агонисты альфа-2в или 2в/2с адренорецепторов для лечения нейродегенеративных заболеваний

Формула изобретения

1. Применение селективного агониста альфа-2В или альфа-2В/2С адренорецепторов для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения нейродегенеративного состояния головного мозга, вызывающего повреждение нейронов, окончания которых подходят к черной субстанции или отходят от нее.

2. Применение по п.1, при котором указанное лекарственное средство, содержащее селективный агонист альфа-2В или альфа-2В/2С адренорецепторов, вводят в головной мозг млекопитающего посредством системного введения.

3. Применение по п.2, при котором введение указанного лекарственного средства эффективно для предотвращения гибели или дегенерации нейронов, которые подходят к вентральным отделам покрышки моста или отходят от них.

4. Применение по п.1, при котором нейродегенеративное состояние представляет собой болезнь Паркинсона.

5. Применение по п.1, при котором нейродегенеративное состояние представляет собой болезнь Альцгеймера.

6. Применение по любому из пп.2-5, при котором указанный селективный агонист представляет собой соединение, выбранное из группы, включающей имидазолин, тиомочевину, тион, хиноксалин и имидазолон, которые могут быть замещены.

7. Применение по п.1, при котором указанный селективный агонист альфа-2В или альфа-2В/2С адренорецепторов является специфичным агонистом альфа-2В адренорецепторов или специфичным агонистом альфа-2В/2С адренорецепторов.

8. Применение по п.7, при котором указанный агонист представляет собой соединение, выбранное из группы, включающей имидазолин, тиомочевину, тион, хиноксалин и имидазолон, которые могут быть замещены.

9. Применение по п.1, при котором седативный эффект, сопутствующий введению указанного средства при определенной степени терапевтической эффективности, является менее выраженным, чем седативный эффект, сопутствующий введению дексмедетомидина при такой же степени терапевтической эффективности.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способам защиты нервных клеток, в частности клеток центральной нервной системы млекопитающих, от повреждений при ишемическом инсульте, в том числе от токсического действия глютамата и от апоптоза. Способы настоящего изобретения заключаются в применении селективных агонистов альфа-2 адренорецепторов для предотвращения повреждения и гибели нервных клеток, которые имеют место, например, при болезни Паркинсона и болезни Альцгеймера.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим соединения, которые способны воздействовать на альфа-2 адренергические рецепторы. Кроме того, настоящее изобретение включает в себя способы лечения различных заболеваний и состояний, в том числе заболеваний и состояний, вызванных нарушениями центральной нервной системы.

Адренергические рецепторы человеческого организма являются интегральными мембранными белками и подразделяются на два больших класса: альфа- и бета-адренорецепторы. Оба типа рецепторов обеспечивают работу периферического отдела симпатической нервной системы, связывая катехоламины, норэпинефрин и эпинефрин.

Норэпинефрин выделяется адренергическими нервными окончаниями, а эпинефрин - мозговым веществом надпочечников. Сродство адренергических рецепторов к данным веществам является одним из принципов классификации: альфа-адренорецепторы связывают норэпинефрин более активно, чем эпинефрин, и гораздо активнее, чем синтетическое соединение изопротеренол. Обратная закономерность характерна для бета-адренорецепторов. Во многих тканях реакции, такие как сокращение гладкой мускулатуры, на активацию альфа-адренорецепторов и бета-адренорецепторов являются разнонаправленными.

Впоследствии функциональное различие между альфа- и бета-адренорецепторами было детально изучено в ходе фармакологических исследований с использованием различных лабораторных животных и источников тканей. Альфа- и бета-адренорецепторы были дополнительно разделены на подтипы: альфа-1, альфа-2, бета-1 и бета-2.

Кроме того, было установлено, что эти рецепторы также могут существовать в различных вариантах: альфа-2 рецепторы подразделяются на подтипы альфа-2А, альфа-2В и альфа-2С.

Были установлены функциональные различия между альфа-1 и альфа-2 рецепторами и описаны соединения, обладающие специфическим сродством к ним.

Так, публикация WO 92/00073 содержит описание R (+) энантиомера теразозина, избирательно взаимодействующего с адренергическими рецепторами подтипа альфа-1. Избирательность действия данного соединения на альфа-1 и альфа-2 рецепторы имеет большое значение, поскольку стимуляция альфа-2 рецепторов подавляет секрецию эпинефрина и норэпинефрина, а подавление активности альфа-2 рецепторов повышает секрецию этих гормонов. Таким образом, использование неселективных альфа-адреноблокаторов (например, феноксибензамина и фентоламина) ограничено их способностью посредством стимуляции ₂-адренорецепторов повышать уровень катехоламинов в плазме крови, что приводит к известным физиологическим изменениям (увеличение частоты сердечных сокращений и стимуляция сокращения гладкомышечных клеток). Важно, что избирательность действия веществ в отношении альфа-1 и альфа-2 рецепторов определяется константой K_D, которая позволяет лишь сопоставить степень сродства веществ к рецепторам без учета фактического биологического эффекта от активации сравниваемых рецепторов.

Напротив, способ определения избирательности действия агонистов альфа-рецепторов включает в себя испытание RSAT (Технология отбора и амплификации рецепторов), описанное Messier с соавторами, High Throughput Assays Of Cloned Adrenergic, Muscarinic, Neurokinin And Neurotrophin Receptors In Living Mammalian Cells, Pharmacol. Toxicol. 76: 308-11 (1995), и адаптированное для изучения альфа-2 рецепторов. Данная работа включена в данное описание посредством ссылки. Данный способ позволяет определить вклад рецептора в уменьшение контактного торможения, которое приводит к избирательной пролиферации клеток, несущих на себе данный рецептор, в смешанной популяции всех клеток. Увеличение числа клеток определяется по содержанию маркерного гена, внесенного в клетки путем трансфекции (например, гена бета-галактозидазы, активность которой можно легко определить на пластине с 96 лунками). Рецепторы, активирующие G-белок, G_q, усиливают этот ответ. Альфа-2 рецепторы, которые обычно связаны с G_i-белком, активируют ответ согласно RSAT при взаимодействии с гибридным G_q-белком, который несет на себе домен узнавания рецептора G_i, т.н. Gq/ _i5 ² [Conklin и соавт., Substitution Of Three Amino Acids Switches Receptor Specificitv OfG _qa To That Of G_ia. Nature 363: 274-6. (1993)]. Данная работа включена в данное описание посредством ссылки.

Агонисты альфа-адренорецепторов эффективны для лечения различных заболеваний и патологических состояний. Такие вещества, как, например, клонидин, применяются в качестве системных и глазных антигипертензивных агентов, агентов для лечения аддитивных состояний, таких как курение и токсикомания, а также для лечения дисменорреи. Другой агонист альфа-адренорецепторов - тизанидин - используется для уменьшения спастического компонента при рассеянном склерозе посредством снижения мышечного тонуса. По данным некоторых исследований вещества этой группы обладают и некоторой анальгетической активностью.

Несмотря на эффективность использование этих средств часто сопровождается выраженными побочными эффектами, включающими в себя седацию, сердечно-сосудистые расстройства (гипотензия и урежение пульса), а также головокружение, что ограничивает показания к их назначению. В частности, кривые терапевтической и седативной дозы этих препаратов часто перекрещиваются, т.е. седативный эффект начинает проявляться при той же дозе, что и терапевтический (например, гипотензивный или анальгетический) in vivo.

Такие соединения, как клонидин, тизанидин и дексмедетомидин, описываются в литературе как агонисты альфа-2 адренорецепторов, что во многом основано на результатах исследования рецепторного связывания, см. Hieble et al., J. Med Chem. 38: 3415 (September 1, 1995); Ruffolo, et aL, J. Med. Chem. 38: 3681 (September 15,1995) - обе работы включены в данное описание посредством ссылки. Хотя эти вещества являются агонистами альфа-2 рецепторов, однако то, что эти вещества также обладают значительной активностью в отношении альфа-1 рецепторов, не является принятым. Взаимное влияние активации альфа-1 рецепторов и альфа-2 рецепторов также не является общепризнанньм или общеизвестным.

Напротив, вещество бримонидин и его 2-инидазолин-2-илиминовые производные, обладающие схожими свойствами (см. ниже), относятся к агонистам альфа-2 рецепторов и гораздо активнее взаимодействуют с альфа-2 рецепторами, чем с альфа-1 рецепторами.

Кроме того, эти соединения известны как «пан-агонисты», что означает, что они не являются селективными, либо проявляют только незначительную селективность по отношению к рецепторам подтипов альфа-2А, альфа-2В и альфа-2С.

Недавно были описаны некоторые соединения, являющиеся селективными или специфичными по отношению к рецепторам подтипов альфа-2В и/или альфа-2С, а также их преимущества. Так, например, патенты США 6329369 и 6313172 и заявки США 09/778975, 09/794874 и 10/153328 описывают такие соединения и их применение для лечения таких состояний, как боль, спастичность мышц, нейродегенеративные заболевания, спинномозговая ишемия, инсульт, дефицит памяти и познавательной способности, психозы, беспокойство и депрессия, гипертензия, застойная сердечная недостаточность, ишемия сердца и назальная конгестия. Вышеуказанные патенты и заявки включены в данное описание во всей полноте посредством ссылки. Согласно этим патентным документам соединения считаются селективными агонистами альфа-2В или альфа-2В/2С рецепторов, если отличие активности соединения как агониста альфа-2В или альфа-2В/2С рецепторов по сравнению с его активностью как агониста альфа-2А рецепторов более чем 0,3, а его активность по отношению к альфа-2А рецепторам по меньшей мере в 10 раз меньше, чем по отношению к альфа-2В или альфа-2С рецепторам.

Расстройства ЦНС относятся к неврологическим заболеваниям. Причиной некоторых из них считают дефицит холинергических, дофаминергических, адренергичесих и/или серотонинергических эффектов. Наиболее распространенными расстройствами ЦНС являются пресенильная деменция (начало болезни Альцгеймера), сенильная деменция (деменция Альцгеймеровского типа) и паркинсонизм, включая болезнь Паркинсона.

Существующее представление о болезни Альцгеймера основано на том, что в некоторых отделах мозга больных (например, в гиппокампе и в коре больших полушарий) наблюдается гибель нервных клеток. Исследованиями, проведенными в 1970-х гг., установлено, что некоторые из погибающих нейронов являются холинергическими (т.е. взаимодействуют посредством нейротрансмиттера ацетилхолина, который разрушается под действием фермента ацетилхолинэстеразы [Jones, et al.. Intern. J. Neurosci. 50: 147 (1990); Perry, Br. Med. Bull. 42: 63 (1986); Sitaram, et al.. Science 201: 274 (1978)].

Препараты, появившиеся на рынке в течение последнего десятилетия (например, такрин и донепезил), относятся к ингибиторам ацетилхолинэстеразы. Предотвращая распад ацетилхолина, эти вещества замедляют прогрессирование болезни Альцгеймера в начальной стадии. Однако после окончательной гибели холинергических нейронов и в отсутствие выработки ацетилхолина эти препараты становятся неэффективными.

Помимо гибели нейронов в головном мозге больных происходит образование белковых кластеров. Последние могут накапливаться как внутри нейронов, так и в межклеточном пространстве. Внутриклеточные кластеры также именуются нейрофибриллярными клубочками и выглядят как спирально сплетенные парные волокна. Исследования показали, что эти клубочки состоят из тау-протеина. Этот белок играет значительную роль, так как связывается с тубулином, из которого образуются микротрубочки. Содержание нейрофибриллярных клубочков коррелирует с тяжестью заболевания.

Внеклеточные белковые кластеры, или бляшки, состоят из отложений -амилоидного белка. Расположенные рядом с ними нейроны часто выглядят набухшими и деформированными, а амилоидные бляшки окружены воспалительной микроглией. Микроглия, являющаяся частью иммунной системы головного мозга, вероятно, предназначена для разрушения погибших нейронов и удаления их фрагментов, а возможно, и самих бляшек.

Неизвестно, нормально ли функционируют нейроны в области бляшки или рядом с ней, поскольку плотность бляшек лишь слабо коррелирует с тяжестью деменции. Кроме того, бляшки обнаруживаются у большинства пожилых людей независимо от того, есть ли у них болезнь Альцгеймера. Тем не менее их высокое содержание в гиппокампе и коре больших полушарий специфично для болезни Альцгеймера, и они появляются задолго до обнаружения нейрофибриллярных клубочков.

Бета-амилоидные бляшки содержат фрагмент интегрального мембранного белка, который называют белком-предшественником бета-амилоида (ВАРР), содержащий 42 аминокислоты. Этот фрагмент образуется в ходе двухэтапного протеазного расщепления белка ВАРР: сначала бета-секретазой, а затем - гамма-секретазой. Обычным продуктом расщепления белка бета-секретазой и гамма-секретазой является кислый пептид из 40 аминокислотных остатков, который в отличие от 42-аминокислотного кислого пептида не участвует в развитии болезни Альцгеймера.

Болезнь Паркинсона (БП) - это инвалидизирующее заболевание неизвестной этиологии, которое характеризуется тремором и ригидностью мышц. Особенностью данного заболевания является дегенерация дофаминергических нейронов (т.е. нейронов, выделяющих дофамин), особенно в черной субстанции и в вентральных отделах покрышки моста среднего мозга [Rinne, et al., Brain Res. 54: 167 (1991) and Clark, et al., Br. J. Pharm. 85: 827 (1985)]. Черная субстанция участвует в координации нейрональных сигналов, контролирующих движения и положение тела. В вентральных отделах покрышки моста содержатся нейроны, окончания которых проецируются на префронтальную кору, которая связана с высшими когнитивными функциями.

Было создано несколько препаратов для лечения БП. Одним из них является SINEMET®, выпускающийся в форме таблеток с замедленным высвобождением, содержащий смесь карбидопа и леводопа [DuPont Merck Pharmaceutical Co.]. Другим препаратом для лечения БП является ELDEPRYL® - таблетки, содержащие селефилина гидрохлорид [Somerset Pharmaceuticals, Inc.]. Еще одно средство - PARLODEL® - таблетки бромокриптина мезилата [Sandoz Pharmaceuticals Corporation]. Berliner и соавт. (патент США №5210076) предложили способ лечения БП и других нейродегенеративных заболеваний с помощью меланина. Однако ни один их этих препаратов не предотвращает гибель нервных клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Хотя известно, что определенные соединения, включая альфа-адренергические агонисты, такие, как бримонидин, обладают нейропротекторной активностью в отношении зрительного нерва, клеток сетчатки и нейронов спинного мозга при его местном или системном введении в зону повреждения, эти препараты ранее не предлагалось использовать для лечения нейродегенеративных заболеваний головного мозга, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, поскольку не считали, что альфа-2В и альфа-2С рецепторы в большом количестве присутствуют в этих областях головного мозга. Кроме того, хотя было показано, что альфа-адренергические агонисты обладают полезной нейропротекторной активностью при местном введении, седативные эффекты, которые они оказывают в терапевтических дозах, существенно ограничивают их практическое использование в качестве средств для не местного или системного введения.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что определенные альфа-адренергические агонисты при системном введении обладают нейропротекторным эффектом в отношении нейронов черной субстанции и вентральных отделов покрышки моста головного мозга. Кроме того, эти агенты характеризуются гораздо большим терапевтическим окном между нейропротекторной и седативной активностью по сравнению с большинством агонистов альфа-адренорецепторов, описанных ранее.

В этот класс соединений входят различные производные хиноксалина, обладающие активностью агонистов альфа-адренорецепторов, которые были первоначально предложены в качестве терапевтических агентов в работе Danielewicz и соавт. (патенты США №3890319 и 4029792). В этих патентах раскрыты соединения в качестве регуляторов сердечно-сосудистой системы, имеющие следующую формулу:

где 2-имидазолин-2-иламиногруппа может быть присоединена к хиноксалину в положении 5-, 6-, 7- или 8-; х, у и z могут быть присоединены в положениях 5-, 6-, 7- или 8- и могут представлять собой водород, галоген, C_1-5 алкил, C _1-5 алкокси или трифторметил; R является водородом, C _1-5-алкилом или C_1-5 алкокси в положении 2- или 3- или может отсутствовать. Указанные соединения могут быть синтезированы в соответствии с методами, описанными в патентах США 3890319 и 4029792.

В работе «Влияние агониста альфа-2 адренорецепторов с относительной избирательностью действия на зрительную систему у кошек, кроликов и обезьян», Current Eye Rsrch., 5, (9), pp.665-676 (1986), J. A. Burke и соавт. показали, что производное хиноксалина бримонидин, формула которого представлена ниже, эффективно снижает внутриглазное давление у кроликов, кошек и обезьян. Исследуемые вещества наносились местно на роговицу животных.

Известно, что агонист альфа-2 адренорецепторов бримонидин защищает клетки сетчатки глаза, в том числе фоторецепторы и ганглионарные клетки, от повреждения при глаукоме, пигментной дистрофии и возрастной дегенерации желтого пятна при местном или системном применении.

Первый аспект настоящего изобретения относится к способам лечения нейродегенеративных заболеваний головного мозга, включающим введение в головной мозг млекопитающего терапевтически эффективного количества селективного агониста альфа-2 адренорецепторов.

Используемый здесь термин «селективный агонист альфа-2 адренорецепторов» или «селективный альфа-2 агонист» означает, что это вещество имеет отношение активности в отношении альфа-2 рецепторов к активности в отношении альфа-1 рецепторов большее, чем такое отношение для агента дексмедатомидин. Предпочтительно активность в отношении альфа-2 рецепторов больше в 12 раз, чем активность в отношении альфа-1 рецепторов, более предпочтительно больше в 25 раз.

В одном варианте изобретения селективный альфа-2 агонист представляет собой 2-имидазолин-2-иламиновое соединение, имеющее формулу I, представленную выше. В более предпочтительном варианте изобретения селективный альфа-2 агонист представляет собой бримонидин и его соли.

В другом варианте изобретения селективный альфа-2 агонист представляет собой селективный альфа-2В агонист и альфа-2В/2С агонист. Используемый здесь термин «селективный агонист альфа-2В или 2В/2С адренорецепторов» или «селективный альфа-2В или 2В/2С агонист» означает, что это вещество имеет по меньшей мере в 10 раз (предпочтительно в 100 раз) большую активность в отношении альфа-2В или обоих альфа-2В и альфа-2С рецепторов, чем в отношении альфа-2А рецепторов.

Предпочтительно «селективное» соединение является «специфичным», что означает, что соединение имеет по меньшей мере в 100 раз (предпочтительно в 500 раз, более предпочтительно в 1000 раз, еще более предпочтительно в 5000 раз) большую активность в отношении указанных рецепторов или их подтипов по сравнению с активностью в отношении рецепторов сравнения.

Активность в отношении определенных рецепторов и их подтипов определяют методом RSAT, упомянутым выше.

Селективные альфа-2В или 2В/2С агонисты применяются в способах данного изобретения. Селективные альфа-2 агонисты имеют улучшенный терапевтический индекс благодаря пониженной величине ЕС₅₀ этих соединений (приводящей к терапевтическому эффекту при более низкой концентрации лекарства) по сравнению с аналогичными соединениями, обладающими активностью в отношении альфа-1 рецепторов, и при этом без изменения зависимости седативного эффекта от дозы. Кроме того, селективные альфа-2В или 2В/2С агонисты имеют сниженный седативный эффект из-за сниженной активности в отношении альфа-2А рецепторов, которую авторы считают ответственной за седацию и сердечно-сосудистые эффекты, такие как пониженная частота сердечных сокращений и кровяное давление. Эти эффекты максимальны, когда соединения являются скорее специфичными, чем селективными для определенной мишени.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам предотвращения гибели или дегенерации нервных клеток, которые подходят к области головного мозга, включающей голубое пятно, черную субстанцию и вентральные отделы покрышки моста, или отходят от нее, включающим введение селективного агониста альфа-2 адренорецепторов в указанные клетки. Согласно одному из вариантов изобретения селективный агонист альфа-2 адренорецепторов представляет собой селективный альфа-2 В или альфа-2С агонист. Предпочтительно агенты специфичны к определенной мишени.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения нейродегенеративного заболевания головного мозга, включающим введение в головной мозг терапевтически эффективного количества агониста альфа-2 адренорецепторов и антагониста альфа-1 адренорецепторов. Совместное применение агониста альфа-2 адренорецепторов и антагониста альфа-1 адренорецепторов позволяет создать лекарственное средство, обладающее селективной активностью в отношении альфа-2 рецепторов и имеет преимущества средства, содержащего только селективный альфа-2 агонист. См. заявку США 10/152424, включенную в данное описание посредством ссылки.

Этот новый способ особенно эффективен для профилактики заболевания, т.е. до начала гибели нейронов и в стадии, предшествующей прогрессированию болезни Альцгеймера или болезни Паркинсона. Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией механизма нейропротективного эффекта соединений изобретения, авторы предполагают, что описываемые соединения и способы изобретения могут стимулировать образование определенных факторов группы bcl-2; повышенная экспрессия этих факторов регистрируется как повышенная экспрессия мРНК, кодирующей их образование; эти факторы (bcl-2 и bcl-XL) могут подавлять процесс апоптоза и уравновешивать эффект факторов алоптоза из группы bcl-2 (bad и bax), которые образуются в результате губительных воздействий на нервные клетки. Таким образом, считают, что соединения изобретения, которые обладают нейропротективным эффектом, могут использоваться в комбинации с другими соединениями, которые ингибируют гибель клетки. Эти соединения, ингибирующие гибель клетки, включают в себя антагонисты NMDA-рецепторов, особенно мемантин, блокирующий цитотоксический эффект повышенной концентрации глутамата; ингибиторы синтетазы оксида азота; ингибиторы свободных радикалов и блокаторы кальциевых каналов.

Для введения соединений согласно изобретению может использоваться любой подходящий путь введения. Предпочтительным объектом способов изобретения является человек. При выборе пути введения необходимо стремиться к тому, чтобы достигнуть максимального положительного эффекта, т.е. низкой эффективной концентрации и малой частоты побочных эффектов.

Соединения согласно изобретению можно вводить перорально, парентерально, внутривенно, подкожно и посредством других путей системного введения. Соединения вводят в эффективной терапевтической дозе изолированно или в комбинации с подходящими фармацевтическими носителями или наполнителями.

В зависимости от предполагаемой схемы лечения терапевтическая доза соединений согласно изобретению может содержаться в любой приемлемой лекарственной форме (таблетки, свечи, пилюли, капсулы, порошки, микстуры, растворы, растворы для внутривенного введения, настои, суспензии, эмульсии, аэрозоли и пр.). Предпочтительным является однократный режим введения точной дозы препарата, а также введение лекарственной формы с замедленным высвобождением, обеспечивающей длительное и управляемое действие. Желательно, чтобы лекарственная форма включала в себя фармацевтически приемлемый наполнитель, активное соединение или соединения, а также другие лекарственные средства, носители, адъюванты и пр.

В твердых лекарственных формах могут использоваться нетоксичные носители, например маннитол, лактоза, крахмал, стеарат магния, натриевая соль сахарина, полиаклиленгликоли, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния, обладающие соответствующей степенью очистки. Примером твердой лекарственной формы по изобретению является суппозиторий, содержащий пропиленгликоль в качестве носителя.

Жидкие лекарственные формы могут представлять собой растворы или суспензии, содержащие одно или несколько активных соединений, а также адъюванты и носители, такие как вода, солевой раствор, водный раствор декстрозы, глицерин, этанол и пр. При необходимости лекарственная композиция может включать в себя небольшое количество вспомогательных веществ, таких как увлажнители, эмульгаторы, буферные агенты и пр. Примерами таких вспомогательных веществ являются ацетат натрия, монолаурат сорбитана, триэтаноламин, ацетат натрия, триэтаноламина олеат и пр. Способы приготовленя подобных лекарственных форм хорошо известны специалистам, например из Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 16th Edition, 1980. Состав композиции во всех случаях должен содержать одно или несколько соединений изобретения в количестве, достаточном для достижения необходимого терапевтического эффекта.

Парентеральное введение, как правило, осуществляется путем инъекций (подкожных, внутримышечных или внутривенных). Формы для инъекций представляют собой либо обычные формы (растворы или суспензии, порошки для приготовления растворов или суспензий), либо эмульсии или растворы для вливаний. Подходящими наполнителями для них являются вода, солевой раствор, декстроза, глицерин, этанол и пр. Кроме того, при необходимости фармацевтическая композиция для инъекций или вливаний может содержать небольшое количество нетоксичных вспомогательных веществ, таких как увлажнители, эмульгаторы, буферные вещества и пр.

Количество вводимого соединения зависит от эффекта, который следует достичь, вида млекопитающего, тяжести и природы заболевания, способа введения, фармакодинамики используемого вещества или веществ, а также от мнения лечащего врача. В общем случае терапевтически эффективная доза составляет от 0,5-1 до 100 мг/кг/сутки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к способам лечения нейродегенеративных заболеваний головного мозга, включающим введение в головной мозг млекопитающего терапевтически эффективного количества селективного агониста альфа-2 адренорецепторов.

Авторы изобретения обнаружили, что определенные селективные агонисты альфа-2 адренорецепторов обладают необычно высокой эффективностью по сравнению с соединениями, являющимися агонистами альфа-1 адренорецепторов. Авторы считают, что стимуляция альфа-1 адренорецепторов накладывается на нейропротекторное действию альфа-2 адренорецепторов, так что седативный эффект этих агентов таков, что величина ЕС₅₀ этих препаратов является такой же или находится в пределах порядка примерно 3-х кратной величины нейропротекторной активности этих веществ. Таким образом, нейропротекторный эффект неселективных агентов наблюдается при концентрации, которая способна вызвать седацию или является токсической. Отчасти по этой причине препараты, действующие на альфа-адренорецепторы, ранее широко не применялись в качестве нейропротекторов и использовались только для местного (локального) применения, например в офтальмологии, что исключало их системное действие.

В дополнение к соединениям, описанным здесь непосредственно или путем указания на источник информации, включенный в данное описание путем ссылки, соединения других типов, являющиеся селективными или специфичными в отношении альфа-2В и/или альфа-2В/2С рецепторов, описаны в заявках США 09/794874 и 10/153328, которые также включены в данное описание путем ссылки.

Не желая ограничиваться теорией, авторы объясняют нейропротекторный эффект этих агентов стимуляцией альфа-2В и/или альфа-2С рецепторов. До сих пор считали, что количество рецепторов данного типа в головном мозге невелико. Однако авторы обнаружили, что агенты и способы данного изобретения обеспечивают нейропротекторный эффект в отношении нейронов, окончания которых подходят к черной субстанции и вентральным отделам покрышки моста головного мозга, и считают, что эти эффекты также наблюдаются в отношении нейронов голубого пятна - области, которая вдается в кору. Таким образом, соединения, описанные здесь, являются полезными для лечения таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.

Пример 1

Методы:

Тест «открытое поле»

Животных помещают в отдельные пластиковые емкости с двумя рядами фотоэлементов (вертикальным и горизонтальным) с целью регистрации горизонтальных и вертикальных движений (т.е. пройденного расстояния и «подъемов»). Исследование проводится при низком уровне шума и приглушенном освещении. Движения животного в емкости оцениваются в течение 5 минут и подсчитываются на основании числа срабатываний фотоэлементов и направления их расположения. В ходе последнего теста учитываются только те перемещения, при которых животное опирается на задние лапы. Все эпизоды классифицируются как вставание «с опорой» и без «опоры». При вставании с опорой животное касается по меньшей мере одной передней лапой стенки контейнера. При вставании без опоры животное опирается только на задние лапы. Классификация эпизодов проводится в соответствии с видеозаписью эксперимента. Число эпизодов вставания без опоры является наиболее надежным показателем степени гибели дофаминовых нейронов.

Тест «Подвешивание за хвост»

Мышей подвешивают за хвост 3 раза по 10 минут. Каждую мышь удерживают за основание хвоста на высоте около 30 см над поверхностью стола до тех пор, пока мышь не поворачивается влево или вправо. Поворот влево оценивается как 0 баллов, вправо - 1 балл.

Во время тестирования учитывают также положение передних лап, которое оценивается по 4-балльной шкале. Вытянутые или расположенные над головой передние лапы соответствуют 0 баллам. Сжатые или прижатые к туловищу лапы - 3 балла. При промежуточном положении лап результат теста оценивается как 1 или 2 балла. Положение задних лап также оценивается по балльной шкале.

Тест «Постройка гнезд»

Четырех мышей одного пола, взятых из одной группы, помещают в пластиковую коробку. Затем в коробку помещают комок из 8 полосок, изготовленных из бумажного полотенца. Через 24, 48, 72 и 96 часов после введения препарата оценивают наличие «гнезд», построенных из бумажных полосок. Результаты классифицируют следующим образом: 0 баллов = бумага разделена на клочки и образует гнездо, закрывающее животное целиком; 1 = бумага разделена на клочки и образует гнездо, не закрывающее животное сверху; 2 = отдельные полоски разделены на клочки, на бумаге следы зубов, полоски собраны кучно в одной области; 3 = на полосках бумаги имеются отдельные следы зубов, полоски не собраны в клубок; 4 = отсутствуют признаки постройки гнезда.

Подсчет количества нейронов

Через 55-60 дней после инъекции нейротоксина МРТР мышей выводят из эксперимента с помощью нембутала натрия. Головной мозг перфузируют раствором фосфатного буфера, а затем - фиксатором Lana's (смесь параформальдегида и пикриновой кислоты). Головной мозг полностью извлекают и помещают в фиксатор Lana's на 7-10 дней. Затем готовят фронтальные срезы мозга с интервалом 50 мкм с помощью вибратома. Срезы окрашивают с помощью антител к тирозингидроксилазе, которая является лимитирующим фактором синтеза дофамина. Микроскопию срезов проводят при 100-кратном увеличении. Срезы тканей (2.9 и 3.6 мм кзади от теменной линии) используются для подсчета нейронов в черной субстанции и вентральной части покрышки мозга. Эти срезы проходят через среднюю часть ростральной половины и среднюю часть каудальной половины черной субстанции. Учитываются только нейроны с положительным окрашиванием на ТГ, от которых отходят 2-6 нейритов. Общее среднее число нейронов вычисляется по 4 срезам (ростральный, каудальный, левый и правый). Отдельно оценивают среднее число нейронов в черной субстанции и вентральной области покрышки мозга. Эти показатели анализируют с помощью дисперсионного способа, а различия между группами - по критерию Фишера.

Порядок проведения эксперимента.

У мышей, получающих инъекции пиридинового токсина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МРТР), наблюдаются очаги гибели дофаминергических нейронов в черной субстанции и вентральной области покрышки мозга. Уменьшение числа дофаминергических нейронов в черной субстанции клинически соответствует болезни Паркинсона. Тот же процесс в вентральной части покрышки мозга может приводить к когнитивному дефициту как при болезни Паркинсона, так и при болезни Альцгеймера, что объясняется проекцией проводящих путей в коре лобных долей.

30 Мышей линии С57В 1/В6 (возраст 8-12 недель) выдерживают в виварии 12-14 дней с целью адаптации. Затем животных случайным образом распределяют между группами: одна из групп получает МРТР и диметилсульфоксид (плацебо); другая - только плацебо, третья - МРТР и бримонидин (3 мг/кг/сутки), четвертая - МРТР и соединение 197075 (3 мг/кг/сутки), пятая - МРТР и соединение 196923 (3 мг/кг/сутки).

В патенте США 6313172 приведена информация о синтезе и следующей структуре соединения AGN 197075:

В заявке США №09/815362 (авторы те же, что и авторы данного изобретения), приведена информация о синтезе и следующей структуре соединения AGN 196923:

Патент США 6313172 и заявка США №09/815362 включены в данное описание посредством ссылки и считаются частью данной заявки.

В описываемых испытаниях каждую мышь подвергали тесту «открытое поле» и тесту «подвешивание за хвост». Тест «открытое поле» является наиболее распространенным способом оценки поведения мышей после введения МРТР и позволяет оценить нарушение транспорта дофамина в черной субстанции. Тест «подвешивание за хвост» позволяет оценить повреждение полосатого тела; тест с постройкой гнезда - недостаточную стимуляцию полосатого тела со стороны коры лобных долей.

Четырем группам из пяти вводят исследуемое вещество (или плацебо) путем инфузии. Введение осуществляют подкожно через осмотический микроирригатор в течение 14 дней со скоростью 0,25 мкл/ч. Через 3 дня после имплантации микроирригатора проводят тест «открытое поле» и тест «подвешивание за хвост». Аналогичные тесты проводят в контрольной группе мышей, которым не устанавливают микроирригатор. Непосредственно после тестирования животным опытной группы подкожно вводят МРТР в дозе 40 мг/кг. Затем во всех группах проводят тест «открытое поле» и тест «подвешивание за хвост» через 10-12 дней и 30-40 дней после инъекции МРТР. Тест «открытое поле» и тест с фиксацией за хвост повторяют через 50-55 дней после введения МРТР.

При оценке поведения животных результаты тестирования анализируют с помощью дисперсионного способа, различия между группами оценивают по критерию Фишера.

Результаты

Тест «Открытое поле»

До введения МРТР не наблюдалось значительных различий между 5 группами и вообще не наблюдалось различий между группами в пройденном расстоянии или в количестве вставаний на лапы.

Через 10 и 30 дней после введения МРТР животные в контрольной группе были значительно более активными, чем в опытной группе. У мышей, получавших бримонидин, достоверных изменений активности не отмечено, т.е. отсутствовали достоверные различия между данной группой и плацебо-контролем. Соединение AGN 196923 значительно уменьшает активность (по сравнению с плацебо), и эти мыши не отличаются от контрольной группы. Соединение AGN 197075 дает подобные результаты. Соединения AGN не приводили к значительным отличиям от плацебо через 30 дней после обработки МРТР.

Инъекция МРТР вызывала снижение общего числа вставаний на задние лапы через 10 дней. Через 30 дней не было эффекта МРТР на число вставаний (по сравнению с группой плацебо) и только небольшое уменьшение вставаний наблюдалось по сравнению с контрольной группой.

Через 50-60 дней после обработки МРТР мыши, которым вводили соединение AGN 19707, делали значительно больше вставаний без опоры, чем в группе плацебо. Мыши из группы плацебо делали немного меньше вставаний без опоры, чем нормальные мыши. Не наблюдалось влияния ни МРТР, ни соединений AGN на вставания с опорой.

Тест «Подвешивание за хвост»

Перед введением МРТР не наблюдалось различий между группами в тесте «подвешивание за хвост» и вообще не наблюдалось различий между группами по положению задних лап после введения МРТР. Введение МРТР значительно уменьшило число вытягивании передних лап во время каждого из трех подвешиваний. Таким образом, это уменьшение не проходит с течением времени. Соединение AGN 197075 значительно снижает это уменьшение в течение времени, когда его вводят. Соединение AGN 196923 и бримонидин не имеют такого эффекта. Однако все три соединения снижают это уменьшение через некоторое время после введения (т.е. через 14 дней после введения).

Подсчет числа нейронов

В черной субстанции мышей, получавших МРТР, число нейронов было на 58% меньше, чем в необработанных животных. Однако у животных, получавших бримонидин, соединения AGN 197075 или AGN 196923, наблюдалась значительно меньшая потеря нейронов.

Группа	Среднее число нейронов (± статистическая погрешность)
Контроль	60 (±5)
Плацебо+МРТР	25 (±2)
AGN 196923+МРТР	35 (±2)
AGN 197075+МРТР	37 (±2)
Бримонидин	32 (±1)

В вентральной области покрышки мозга на фоне введения МРТР наблюдалось уменьшение числа нейронов в среднем на 28% по сравнению с контролем. Каждое из тестируемых соединений (AGN 196923, AGN 197075 и бримонидин) уменьшало этот показатель приблизительно на 10%.

Приведенные выше примеры иллюстрируют возможные варианты осуществления изобретения и не ограничивают объем его правовой охраны. Изобретение определено в формуле, которая завершает это описание.