и концентрируют. Растирание остатка в этаноле дает 37.HCl (0,048 г) в виде гигроскопичного белого твердого вещества. ¹³С ЯМР (D₂O при 85°С) 154,6 (С), 144,5 (СН), 140,6 (С), 132,6 (СН), 118,6, 104,6 (С), 73,3 (СН), 59,3, 56,3, 48,0 (CH₂), 45,7 (СН), 34,7 (СН₂), 15,2 (СН ₃).

Пример 30

5-О-трет-Бутилдиметилсилил-N-цианометил-1,4-дидезокси-1,4-имино-2,3-О-изопропилиден-D-рибита (39). Бромацетонитрил (1,46 мл, 20,9 ммоль) и этилизопропиламин (5,46 мл, 56,9 ммоль) добавляют к раствору соединения 38 (Horenstein, В.A.; Zabinski, R.F.; Schramm, V.L. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 7213-7216 (3,0 г, 10,45 ммоль) в ацетонитриле (20 мл). Через 1 час раствор досуха концентрируют, и хроматография остатка дает указанное в заголовке соединение 39 в виде сиропа (3,4 г, 10,4 ммоль, 99%). ¹H ЯМР 4,58 (дт, J=6,4, 4,3 Гц, 1Н), 4,20 (дд, J=6,8, 4,2 Гц, 1Н), 3,88 (д, J=17 Гц, 1Н), 3,79 (дд, J=10,9, 3,0 Гц, 1Н), 3,58 (м, 1Н), 3,56 (д, J=17 Гц, 1H), 3,19 (дд, J=9,8, 6,1 Гц, 1Н), 2,85 (м, 1Н), 2,75 (дд, J=9,8, 4,3 Гц, 1H), 1,44 (с, 3Н), 1,23 (с, 3Н), 0,82 (с, 9Н), 0,09 (с, 3Н), 0,08 (с, 3Н). ¹³С ЯМР 115,6, 113,6 (С), 82,2, 78,3, 68,6 (СН), 64,7, 59,3, 41,0 (СН2), 27,6, 26,2, 25,6 (СН3), 18,5 (С). HRMC (МН ⁺) вычислено для C₁₆H ₃₁N₂O₃Si: 327,2104. Найдено: 327,2097.

Пример 31

Гидрохлорид N-(9-деазагипоксантин-9-ил)-1,4-дидеаокси-1,4-имино-D-рибита (40.HCl). N-цианометильное производное 39 (0,5 г, 1,53 ммоль) преобразуют в соединение, указанное в заголовке, используя такую же последовательность реакций, как описана ранее для получения Иммуцилина-Н (Evans, G.B.; Furneaux, R.H.; Gainsford, G.J.; Schramm, V.L.; Tyier, P.C. Tetrahedron 2000, 56, 3053-3062) с получением 40.HCl в виде аморфного порошка (0,07 г, 0,23 ммоль, 15%). ¹H ЯМР (D₂O) 8,24 (с, 1Н), 7,71 (с, 1H), 4,43 (м, 1Н), 4,29-4,17 (м, 2Н), 3,96 (м, 1Н), 3,82-3,71 (м, 3Н). ¹³ С ЯМР 154,2 (С), 144,3 (СН), 133,0 (С), 124,0 (СН), 117,8, 115,9 (С), 73,4, 70,4, 68,9 (СН), 62,9, 56,1 (СН₂ ). HRMC (М⁺) вычислено для C ₁₁H₁₅N₄O ₄: 267,1093. Найдено: 267,1101.

Пример 32.1

7-N-Бензилоксиметил-9-деаза-9-формил-6-О-метилгипоксантин (5а). Раствор 7-N-бензилоксиметил-9-бром-9-деаза-6-O-метилгипоксантина (G.B.Evans et al J.Org. Chem. 2001, 66, 5723-5730) (1,0 г, 2,87 ммоль) в анизоле (10 мл) и эфире (25 мл) охлаждают до -70°С и к полученной суспензии добавляют н-бутиллитий (2,4 мл, 1,2М). Через 10 минут к прозрачному раствору добавляют безводный N,N-диметилформамид (1,1 мл, 14,2 ммоль) и перемешивают при -70°С в течение 30 мин и затем гасят водой. Обработка в обычных условиях дает твердое вещество, из которого после растирания в этаноле получают указанное в заголовке соединение в виде белого твердого вещества (0,67 г, 2,26 ммоль, 78%) с т.пл. 100-101°С. ¹H ЯМР d 10,30 (с, 1Н), 8,67 (с, 1Н), 8,00 (с, 1Н), 7,35-7,21 (м, 5Н), 5,77 (с, 2Н), 4,55 (с, 2Н), 4,14 (с, 3Н). ¹³С ЯМР d 184,7 (СН), 157,0 (С), 153,0 (СН), 150,0 (С), 136,9 (СН), 136,5 (С), 129,0, 128,7, 128,1 (СН), 118,6, 116,7 (С), 78,3, 71,4 (СН₂), 54,3 (СН ₃), HRMC (MH⁺) вычислено для С ₁₉Н₂₁N3О₃ 340,1661. Найдено: 340,1652.

Пример 32.2

Гидрохлорид N-(9-деазагипоксантин-9-ил)метил-1,4-дидезокси-1,4-имино-D-рибита (41.HCl). К раствору соединения 38 добавляют альдегид (5а) (114 мг, 0,38 ммоль) (Horenstein, В.A.; Zabinski, R.F.; Schramm, V.L. Tetrahedron Lett. 1993, 34, 7213-7216) (100 мг, 0,35 ммоль) в метаноле (1,5 мл), ТГФ (0,5 мл) и уксусной кислоте (100 мкл) и смесь перемешивают в течение 10 мин. Добавляют цианоборгидрид натрия (88 мг, 1,4 ммоль) и раствор перемешивают в течение 4 часов, затем распределяют между между хлороформом и водным раствором NaHCO₃. Органический слой сушат и досуха концентрируют. Хроматография остатка дает, в основном, N-(7-бензилоксиметил-9-деаза-6-O-метилгипоксантин-9-ил)метил-5-О-трет-бутилдиметилсилил-1,4-дидезокси-1,4-имино-2,3-O-изопропилиден-О-рибит в виде сиропа (175 мг, 0,31 ммоль, 88%). Раствор данного вещества в этаноле (5 мл) перемешивают вместе с 10% Pd/C (100 мг) в атмосфере водорода в течение 16 часов. Твердые вещества и растворитель удаляют и хроматография остатка дает сироп (129 мг), который растворяют в метаноле (5 мл) и концентрированной HCl (5 мл), и раствор кипятят с обратным холодильником в течение 2 час. Раствор досуха концентрируют и остаток еще раз растворяют в воде и лиофилизируют с получением указанного в заголовке соединения 41.HCl в виде порошка (80 мг, 0,25 ммоль, 80%). ¹H ЯМР (D₂О) 8,57 (м, 1Н), 7,78 (с, 1Н), 4,66 (с, 1Н), 4,56 (с, 1Н), 4,29 (м, 1Н), 4,13 (м, 1Н), 3,76 (м, 2Н), 3,61 (м, 2Н), 3,34 (дд, J=13/0, 3,4 Гц, 1Н). ¹³С ЯМР 153,6 (С), 144,8 (СН), 136,7 (С), 133,2 (СН), 118,5, 103,3 (С), 71,3, 70,3, 68,9 (СН), 57,4, 57,1, 50,1 (СН ₂). HRMC (М⁺) вычислено для C ₁₂H₁₇N₄O ₄: 281,1250. Найдено: 281,1260.

Пример 33

(3R,4R)-3-Гидрокси-4-гидроксиметил-1-(гипоксантин-9-ил)пирролидин (47). К раствору свободного основания 3 (2,25 г, 7,5 ммоль) в безводном ТГФ (30 мл) добавляют трет-бутилнитрил (3,5 мл, 30 ммоль, 4 экв.) и реакционную смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 3 дней. Раствор досуха концентрируют. Хроматография дает N-нитрозосоединение 42 в виде бесцветного сиропа (2,05 г, 83%). Раствор соединения 42 (1,0 г, 3,1 ммоль) в безводном ТГФ (20 мл) охлаждают до 0°С в атмосфере аргона и медленно добавляют алюмогидрид лития (1 г, 26,3 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 часов, затем осторожно гасят 15% раствором NaOH (25 мл) с последующим добавлением воды (10 мл). Смесь дважды экстрагируют хлороформом, промывают водным раствором NaHCO₃, сушат и досуха концентрируют. Хроматографией (хлороформ:этилацетат:метанол, 5:2:1) получают гидразин 43 (0,41 г, 43%) в виде сиропа. Формимидат 44 (Watson, A.A. J Org. Chem. 1974, 39, 2911-2916) (0,224 г, 1,44 ммоль, 1,2 экв) добавляют к раствору 43 (0,375 г, 1,2 ммоль) в этаноле (1,5 мл) и реакционнную смесь нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 10 мин, затем оставляют охлаждаться. Раствор досуха концентрируют. Хроматография (хлороформ:этилацетат:метанол, 5:2:1) дает ммидазол 45 в виде светло-коричневой смолы (0,155 г, 31%). Раствор соединения 45 (77 мг, 0,183 ммоль) в безводном МеОН (1 мл) обрабатывают 5 М водным раствором HCl (36,5 мкл, 0,183 ммоль). Растворитель удаляют, и остается гидрохлоридная соль в виде коричневой смолы. Добавляют ДМФА (1,5 мл), а затем добавляют триэтилортоформиат (0,304 мл, 1,83 ммоль, 10 экв.) и реакционную смесь нагревают при 120°С в течение 30 мин. После охлаждения растворитель удаляют в вакууме. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (хлороформ:этилацетат:метанол, 5:2:0,5) с получением гипоксантина 46 (49 мг, 62%) в виде смолы. К раствору 46 (41 мг, 0,095 ммоль) в этаноле (3 мл) и 25% водного аммиака (1 мл) добавляют гидроксид палладия на углероде (20 мг, 20% Pd). Реакционную смесь перемешивают в атмосфере водорода при температуре и давлении окружающей среды в течение 3 час. Затем катализатор отфильтровывают и промывают этанолом (1,5 мл). Раствор досуха концентрируют и хроматография остатка (дихлорметан:метанол:водный раствор аммиака, 7:2:0,5) получают указанное в заголовке соединение 47 (21 мг, 88%) в виде белого твердого вещества. ¹H ЯМР (CD₃OD) 8,17 (с, 1Н), 8,07 (с, 1Н), 4,26 (м, 1Н), 3,85-3,64 (м, 4Н), 3,48-3,43 (м, 2Н), 2,49-2,41 (м, 1Н). ¹³ С ЯМР 159,3 (С), 149,7 (С), 146,7 (СН), 142,3 (СН), 124,7 (С), 72,7 (СН), 63,7, 63,6, 58,4 (СН₂), 50,2 (СН). M/z вычислено для С₁₀Н ₁₃N₅О₃ (МН ⁺): 252,109. Найдено: 252,108.

Пример 34

Гидрохлорид (3R,4S)-3-гидрокси-4-(метилтиометил) пирролидина (48). К раствору в СН₂Cl ₂ триэтиламина (400 мкл, 29 ммоль) и (3R,4R)-1-трет-бутоксикарбонил-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидина (1) (2 г, 9,2 ммоль)по каплям добавляют метансульфонилхлорид (180 мкл, 23 ммоль) при 0°С и полученному в результате раствору дают нагреться до комнатной температуры. Реакционную смесь разбавляют СН₂Cl₂, промывают водой, насыщенным солевым раствором, сушат (MgSO ₄) и концентрируют в вакууме. Полученный в результате остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с получением (3R,4R)-1-трет-бутоксикарбонил-3-гидрокси-4-(мезилоксиметил)пирролидина (900 мг) в виде масла. Без дополнительной очистки продукт растворяют в ДМФА (10 мл) и перемешивают с тиометоксидом натрия (400 мг, 5,7 ммоль) при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляют толуолом, промывают водой, насыщенным солевым раствором, сушат (MgSO₄) и концентрируют в вакууме. Полученный в результате остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с получением (3R,4S)-1-трет-бутоксикарбонил-3-гидрокси-4-(метилтиометил)пирролидина (600 мг, 2,4 ммоль) в виде сиропа, который затем не описывают. (3R,4S)-1-трет-бутоксикарбонил-3-гидрокси-4-(метилтио)пирролидин растворяют в МеОН (5,0 мл) и концентрированной HCl (1,0 мл) и концентрируют в вакууме с получением гидрохлорида (3R,4S)-3-гидрокси-4-(метилтиометил)пирролидина (48) в виде сиропа (442 мг, 26% общий выход для трех стадий). ¹³С ЯМР (D₂O) 73,5, 51,5, 48,6, 45,2, 34,3, 14,9.

Пример 35

(3R,4S)-1-[(6-трет-бутокси-7-бензилоксиметил-9-деазапурин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(метилтиометил)пирролидин (49). К перемешиваемому раствору 5 (800 мг, 2,32 ммоль) и 48 (550 мг, 3,00 ммоль) в метаноле (10 мл) добавляют цианоборгидрид натрия (200 мг, 3,2 ммоль) и смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Неочищенную реакционную смесь адсорбируют на оксиде кремния, в сухом виде загружают на колонку с силикагелем для флэш-хроматографии и элюируют с получением соединения 49 (1,10 г, 78%) в виде твердого вещества. ¹ H ЯМР (CDCl₃) 8,48 (с, 1Н), 7,54 (с, 1Н), 7,33-7,23 (м, 5Н), 5,75 (с, 2Н), 4,50 (с, 2Н), 4,12 (м, 1Н), 4,02 (с, 2Н), 3,30 (дд, J=9,9, 7,5 Гц, 1Н), 2,95 (м, 2Н), 2,64 (дд, J=12,7, 7,1 Гц, 1Н), 2,52-2,38 (м, 3Н), 2,07 (с, 3Н), 1,70 (с, 9Н). ¹³ С ЯМР (CDCl₃) 156,4, 150,3, 150,3, 137,5, 133,3, 128,8, 128,2, 127,8, 117,1, 111,7, 83,5, 77,5, 76,1, 70,4, 61,4, 58,2, 48,8, 47,4, 37,3, 29,0, 16,0.

Пример 36

(3R,4S)-3-ацетокси-1-[(7-бензилоксиметил-9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-4-(месилтиометил)пирролидин (50). К раствору соединения 49 (1,1 г, 2,3 ммоль), DMAP (30 мг, кат.) и Et₃N (2 мл, избыток) в CH ₂Cl₂ (20 мл) добавляют по каплям уксусный ангидрид (1 мл, избыток) при комнатной температуре. Через 15 минут реакционную смесь разбавляют CH ₂Cl₂, промывают насыщенным раствором NaHCO₃, водой, насыщенным солевым раствором, сушат (MgSO₄) и концентрируют в вакууме. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с получением продукта (1,35 г) в виде сиропа. К раствору сиропа в CH₂Cl₂ (20 мл) добавляют по каплям ТФУ (5 мл) при комнатной температуре и концентрируют в вакууме. Полученный в результате остаток перерастворяют в CH ₂Cl₂ и промывают насыщенным раствором NaHCO₃, водой и насыщенным солевым раствором, сушат (MgSO₄) и концентрируют в вакууме с получением (3R,4S)-3-ацетокси-1-[(7-бензилоксиметил-9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-4-(метилтиометил)пирролидина (50) (800 мг, 76%) в виде пены. ¹H ЯМР (CDCl3) 7,80 (с, 1Н), 7,65 (с, 1Н), 7,25-7,20 (м, 5Н), 5,82 (с, 2Н), 5,11 (ушир.с, 1Н), 4,56 (с, 2Н), 4,47 (с, 2Н), 3,80-3,59 (м, 3Н), 3,32 (ушир.с, 1Н), 2,80-2,69 (м, 2Н), 2,57 (дд, J=13,0, 8,3 Гц, 1Н), 2,07 (с, 3Н), 2,05 (с, 3Н). ¹³ С ЯМР (CDCl₃) 170,7, 155,4, 145,8, 143,3, 137,2, 134,2, 128,8, 128,3, 128,1, 118,1, 106,9, 77,4, 75,7, 71,2, 57,0, 55,8, 48,1, 43,5, 35,0, 21,0, 16,1. HRMC (MH⁺) вычислено для C₂₃H₂₉N ₄O₄S: 457,1910. Найдено: 457,2412.

Пример 37

(3R,4S)-1-[(7-Бензилоксиметил-9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(метилтиометил)пирролидин (51). Амин 50 (800 мг, 1,75 ммоль) растворяют в POCl ₃ и нагревают при температуре кипячения с обратным холодильником в течение 1 час. Полученный в результате раствор концентрируют в вакууме и вместе с толуолом (×2) перегоняют с получением твердого остатка. Без дополнительной очистки продукт предыдущей реакции еще раз растворяют в 7н. NH₃ в МеОН (15 мл) и нагревают в герметично закрытой пробирке при 110°С в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и полученный остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с получением (3R,4S)-1-[(7-бензилоксиметил-9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(метилтиометил)пирролидина (51) (500 мг, 69%) в виде сиропа. ¹H ЯМР (d₄-MeOH) 8,24 (с, 1H), 7,85 (с, 1Н), 7,29-7,26 (м, 5Н), 5,74 (с, 2Н), 4,63 (с, 2Н), 4,43 (с, 2Н), 4,26-4,22 (м, 1H), 3,70 (дд, J=11,4, 6,9 Гц, 1H), 3,49 (дд, J=12,1, 5,6 Гц, 1H), 3,29 (дд, J=12,3, 3,3 Гц, 1H), 3,16 (дд, J=11,4, 6,1 Гц, 1H), 2,76-2,67 (м, 1H), 2,50-2,44 (м, 2Н), 2,07 (с, 3Н). ¹³ С ЯМР (CDCl₃) 153,4, 153,0, 149,9, 138,1, 137,0, 130,0, 129,7, 129,3, 116,5, 106,5, 79,5, 75,0, 72,3, 60,9, 57,8, 50,1, 47,6, 36,6, 16,0.

Пример 38

(3R,4S)-1-[(9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(метилтиометил)пирролидин (52). Амин (51) (150 мг, 0,37 ммоль) растворяют в концентрированной HCl (5 мл) и полученный раствор нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 90 мин. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, разбавляют водой (50 мл) и промывают CHCl ₃ (×2), и водный слой концентрируют в вакууме, с последующей перегонкой вместе с водой (×2). Полученный остаток еще раз растворяют в NH₄OH, концентрируют в вакууме и остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с получением (3R,4S)-1-[(9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(метилтиометил)пирролидина (52) (69 мг, 65%) в виде твердого вещества. Т.пл. 108-110°С. ¹H ЯМР (D₂O) 7,96 (с, 1H), 7,31 (с, 1H), 4,00-3,95 (м, 1H), 3,74 (с, 2Н), 3,05 (дд, J=10,5, 7,9 Гц, 1H), 2,88 (дд, J=11,1, 6,2 Гц, 1H), 2,71 (дд, J=11,1, 4,0 Гц, 1H), 2,49 (дд, J=13,0, 6,7 Гц, 1H), 2,40-2,24 (м, 2Н), 2,16-2,13 (м, 1H), 1,93 (с, 3Н). ¹³С ЯМР (D₂O) 150,5, 150,1, 145,4, 130,4, 113,6, 108,33, 75,0, 59,8, 56,6, 47,4, 45,9, 35,9, 14,8. HRMC (МН⁺ ) вычислено для C₁₃H₂₀ N₅OS: 294,1389. Найдено: 294,1394. Аналитически вычислено для C₁₃H₁₉ N₅OS. 4/3H₂O С, 49,19; Н, 6,88; N, 22,06; С, 10,10. Найдено: С, 49,86; Н 6,58; N, 21,63; С, 9,74.

Пример 39

Гидрохлорид (3R,4S)-3-гидрокси-4-(бензилтиометил)пирролидина (53). (3R,4R)-1-трет-бутоксикарбонил-3-гидрокси-4-(мезилоксиметил)пирролидин (смотри пример 34, 1,10 г, 3,7 ммоль) растворяют в ДМФА (2 мл) и по каплям добавляют к раствору бензилмеркаптана (870 мкл, 7,4 ммоль) и NaH (270 мг, 60% дисперсия в масле, 6,8 мл) в ДМФА (10 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь разбавляют толуолом, водой, затем насыщенным солевым раствором, сушат (MgS04) и концентрируют в вакууме. Полученный в результате остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с получением (3R,4S)-1-трет-бутоксикарбонил-3-гидрокси-4-(бензилтиометил) пирролидина в виде сиропа. Без дополнительной очистки продукт растворяют в МеОН (5,0 мл) и концентрированной HCl (1,0 мл) и концентрируют в вакууме с получением гидрохлорида (3R,4S)-3-гидрокси-4-(бензилтиометил)пирролидина (53) в виде сиропа (730 мг, 76% общий выход для двух стадий). ¹H ЯМР (D₂O) 7,40-7,27 (м, 5Н), 4,26-4,22 (м, 1Н), 3,74 (с, 2Н), 3,56 (дд, J=12,4, 7,2 Гц, 1Н), 3,37 (дд, J=12,8, 5,2 Гц, 1Н), 3,21 (дд, J=12,8, 3,0 Гц, 1Н), 3,07 (дд, J=12,4, 5,5 Гц, 1Н), 2,61-2,52 (м, 1Н), 2,47-2,34 (м, 2Н). ¹³С ЯМР (D ₂O), 138,7, 129,5, 129,3, 127,9, 73,5, 51,5, 48,5, 45,4, 35,9, 31,8. (МН⁺) вычислено для C ₁₂H₁₈NOS: 224,1109. Найдено: 224,1102.

Пример 40

(3R,4S)-1-[(6-трет-бутокси-7-бензилоксиметил-9-деазапурин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(бензилтиометил)пирролидин (54). К перемешиваемому раствору 5 (800 мг, 2,32 ммоль) и 53 (570 мг, 2,2 ммоль) в метаноле (10 мл) добавляют цианоборгидрид натрия (200 мг, 3,2 ммоль), и смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Неочищенную реакционная смесь адсорбируют на оксид кремния, загружают в сухом виде на колонку для флэш-хроматографии с силикагелем с получением соединения 54 (1,10 г, 78%) в виде твердого вещества. ¹H ЯМР (CDCl ₃) 8,45 (с, 1Н), 7,62 (с, 1H), 7,27-7,22 (м, 10Н), 5,75 (с, 2Н), 4,51 (с, 2Н), 4,15 (с, 2Н), 3,67 (с, 2Н), 3,38 (дд, J=10,7, 7,0 Гц, 1H), 3,12-3,02 (м, 2Н), 2,69-2,63 (м, 1H), 2,54-2,49 (м, 1H), 2,44-2,39 (м, 2Н), 1,70 (с, 9Н). ¹³ С ЯМР (COCl₃) 156,6, 150,6, 150,0, 138,3, 137,5, 134,4, 129,3, 129,0, 128,8, 128,2, 127,8, 117,1, 109,0, 83,9, 77,9, 75,2, 70,7, 60,5, 57,7, 49,1, 47,0, 36,8, 33,7, 29,0. (МН⁺ ) вычислено для C₃₁H₄₉ N₄O₃S: 547,2743. Найдено: 547,2723.

Пример 41

(3R,4S)-3-Ацетокси-1[(7-бензилоксиметил-9-деазагипоксантин-9-ил)месил]-4-(бензилтиометил)пирролидин (55). К раствору соединения 54 (1,16 г, 2,12 ммоль), DMAP (30 мг, кат.) и Et₃N (2 мл, избыток) в CH ₂Cl₂ (20 мл) по каплям добавляют уксусный ангидрид (1 мл, избыток) при комнатной температуре. Через 15 минут реакционную смесь разбавляют CH ₂Cl₂, промывают насыщенным раствором NaHCO₃, водой, насыщенным солевым раствором, сушат (MgSO₄) и концентрируют в вакууме. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с получением продукта (1,35 г) в виде сиропа. К раствору сиропа в CH₂Cl₂ (20 мл) по каплям добавляют ТФУ (5 мл) при комнатной температуре и концентрируют в вакууме. Полученный остаток еще раз растворяют в CH ₂Cl₂ и промывают насыщенным раствором NaHCO₃, затем водой, сушат (MgSO ₄) и концентрируют в вакууме с получением (3R,4S)-3-ацетокси-1-[(7-бензилоксиметил-9-деазагипоксантин-9-ил)метил]-4-(бензилтиометил)пирролидина (55) (900 мг, 80% для двух стадий) в виде пены. ¹H ЯМР (CDCl₃) 7,90 (с, 1Н), 7,33 (с, 1Н), 7,28-7,17 (м, 1OН), 5,91 (с, 2Н), 4,85 (ушир.с, 1Н), 4,58 (с, 2Н), 3,86-3,74 (м, 2Н), 3,68 (с, 2Н), 3,16-3,11 (м, 1Н), 2,84-2,80 (м, 2Н), 2,71 (дд, J=11,4, 4,6 Гц, 1Н), 2,50-2,36 (м, 2Н), 2,27-2,21 (м, 1Н), 2,00 (с, 3Н). ¹³С ЯМР (CDCl₃) 171,3, 156,2, 145,8, 141,9, 138,6, 137,5, 131,4, 129,2, 128,8, 128,3, 128,2, 127,4, 117,9, 115,2, 78,9, 77,0, 70,9, 59,8, 58,7, 48,3, 45,1, 36,9, 34,4, 21,5. HRMC (МН⁺ ) вычислено для C₂₉H₃₃ N₄O₄S; 533,2223. Найдено: 533,2236.

Пример 42

(3R,4S)-1-[(7-Бензилоксиметил-9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(бензилтиометил)пирролидин (56). Амин 55 (900 мг, 1,7 ммоль) растворяют в POCl ₃ (15 мл) и кипятят с обратным холодильником в течение 1 час. Полученный в результате раствор концентрируют в вакууме и совместно перегоняют с толуолом (×2) с получением твердого остатка. Без дополнительной очистки данный остаток перерастворяют в 7н. NH₃ в МеОН (15 мл) и нагревают в герметично закрытой пробирке при 130°С в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и полученный в результате остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с получением (3R,4S)-1-[(7-бензилоксиметил-9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(бензилтиометил)пирролидина (56) (720 мг, 87% выход для двух стадий) в виде сиропа. ¹H ЯМР (CDCl₃) 8,32 (с, 1Н), 7,67 (с, 1Н), 7,35-7,25 (м, 10Н), 5,52 (с, 2Н), 4,56 (с, 2Н), 4,23 (с, 2Н), 3,68 (с, 2Н), 3,54-3,48 (м, 1Н), 3,22 (д, J=3,4 Гц, 2Н), 2,83 (ушир.с, 1Н), 2,63-2,45 (м, 4Н). ¹³С ЯМР (CDCl₃ ) 152,2, 151,6, 149,5, 138,2, 135,7, 134,5, 129,2, 129,1, 128,9, 128,8, 128,2, 127,5, 115,2, 107,4, 77,6, 74,9, 70,7, 60,2, 57,3, 48,5, 46,9, 46,3, 36,7, 33,5, 23,1.

Пример 43

(3R,4S)-1-[(9-Деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(бензилтиометил)пирролидин (57). Амин 56 (330 мг, 0,7 ммоль) растворяют в растворе МеОН (4 мл) и концентрированной HCl (4 мл) и нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 90 минут. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, разбавляют водой (50 мл), промывают CHCl₃ (×2) и водный слой концентрируют в вакууме, с последующей совместной перегонкой с водой (×2). Полученный в результате остаток перерастворяют в NH₄OH, концентрируют в вакууме и остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с получением (3R,4S)-1-[(9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(бензилтиометил)пирролидина (57) (30 мг, 12%) в виде твердого вещества. ¹ Н ЯМР (d₄-MeOH) 8,17 (с, 1H), 7,46 (с, 1H), 7,26-7,16 (м, 5Н), 3,93-3,90 (м, 1Н), 3,83-3,74 (м, 2Н), 3,68 (с, 2Н), 3,03-2,97 (м, 1H), 2,80 (дд, J=10,2, 6,4 Гц, 1H), 2,66-2,58 (м, 2Н), 2,38 (дд, J=12,5, 8,9 Гц, 1H), 2,30 (дд, J=9,5, 7,2 Гц, 1H), 2,20-2,14 (м, 1H). ¹³С ЯМР (d₄-МеОН) 152,5, 151,4, 147,4, 140,4, 130,4, 130,4, 129,8, 128,3, 115,5, 112,9, 77,3, 62,7, 59,2, 49,3, 48,6, 37,5, 35,6. HRMC (MH⁺) вычислено для C₁₉ H₂₄N₅OS: 370,1702. Найдено: 370,1694.

Пример 44

Гидрохлорид (3R,4S)-1-[(8-аза-9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(бензилтиометил)пирролидина (58). К перемешиваемому раствору 6 (180 мг, 0,52 ммоль) и гидрохлорида (3R,4S)-3-гидрокси-4-(бензилтиометил)пирролидина (53) (95 мг, 0,37 ммоль) в метаноле (5 мл) добавляют цианоборгидрид натрия (20 мг, 0,32 ммоль) и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Неочищенную реакционную смесь адсорбируют на оксиде кремния, в сухом виде загружают на колонку с силикагелем для флэш-хроматографии и элюируют с получением (3R,4S)-1-{[8-аза-9-деаза-8-(тетрагидропиран-2-ил)-6-метоксигипоксантин-9-ил]метил]-3-гидрокси-4-(бензилтиометил)пирролидина (80 мг, 46%) в виде пены. Данное вещество еще раз растворяют в 7н. NH₃ в МеОН (15 мл) и нагревают в герметично закрытой трубке при 110°С в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и полученный остаток очищают флэш-хроматографией на силикагеле с получением (3R,4S)-1-{[8-аза-9-деаза-8-(тетрагидропиран-2-ил)-аденин-9-ил]метил}-3-гидрокси-4-(бензилтиометил)пирролидина. Неописанный продукт еще раз растворяют в метаноле (2,0 мл) и концентрированной HCl (2 мл), концентрируют в вакууме и полученный в результате остаток растирают в изопропаноле с получением гидрохлорида (3R,4S)-1-[(8-аза-9-деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(бензилтиометил)пирролидина (58) (52 мг, 82%) в виде белого твердого вещества. ¹³С ЯМР (d₄-MeOH) 153,7, 152,0, 139,9, 138,8, 135,1, 130,4, 130,0, 128,5, 124,6, 74,6, 61,4, 58,4, 50,4, 47,7, 37,4, 33,4. (МН ⁺) вычислено для C₁₈H ₂₃N₆OS: 371,1654. Найдено: 371,1670.

Пример 45

7-Бензилоксимерил-6-О-бензил-9-деаза-9-формил-N ²,N²-бис(4-мефоксибензил)гуанин (59). К перемешиваемому раствору 7-бензилоксиметил-6-О-бензил-9-бром-9-деаза-N ²,N²-бис (4-метоксибензил)гуанина по каплям добавляют Н-бутиллитий (0,5 мл, 1,5 М) (Evans, G.B.; Furneaux, R.H.; Huasler, H.; Larsen, J.S.; Tyier, P.C. рукопись готовится) в диэтиловом эфире (6 мл) и анизоле (3 мл) при -80°С в инертной атмосфере. Реакционную смесь перемешивают в течение дополнительных 30 минут при -80°С и затем добавляют ДМФА (1,0 мл), и реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры. Реакцию гасят водой (50 мл) и экстрагируют хлороформом (2×100 мл). Органические слои объединяют, промывают насыщенным солевым раствором, сушат (MgSO₄), фильтруют и концентрируют в вакууме с получением твердого остатка. Твердое вещество растирают в этаноле с получением соединения 59 (280 мг, 72%) в виде белого твердого вещества. Т.пл. 172-174°С. 1H ЯМР 10,25 (с, 1Н), 7,79 (с, 1Н), 7,30-7,21 (м, 13Н), 6,85-6,82 (м, 5Н), 5,62 (с, 2Н), 5,44 (с, 2Н), 4,84 (с, 4Н), 4,45 (с, 2Н), 3,79 (с, 6Н). ¹³С ЯМР 185,5, 159,4, 159,1, 156,5, 153,9, 136,9, 136,7, 134,9, 131,5, 129,5, 128,9, 128,5, 128,3, 128,0, 117,3, 114,2, 111,0, 78,4, 71,0, 67,9, 55,7, 49,5. HRMC (MH⁺ ) вычислено для C₃₈H₃₇ N₄O₅: 629,2764. Найдено: 629,2749.

Пример 46

(3R,4R)-{[6-O-бензил-7-бензилоксиметил-9-деаза-N ²,N²-бис(4-метоксибензил)гуанин-9-ил]метил}-3-гидрокси-4-гидроксимесилпирролидин (60). К перемешиваемому раствору 59 (530 мг, 0,84 ммоль) и 4.HCl (163 мг, 1,06 ммоль) в метаноле (10 мл) добавляют цианобор гидрид натрия (200 мг, 3,0 ммоль) и смесь далее перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь абсорбируют на оксид кремния и концентрируют в вакууме. Хроматографией полученного в результате остатка получают соединение 60 (430 мг, 70%) в виде белого твердого вещества. Т.пл. 98-100°С. ¹H ЯМР 7,49 (с, 1Н), 7,35-7,12 (с, 14Н), 6,81 (д, J=8,5 Гц, 4Н), 5,59 (с, 2Н), 5,47 (с, 2Н), 4,85-4,73 (м, 4Н), 4,44 (с, 2Н), 4,23-4,12 (м, 3Н), 3,75 (с, 6Н), 3,50-3,35 (м, 3Н), 3,20 (дд, J=12,0, 5,0 Гц, 1Н), 3,08 (д, J=12,0 Гц, 1Н), 2,95 (дд, J=11,4, 5,4 Гц, 1Н), 2,24 (ушир.с, 1Н). ¹³С ЯМР 159,0, 158,4, 156,7, 153,1, 137,6, 137,0, 135,0, 131,5, 129,4, 128,9, 128,7, 128,4, 128,3, 128,1, 128,0, 125,7, 114,3, 110,6, 105,1, 78,1, 73,1, 70,8, 68,0, 62,2, 60,7, 55,7, 54,8, 49,2, 48,9. HRMC (MH⁺) вычислено для С ₄₃Н₄₈N₅O ₆: 730,3605. Найдено: 730,3629.

Пример 47

(3R,4R)-1-[(9-Деазагуанин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин (61). К раствору соединения 60 (370 мг, 0,5 ммоль) в метаноле (4 мл) по каплям добавляют концентрированную HCl (2 мл) и полученный раствор нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 4 час. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и затем концентрируют в вакууме. Полученный остаток распределяют между водой и хлороформом, разделяют и водный слой концентрируют в вакууме. Хроматография на силикагеле и ионообменной хроматографией полученного в результате остатка получают 61 (39 мг, 28%) в виде белого твердого вещества. Т.пл. 223-225°С. ¹H ЯМР 7,18 (с, 1Н), 4,03-3,98 (м, 1Н), 3,58 (с, 2Н), 3,55 (дд, J=11,1, 6,3 Гц, 1Н), 3,45 (дд, J=11,1, 7,4 Гц, 1Н), 2,97 (дд, J=10,0, 8,5 Гц, 1Н), 2,79 (дд, J=10,9, 6,3 Гц, 1Н), 2,64 (дд, J=10,9, 4,0 Гц, 1Н), 2,35 (дд, J=10,3, 7,0 Гц, 1Н), 2,20-2,09 (м, 1Н). ¹³С ЯМР 158,6, 152,8, 143,5, 129,6, 112,7, 107,9, 72,8, 62,6, 60,2, 54,8, 48,9, 47,8. HRMC (MH⁺) вычислено для С₁₂Н₁₈О ₃: 280,1410. Найдено: 280,1413. Анализ (С ₁₂Н₁₇О₃·SH ₂O) С, Н, N.

Пример 48: Реакция Манниха - Общая методика

Пример 48.1 - Общая методика

(3R,4R)-1-[(9-деазагуанин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-гидроксиметилпирролидин (61). Гидрохлорид (3R,4R)-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидина (4) (154 мг, 1,0 ммоль) и ацетат натрия (82 мг, 1,0 ммоль) растворяют в воде (2 мл) и к данному раствору добавляют водный раствор формальдегида (82 мкл, 1,0 ммоль) и деазагуанин (120 мг, 0,8 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 95°С в течение 12 час. Добавляют силикагель (1,0 г) и смесь упаривают досуха. Очисткой хроматографией на силикагеле, используя смесь CH₂Cl ₂: MeOH:NH₄OH (5:4:1) в качестве элюента, получают продукт в виде соли уксусной кислоты. После преобразования в соль HCl и проведения ¹ Н ¹³С ЯМР-спектрального анализа было обнаружено, что данное соединение является идентичным во всех отношениях ранее описанному соединению (Evans, G.В.; Furneaux, R.H; Lewandowicz, A.; Schrainm, V.L.; Tyier, Р.С. J. Med. Chem., в печати.).

Таблица
Дополнительные соединения, полученные посредством общей методики реакции Манниха
Соединение	Время (час)	Заместители			Выход (%)
		R1	R2	R 3
8	16	ОН	ОН	ОН	47
10	1	ОН	ОН	NH2	65
57	1	SBn	ОН	NH2	72
62	1	SPhpCl	ОН	NH 2	72
63	3	ОН	ОН	Cl	78
64	3	ОН	ОН	N 3	65
65	1	ОАс	ОАс	NH2	49

Пример 48.2

(3R,4R)-1-[(9-Деазагипоксантин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-гидроксиметилпирролидин (8). Следуют общей методике реакции Манниха (выше) для получения соединения 8 в виде соли уксусной кислоты. После преобразования в соль HCl и проведения ¹H ¹³С ЯМР-спектрального анализа было обнаружено, что данное соединение является идентичным во всех отношениях ранее описанному соединению (Evans, G. В.; Furneaux, R.H; Lewandowicz, A.; Schraimn, V.L.; Tyler, P.С. J. Med. Chem., в печати.)

Пример 48.3

(3R,4R)-1-[(9-Деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-гидроксимесилпирролидин (10). Следуют общей методике реакции Манниха (выше) для получения соединения 10 в виде соли уксусной кислоты. ¹ H ЯМР (d₄-MeOH) 8,20 (с, 1Н), 7,65 (с, 1Н), 4,27 (с, 1Н), 4,22 (квинтет, J=3,0 Гц, 1Н), 3,59 (м, 2Н), 3,46 (дд, J=11,1, 8,3 Гц, 1Н), 3,26 (дд, J=11,4, 5,7 Гц, 1Н), 3,11 (дд, J=11,4, 3,0 Гц, 1Н), 2,95 (дд, J=11,2, 6,8 Гц, 1Н), 2,37 (ушир.с, 1Н), 1,82 (с, 3Н). ¹³С ЯМР (d₄-MeOH) 152,9, 151,9, 147,1, 132,0, 115,8, 108,2, 73,6, 63,1, 61,9, 56,0, 50,8, 49,5, 23,7. HRMC (MH⁺) вычислено для C ₁₂H₁₈N₅O ₂: 264,1461. Найдено: 264,1457.

Пример 48.4

(3R,4R)-1-[(9-Деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(бенэилтиометил)пирролидин (57). Следуют общей методике реакции Манниха (выше) для получения соединения 57 в виде соли уксусной кислоты. Соль уксусной кислоты преобразуют в свободное основание посредством ионообменной хроматографии. ¹H ЯМР (d₄-MeOH) 8,17 (с, 1Н), 7,46 (с, 1Н), 7,26-7,16 (м, 5Н), 3,93-3,90 (м, 1Н), 3,83-3,74 (м, 2Н), 3,68 (с, 2Н), 3,03-2,97 (м, 1Н), 2,80 (дд, J=10,2, 6,4 Гц, 1Н), 2,66-2,58 (м, 2Н), 2,38 (дд, J=12,5, 8,9 Гц, 1Н), 2,30 (дд, J=9,5, 7,2 Гц, 1Н), 2,20-2,14 (м, 1Н). ¹³С ЯМР (d₄-MeOH) 152,5, 151,4, 147,4, 140,4, 130,4, 130,4, 129,8, 115,5, 112,9, 77,3, 62,7, 59,2, 49,3, 48,6, 37,5, 35,6. HRMC (МН ⁺) вычислено для C₁₉H ₂₄N₅OS: 370,1702. Найдено: 370,1694.

Пример 48.5

(3R,4R)-1-[(9-Деазааденин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(4-хлорфенилтиометил)пирролидин (62). Следуют общей методике реакции Манниха (выше) для получения соединения 62 в виде соли уксусной кислоты. ¹ H ЯМР (d₄-MeOH) 8,25 (с, 1Н), 7,84 (с, 1Н), 7,35-7,23 (м, 5Н), 4,54 (с, 2Н), 4,30 (м, 1Н), 3,74 (дд, J=11,9, 7,9 Гц, 1Н), 3,59 (дд, J=12,2, 5,6 Гц, 1Н), 3,40-3,15 (м, 4Н), 2,89 (дд, J=13,5, 9,1 Гц, 1Н), 2,47 (ушир.с, 1Н), 1,98 (с, 3Н). ¹³С ЯМР (d₄ -MeOH) 153,0, 151,8, 146,1, 135,7, 134,0, 133,2, 132,2, 130,7, 115,7, 105,5, 74,6, 60,4, 57,3, 49,2, 47,7, 36,1, 23,0. HRMC (MH⁺) вычислено для C₁₈ H₂₁ClN₅OS: 390,1155. Найдено: 390,1264.

Пример 48.6

(3R,4R)-1-[(6-Хлор-9-деазапурин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин (63). Следуют общей методике реакции Манниха (выше) для получения соединения 63 в виде соли уксусной кислоты. ¹ H ЯМР (D₂O) 8,34 (с, 1Н), 7,98 (с, 1Н) | 4,48 (с, 2Н), 4,31 (м, 1Н), 3,68 (дд, J=12,1, 8,3 Гц, 1Н), 3,53 (д, J=5,9 Гц, 2Н), 3,45 (дд, J=12,6, 5,5 Гц, 1Н), 3,32 (дд, J=12,6, 2,5 Гц, 1Н), 3,13 (дд, J=12,0, 7,4 Гц, 1Н), 2,40 (ушир.с, 1Н), 1,82 (с, 3Н). ¹³С ЯМР (d ₄-MeOH) 149,7, 148,6, 143,4, 137,6, 124,8, 104,5, 71,3, 60,7, 59,8, 54,4, 48,0, 47,8, 23,5. HRMC (МН⁺ ) вычислено для C₁₂H₁₆ ClN₄O₂: 283,0962. Найдено: 283,0973.

Пример 48.7

(3R,4R)-1-[(6-Азидо-9-деазапурин-9-ил)метил]-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)пирролидин (64). Следуют общей методике реакции Манниха (выше) для получения соединения 64 в виде соли уксусной кислоты. ¹ H ЯМР (D₂O) 9,52 (с, 1Н), 7,89 (с, 1Н), 4,62 (с, 2Н), 4,38 (м, 1Н), 3,78 (дд, J=12,0, 8,5 Гц, 1Н), 3,60 (д, J=5,9 Гц, 2Н), 3,55 (т, J=5,5 Гц, 1Н), 3,42 (ушир.д, J=11,4 Гц, 1Н), 3,23 (дд, J=11,9, 7,3 Гц, 1Н), 2,48 (ушир.с, 1Н), 1,86 (с, 3Н). ¹³С ЯМР (D₂ O) 141,7, 138,6, 133,6, 132,2, 111,7, 107,2, 71,4, 60,8, 59,9, 54,6, 48,0, 48,0, 23,7.

Пример 48.8

(3R,4R)-1-[(9-Деазааденин-9-ил)метил]-3-ацетокси-4-(ацетоксиметил)пирролидин (65). Следуют общей методике реакции Манниха (выше) для получения соединения 65 в виде соли уксусной кислоты. ¹ H ЯМР (D₂O) 8,25 (с, 1Н), 7,69 (с, 1Н), 5,05 (квинтет, J=2,8 Гц, 1Н), 4,23-4,06 (м, 4Н), 3,40 (дд, J=10,5, 8,1 Гц, 1Н), 3,27-3,12 (м, 2Н), 2,77 (дд, J=10,5, 7,8 Гц, 1Н), 2,63 (м, 1Н), 2,03 (с, 3Н), 2,00 (с, 3Н), 1,98 (с, 3Н). ¹³С ЯМР (D₂O) 172,9, 172,6, 153,0, 151,1, 145,4, 132,1, 115,6, 108,8, 76,6, 65,1, 59,6, 55,8, 48,6, 45,7, 23,4, 21,3, 21,1. HRMC (МН⁺) вычислено для C₁₆H₂₂N ₅O₄: 348,1672. Найдено: 348,1669.

Пример 49

Ингибирование PNB

Реакция включает преобразование инозина (1 мМ) и неорганического фосфата (50 мМ, рН 7,4) в гипоксантин и 1-фосфат -D-рибозы. При анализе данным способом требуется, чтобы концентрация ингибитора была, по меньшей мере, в 10 раз (10×) больше концентрации фермента. Концентрация фермента составляет 1,6 пМ. Течение реакции сопровождается связанным анализом при мониторинге образования мочевой кислоты в результате окисления гипоксантина ксантиноксидазой (128 мкг; 59 (м)единиц/мл реакционной смеси). Для определения начальной константы диссоциации используют концентрацию ингибитора от 0 до 1 нМ. K_i определяют во временном интервале от 0 до 4 мин и равновесную константу диссоциации Ki* определяют во временном интервале от 35 до 45 мин. Константы ингибирования (Ki или Ki*) определяют в соответствии с уравнениями v=(k_cat) (A)/(K _m.(1+I/K_i)+A) для K _i или v=(k_cat) (A)/(K _m.(1+I/K_i*)+A) для K _i*.

Кинетические кривые для PNP человека, ингибируемого соединением (8), показаны на фиг.1; концентрация ингибитора указана на правой стороне.

Пример 50

Ингибирование МТАР и MTAN

Для описания ингибиторов по данному изобретению и ингибирования МТАР и/или MTAN in vivo применяют непрерывный спектрофотометрический анализ, а также периодический спектрофотометрический анализ. При непрерывном спектрофотометрическом анализе преобразование МТА в аденин измеряют по снижению поглощения при 274 нм. При 274 нм различие в спектральных свойствах является максимальным и коэффициент миллимолярной экстинкции (см^-1 ) составляет 1,6 для преобразования МТА в аденин. При периодическом анализе смеси от 10 до 20 мкл, содержащие 50 мкМ [2,8- ³H]MTA (285 импульс в мин/пмоль) в 50 мМ буфере из фосфата калия с рН 7,5, 10 мМ KCl и фермент, инкубируют при комнатной температуре. Реакции останавливают добавлением 1 мкл концентрированной HCl или 60% перхлорной кислоты. Аденин добавляют в качестве носителя (1-2 мкл, 6 мМ) и образцы по 5 мкл наносят в виде пятен на тонкослойные листы из целлюлозы и проявляют в смеси из 1М ацетата аммония с рН 7,55 и изопропанола при соотношении 9:1. После проявления пятна, соответствующие аденину, локализуют по поглощению ультрафиолетового света, вырезают и считывают содержание трития. Для анализа активности МТАР в образцах крови, 6 мкл смеси, содержащей 1:1 кровь:0,6% Тритон Х-100, добавляют к аналитической смеси, описанной выше, и в соответствующие моменты времени отбирают образцы для анализа тонкослойной хроматографией. Анализы активности МТАР из мышиной печени осуществляют сходным образом. Экстракты печени (3 мкл), содержащие приблизительно 100 мкг белка, добавляют к смесям для анализа в соответствующие моменты времени с последующим анализом тонкослойной хроматографией.

Ингибирование с медленным началом и константы ингибирования

Кинетику ингибирования с медленным началом и измерения значений K_i и K_i* осуществляют посредством добавления фермента с известной концентрацией (1-5 нМ) к реакционным смесям с высокими концентрациями субстрата и различными концентрациями ингибиторов. Концентрации субстрата, равные 150 мкМ, обычно применяют для МТА нуклеозидазы и равные 200 мкМ для МТА фосфорилазы. Эти концентрации соответствуют значениям OD в интервале 0,7 и 1,1 при 274 нМ. Образование продукта регистрируют по уменьшению поглощения при 274 нм. При условиях определения K_i * применяют высокие концентрации субстрата. В эксперимент включают два контроля, один без ингибитора и другой без фермента. Значения K_i, для данных ферментов рассчитывают по зависимости отношения начальных скоростей в присутствии ингибитора к скоростям без ингибитора от концентрации ингибитора, для известных К_m и концентрации субстрата по следующему выражению:

где

V_o' представляет собой скорость в присутствии ингибитора;

V _o представляет собой скорость в отсутствии ингибитора;

[I] представляет собой концентрацию ингибитора и

[S] представляет собой концентрацию субстрата,

a K _i* рассчитывают по следующему уравнению

где V_s' представляет собой скорость в устойчивом состоянии после достижения равновесия в присутствии ингибитора, а V_s представляет собой скорость в устойчивом состоянии в контроле без ингибитора. Данные уравнения описывают конкурентное ингибирование, где субстрат и аналог ингибитора переходного состояния связываются с ферментом взаимоисключающим образом.

Пример 51

Ингибирование МТАР мыши in vivo

Мышам скармливают 200 микрограммов соединения 57 и образцы крови отбирают в зависимости от времени. Клетки лизируют и анализируют остаточную активность МТАР в анализируемых смесях, содержащих МТА. При анализе измеряют высвобождение аденина из [2,8-³H]MTA. Результаты приведены на фиг.2.

Несмотря на то, что данное изобретение описано примерами, следует учитывать, что могут быть вариации или модификации не отходя от объема изобретения. Кроме того, если существуют известные эквиваленты конкретных признаков, то такие эквиваленты включены, как если бы на них конкретно ссылались в данном описании.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Настоящее изобретение относится к соединениям, которые представляют собой ингибиторы PNP, PPRT, MTAP, MTAN и/или NH. Полагают, что данные соединения будут применимы при лечении заболеваний, при котором ингибирование PNP, PPRT, MTAP, MTAN и/или NH является желательным. Такие заболевания включают рак, бактериальные инфекции, протозойные инфекции или заболевания, опосредованные Т-клетками.