способ усиления мобилизации стволовых клеток

Формула изобретения

Способ усиления мобилизации стволовых клеток, характеризующийся тем, что в условиях экстремальных воздействий или при патологических состояниях, сопровождающихся мобилизацией стволовых клеток, или в условиях воздействия на организм модификаторов функциональной активности стволовых клеток, вызывающих мобилизацию стволовых клеток в кровь, вводят гиалуронидазу внутрибрюшинно в дозе 500-1500 УЕ/кг в течение 2 дней 1 раз в сутки.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицине, конкретно к клеточным технологиям и фармакологии.

Известно, что экстремальные воздействия и развитие определенных заболеваний сопровождаются активацией механизмов адаптации «глубокого» резерва, связанных со стволовыми клетками (СК) [1, 2, 3, 4, 5]. При этом зачастую может происходить мобилизация в кровь тех или иных клеток-предшественников, способных в дальнейшем участвовать в регенерации пораженных органов-мишеней. Причем активация указанных механизмов в ряде случаев оказывается недостаточной для «успешной» адаптации организма [1, 4, 5].

Известны способы фармакологической мобилизации различных типов стволовых клеток, применяемые в эксперименте с целью разработки перспективных методов лечения заболеваний, с помощью различных цитокинов: гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) [1, 3, 6], фактора стволовой клетки (ФСК) [7], пептида-аналога SDF-1-фактора (СТСЕ-0214) [8] и пр. факторов (ГМ-ГСФ, ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-11, MIP-1, 2, эритропоэтин, тромбопоэтин [6]). При этом самым распространенным (в связи с его эффективностью и безопасностью) является способ мобилизации СК с помощью Г-КСФ. В то же время для достижения более значимого мобилизирующего эффекта исследователи применяют и комбинации различных цитокинов [9]. Однако даже комплексное использование факторов, входящих в когорту, стимулирующих мобилизацию СК, дает весьма неоднозначные результаты [6].

Адекватный прототип авторами не обнаружен.

В связи с вышеизложенным усиление мобилизации СК при экстремальных воздействиях и определенных заболеваниях, а также при воздействиях различных фармакологических модификаторов функциональной активности СК представляется актуальной задачей, решение которой, в свою очередь, может стать важным этапом в повышении эффективности терапии различных заболеваний.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение уровня мобилизации стволовых клеток при экстремальных воздействиях, патологических состояниях и при введении в организм факторов, вызывающих мобилизацию стволовых клеток.

Поставленная задача достигается тем, что при экстремальных воздействиях и патологических состояниях, сопровождающихся мобилизацией стволовых клеток, либо при введении в организм факторов, вызывающих мобилизацию стволовых клеток, внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2 дней вводят гиалуронидазу в дозе 500-1500 УЕ/кг.

Новым в предлагаемом способе является введение 1 раз в сутки в течение 2 дней гиалуронидазы в дозе 500-1500 УЕ/кг.

В настоящее время весьма перспективными для лечения различных заболеваний представляются способы клеточной терапии, в том числе и с помощью фармакологических агентов, способных регулировать функции стволовых клеток. Вместе с тем на сегодняшний день известна важная роль гиалуроновой кислоты (ГК) в регуляции функционального состояния различных типов стволовых клеток. ГК является наиболее распространенным гликозаминогликаном (ГАГ), участвующим в образовании межклеточного матрикса различных тканей, в том числе и костного мозга [10, 11, 12]. При этом стволовые клетки и клетки-предшественники различной степени зрелости in situ связаны с гиалуронатом через CD44 и RHAMM-рецепторы [13, 14]. Участие гиалуроновой кислоты в реализации процесса мобилизации СК до сих пор остается не изученным. Известен фермент, расщепляющий ГК - гиалуронидаза, введение которого способно нарушать энграфтинг экзогенных СК в костный мозг [13], но абсолютно не известна возможность гиалуронидазы влиять на выход клеточных элементов из органов гемопоэза в кровь.

Диапазон доз гиалуронидазы, предлагаемых в заявленном изобретении, был определен как эффективный и выявлен в отдельных сериях экспериментов. Отсутствие самостоятельного мобилизирующего эффекта гиалуронидазы в отношении СК было показано в предварительных экспериментах.

Факт применения гиалуронидазы с целью усиления мобилизации СК при экстремальных воздействиях и патологических состояниях, а также при воздействиях различных фармакологических модификаторов функциональной активности СК для специалиста не является очевидным и не вытекает явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют повысить эффективность способа мобилизации стволовых клеток, и предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение для создания новых эффективных способов клеточной терапии. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом.

Лабораторному животному (мыши) при экстремальном воздействии, либо при патологическом состоянии, сопровождающемся мобилизацией стволовых клеток, либо при введении в организм факторов, вызывающих мобилизацию стволовых клеток, внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2 дней вводят гиалуронидазу в дозе 500-1500 УЕ/кг.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac в количестве 678 штук, массой 18-20 г. Мыши 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

В качестве экстремальных воздействий были выбраны модели, абсолютно отличающиеся по вызывающим их причинам, различные по механизмам развивающихся изменений на разных уровнях организации, а также эффектам и исходам: иммобилизационный стресс (ИС), представляющий собой «ярко» выраженное гемопоэзстимулирующее воздействие, - 12-часовая иммобилизация мягкими вязками в положении лежа на спине [15] и цитостатическая миелосупрессия, вызванная однократным внутрибрюшинным введением максимально переносимой дозы циклофосфана (250 мг/кг) [16].

При этом в костном мозге и периферической крови на 3-и сутки при ИС и на 5-е сут при цитостатическом воздействии методом клонирования в полувязкой среде определяли содержание коммитированных мезенхимальных клеток-предшественников - фибробластных колониеобразующих единиц (КОЕ-Ф) и стволовых кроветворных клеток (СКК) - гранулоцитарно-эритро-макрофагально-мегакариоцитарных единиц (КОЕ-ГЭММ) [17], а также на 3-и сутки опыта с помощью метода лимитирующих разведений - количество мезенхимальных (истинных) стволовых клеток (МСК) [3, 18].

В качестве моделей патологических состояний были выбраны заболевания, занимающие основное место в структуре общей заболеваемости и социальной значимости. При этом выбранные модели заболеваний: постгипоксическая энцефалопатия [1], инфаркт миокарда [3] и хронический токсический гепатит [2] существенно отличаются между собой по этиологии и патогенезу. Указанное обстоятельство (в связи со схожестью многих звеньев патогенеза при различных заболеваниях и наличием единых регуляторных и адаптивных механизмов макроорганизма) дает возможность во многом экстраполировать получаемые на данных моделях результаты на большинство известных патологических состояний.

На данных моделях патологии в костном мозге и периферической крови в каждом случае в определенные сроки (указанные в конкретных примерах) при инфаркте миокарда с помощью метода лимитирующих разведений определяли количество МСК [3, 18], при экспериментальном гепатите оценивали содержание МСК и КОЕ-Ф [9], а при энцефалопатии определяли число МСК, СКК (КОЕ-ГЭММ) и КОЕ-Ф [3, 9, 18].

Для фармакологической мобилизации СК использовали: Г-КСФ в дозе 125 мкг/кг [1, 3], ФСК в дозе 50 мкг/кг [7], пептид-аналог SDF-1-фактора - СТСЕ-0214 в дозе 10 мг/кг [8] и совместное назначение Г-КСФ и ФСК в указанных дозах. Выбор цитокинов был основан на различных спектрах их специфической активности, механизмов действия, биологическом назначении и способности вызывать мобилизацию различных типов СК.

При этом при введении Г-КСФ, ФСК и при их совместном введении определяли количество МСК, КОЕ-Ф и СКК (КОЕ-ГЭММ) в костном мозге и периферической крови, а при введении СТСЕ-0214 только содержание СКК (КОЕ-ГЭММ).

Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вил-коксона-Манна-Уитни.

Пример 1.

Иммобилизационный стресс (ИС) у животных вызывали путем 12-часовой иммобилизации на спине с помощью мягких вязок. При этом опытным животным сразу после воздействия 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 500 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.

В ходе эксперимента иммобилизационный стресс на 3-и сутки после воздействия приводил к повышению в костном мозге количества КОЕ-Ф и СКК. При этом в периферической крови наблюдалось увеличение содержания стволовых кроветворных клеток до 191,7% от фона. В то же время введение гиалуронидазы в дозе 500 УЕ/кг достоверно увеличивало по отношению к контролю как КОЕ-Ф, так и СКК в периферической крови, а также приводило к возрастанию числа циркулирующих МСК до 200% от фона (табл.1).

Таким образом, двукратное введение гиалуронидазы в дозе 500 УЕ/кг на фоне моделирования иммобилизационного стресса приводило к возрастанию в периферической крови как мезенхимальных клеток-предшественников различной степени зрелости (в том числе МСК), так и стволовых кроветворных клеток.

Таблица 1 Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при иммобилизационном стрессе и при введении 500 УЕ/кг гиалуронидазы на фоне иммобилизационного стресса (М±m)
	КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов	КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов	СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов	СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров	МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов	МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров
фон	5,4±0,21	0,57±0,1	7,8±0,41	2,4±0,7	12,0±3,0	9,0±3,0
Контроль (ИС)	7,2±0,53*	0,71±0,2	10,1±0,3*	4,6±0,2*	14,0±4,0	13,0±3,0
ИС + гиалуронидаза	7,45±0,4*	1,6±0,21*#	9,85±1,2	5,87±0,5*#	12,0±3,0	18,0±3,0*
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05

Пример 2.

Иммобилизационный стресс у животных вызывали путем 12-часовой иммобилизации на спине с помощью мягких вязок. При этом опытным животным сразу после воздействия 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1500 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.

Введение гиалуронидазы в дозе 1500 УЕ/кг при моделировании иммобилизационного стресса сопровождалось достоверным увеличением содержания КОЕ-Ф и СКК в периферической крови относительно контроля (до 253,5% и 130,7% соответственно) (табл.2).

Пример 3.

Миелосупрессию вызывали однократным внутрибрюшинным введением циклофосфана (ЦФ) в МПД. При этом опытным животным на фоне введения цитостатика 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 500 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.

Введение циклофосфана приводило к снижению содержания в костном мозге коммитированных мезенхимальных клеток-предшественников и, напротив, увеличению количества в гемопоэтической ткани СКК и МКС на 5-е сутки эксперимента. В периферической крови наблюдалось увеличение содержания КОЕ-Ф и стволовых кроветворных клеток. При этом назначение гиалуронидазы сопровождалось выраженным увеличением выхода коммитированных мезенхимальных клеток-предшественников и СКК (табл.3).

Таблица 2 Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при иммобилизационном стрессе и при введении 1500 УЕ/кг гиалуронидазы на фоне иммобилизационного стресса (М±m)
	КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов	КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов	СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов	СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров	МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов	МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров
фон	5,4±0,21	0,57±0,1	7,8±0,41	2,4±0,7	12,0±3,0	9,0±3,0
Контроль (ИС)	7,2±0,53*	0,71±0,2	10,1±0,3*	4,6±0,2*	14,0±4,0	13,0±3,0
ИС + гиалуронидаза	6,3±0,7	1,8±0,4*#	9,0±1,4	6,0±0,41*#	12,0±3,0	14,0±4,0
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05

Таким образом, двукратное введение гиалуронидазы в дозе 500 УЕ/кг на фоне цитостатического воздействия приводило к возрастанию в периферической крови определенных типов стволовых клеток.

Таблица 3 Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при цитостатическом воздействии и при введении 500 УЕ/кг гиалуронидазы на фоне миелосупрессии (М±m)
	КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов	КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов	СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов	СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров	МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов	МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров
фон	5,4±0,21	0,57±0,1	7,8±0,41	2,4±0,7	12,0±3,0	9,0±3,0
ЦФ	0,2±0,03*	0,99±0,14*	14,7±1,1*	3,9±0,09*	24,0±4,0*	8,0±2,0
ЦФ + гиалуронидаза	0,4±0,08*	2,4±0,6*#	12,8±0,7*	8,0±0,31*#	22,0±6,0	12,0±4,0
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05

Пример 4.

Миелосупрессию вызывали однократным внутрибрюшинным введением циклофосфана (ЦФ) в МПД. При этом опытным животным на фоне введения цитостатика 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1500 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.

Введение гиалуронидазы в дозе 1500 УЕ/кг приводило к увеличению количества КОЕ-Ф и СКК в костном мозге. При этом, однако, имела место мобилизация в периферическую кровь лишь СКК (до 194,9% от контроля), но на аналогичном уровне таковой при введении гиалуронидазы в дозе 500 УЕ/кг (табл.4).

Таким образом, двукратное введение гиалуронидазы в дозе 1500 УЕ/кг на фоне цитостатического воздействия приводило к возрастанию в периферической крови стволовых кроветворных клеток.

Таблица 4 Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при цитостатическом воздействии и при введении 1500 УЕ/кг гиалуронидазы на фоне миелосупрессии (М±m)
	КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов	КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов	СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов	СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров	МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов	МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров
фон	5,4±0,21	0,57±0,1	7,8±0,41	2,4±0,7	12,0±3,0	9,0±3,0
ЦФ	0,2±0,03*	0,99±0,14*	14,7±1,1*	3,9±0,09*	24,0±4,0*	8,0±2,0
ЦФ + гиалуронидаза	1,4±0,04*#	1,7±0,47*	14,5±1,2*	7,6±0,4*#	18,0±4,0	10,0±3,0
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05

Пример 5.

Постгипоксическую энцефалопатию моделировали с помощью гермокамеры объемом 500 мл. Мыши помещались в гермокамеру, крышка закрывалась, и мыши оставались там до агонального судорожного припадка или остановки дыхания, определяемой визуально, в течение 10-15 секунд. После извлечения из гермокамеры и восстановления самостоятельного дыхания, через 5-10 минут, мыши вновь помещались в гермокамеру также до наступления агонального состояния (генерализованного судорожного припадка или остановки дыхания). При этом опытным животным сразу после моделирования энцефалопатии 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 500 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.

Развитие энцефалопатии на 5-е сутки опыта приводило к увеличению числа в костном мозге как мезенхимальных клеток-предшественников различной степени зрелости, так и еще в большей степени количества СКК. При этом статистически значимая мобилизация происходила только в отношении стволовых кроветворных клеток (до 327,5% от фона). Отмечалась и четкая тенденция к увеличению содержания МСК в периферической крови (до 166,7% от фона), однако статистической достоверности данные изменения не достигали. Введение гиалуронидазы увеличивало содержание КОЕ-Ф в гемопоэтической ткани, а также способствовало их усиленному выходу в кровь. Кроме того, фермент значительно повышал количество СКК в периферической крови и приводил к развитию феномена мобилизации МСК (табл.5).

Таблица 5 Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при развитии энцефалопатии и при введении 500 УЕ/кг гиалуронидазы на фоне моделирования энцефалопатии (М±m)
	КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов	КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов	СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов	СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров	МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов	МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров
фон	8,7±0,68	1,34±0,1	9,1±0,63	1,4±0,6	31,0±4,0	12,0±3,0
энцефалопатия (ЭП)	17,2±1,3*	2,4±1,0	29,8±3,4*	8,87±1,2*	59,0±9,0*	20,0±4,0
ЭП + гиалуронидаза	28,9±2,7*#	4,6±1,2*#	25,3±1,7*	16,0±2,6*#	47,0±8,0	28,0±4,0*
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05

Пример 6.

Постгипоксическую энцефалопатию моделировали с помощью гермокамеры объемом 500 мл. Мыши помещались в гермокамеру, крышка закрывалась, и мыши оставались там до агонального судорожного припадка или остановки дыхания, определяемой визуально, в течение 10-15 секунд. После извлечения из гермокамеры и восстановления самостоятельного дыхания, через 5-10 минут, мыши вновь помещались в гермокамеру также до наступления агонального состояния (генерализованного судорожного припадка или остановки дыхания). При этом опытным животным сразу после моделирования энцефалопатии 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1500 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора. Введение гиалуронидазы в дозе 1500 УЕ/кг сопровождалось увеличением в гемопоэтической ткани на 5-е сутки не только КОЕ-Ф, но и МСК, и также как при применении более низкой дозы способствовало их усиленному выходу в кровь (табл.6).

Таблица 6 Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при развитии энцефалопатии и при введении 1500 УЕ/кг гиалуронидазы на фоне моделирования энцефалопатии (М±m)
	КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов	КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов	СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов	СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров	МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов	МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров
фон	8,7±0,68	1,34±0,1	9,1±0,63	1,4±0,6	31,0±4,0	12,0±3,0
энцефалопатия (ЭП)	17,2±1,3*	2,4±1,0	29,8±3,4*	8,87±1,2*	59,0±8,0*	20,0±4,0
ЭП + гиалуронидаза	26,2±2,0*#	5,1±0,87*#	30,4±3,0*	18,2±2,45*#	86,0±9,0	28,0±4,0*
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05

Таким образом, гиалуронидаза приводила к увеличению степени мобилизации всех изучаемых типов стволовых клеток на фоне развития неоднозначных изменений их содержания в костном мозге.

Пример 7.

Инфаркт миокарда моделировали внутривенным введением адреналина в дозе 0,25 мг/кг [3] в собственной модификации. При этом опытным животным сразу после моделирования энцефалопатии 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1000 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.

Моделирование инфаркта миокарда приводило к увеличению количества МСК в костном мозге и периферической крови. При этом, однако, введение гиалуронидазы более значительно усиливало выход МСК в периферическую кровь на фоне отсутствия изменений со стороны костномозгового пула МСК (табл.7).

Таблица 7 Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при инфаркте миокарда и при введении 1000 УЕ/кг гиалуронидазы на фоне моделирования инфаркта миокарда (М±m)
	МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов	МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров
фон	31,0±4,0	12,0±3,0
Инфаркт миокарда (ИМ)	78,0±10,0*	46,0±8,0*
ИМ + гиалуронидаза	74,0±12,0*	82,0±12,0*#
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05

Таким образом, введение гиалуронидазы усиливало мобилизацию мезенхимальных стволовых клеток в периферическую кровь.

Пример 8.

У мышей хронический гепатит (ХГ) моделировали внутрижелудочным введением тетрахлоруглерода (ТХУ) в виде 20% раствора на оливковом масле в объеме 0,2 мл/мышь живого веса в течение трех недель дважды в неделю [2]. При этом опытным животным сразу после моделирования ХГ 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1000 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.

В контрольной группе было обнаружено увеличение количества в костномозговой ткани КОЕ-Ф на 7-е сутки после последнего введения ТХУ, в состав которых входят как предшественники стромальных элементов, так и истинные СК, что подтверждалось возрастанием числа МСК в гемопоэтической ткани в те же сроки наблюдения. Кроме того, отмечалось увеличение содержания клеток-предшественников фибробластов и МСК в периферической крови, свидетельствующее о мобилизации стволовых клеток различной степени зрелости при данном виде воздействия, представляющем по своей сути экстремальное воздействие. При этом введение гиалуронидазы сопровождалось увеличением в гемопоэтической ткани в исследуемые сроки КОЕ-Ф на фоне резкого возрастания числа КОЕ-Ф и МСК в периферической крови (табл.8).

Таблица 8 Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при развитии хронического гепатита и при введении 1000 УЕ/кг гиалуронидазы на фоне моделирования гепатита (М±m)
	КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов	КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов	МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов	МСК в периферической крови, на 10 6 мононуклеаров
фон	15,17±1,3	6,5±0,99	24,0±4,0	31,0±7,0
ХГ	28,7±3,4*	9,1±0,48*	66,0±8,0*	64,0±10,0*
ХГ + гиалуронидаза	39,2±2,1*#	14,09±0,7*#	84,0±18,0*	88,0±4,0*#
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05

Таким образом, введение гиалуронидазы при экспериментальном гепатите приводило к увеличению выхода в кровь мезенхимальных клеток-предшественников различной степени зрелости.

Пример 9.

Опытным экспериментальным интактным животным на фоне введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора («Нейпоген», Hoffman-la-Roche, Щвейцария) в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сутки в течение 3 дней дополнительно 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 500 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным вводили подкожно гранулоцитарный колониестимулирующий фактор («Нейпоген», Hoffman-la-Roche, Щвейцария) в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сутки в течение 3 дней в эквивалентном объеме (0,2 мл) и внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.

В ходе эксперимента введение рчГ-КСФ приводило к снижению числа коммитированных клеток-предшественников в костном мозге на 4-е сутки после начала воздействия. При этом содержание МСК в костном мозге оставалось на уровне фоновых значений. Указанные изменения сопровождались достоверным увеличением в периферической крови числа МСК до 311,1% от фона, СКК до 201,6% от фона и КОЕ-Ф до 152,4% от фона. Дополнительное введение гиалуронидазы приводило к значительному накоплению МСК и КОЕ-Ф в костном мозге. Вместе с тем совместное применение рчГ-КСФ и гиалуронидазы сопровождалось существенно более выраженным возрастанием числа МСК (до 1000,0% от фона), СКК (до 386,6% от фона) и КОЕ-Ф (до 211,9% от фона) в периферической крови (табл.9).

Пример 10.

Опытным экспериментальным животным на фоне введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора («Нейпоген», Hoffman-la-Roche, Щвейцария) в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сутки в течение 5 дней дополнительно 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1500 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным вводили подкожно гранулоцитарный колониестимулирующий фактор («Нейпоген», Hoffman-la-Roche, Щвейцария) в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сутки в течение 5 дней в эквивалентном объеме (0,2 мл) и внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.

Совместное применение рчГ-КСФ и 1500 УЕ/кг гиалуронидазы сопровождалось более выраженным возрастанием числа МСК, СКК и КОЕ-Ф в периферической крови относительно контрольных животных, получавших только рчГ-КСФ (но менее значимым по сравнению с группой мышей, которым дополнительно вводили 500 УЕ/кг гиалуронидазы) (см. табл.9).

Таким образом, введение гиалуронидазы на фоне назначения рчГ-КСФ интактным животным значительно повышает степень мобилизации различных типов стволовых клеток костного мозга в периферическую кровь.

Таблица 9 Динамика содержания стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при введении рчГ-КСФ (1) и совместном назначении рчГ-КСФ с 500 УЕ/кг (2) и 1500 УЕ/кг (3) гиалуронидазы (М±m)
	КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов	КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов	СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов	СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров	МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов	МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров
фон	3,17±0,48	7,0±0,37	14,3±2,1	7,0±0,98	28,0±4,0	9,0±5,0
1	2,0±0,26*	10,67±0,7*	12,6±1,2	14,1±2,3*	22,0±4,0	28,0±4,0*
2	7,5±0,76*#	14,8±0,7*#	16,31±4,5	27,2±1,4*#	51,0±7,0*#	90,0±26,0*#
3	7,2±0,78*#	15,1±0,84*#	14,3±3,9	24,2±2,3*#	37,0±12,0	62,0±18,0*
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с показателями в группе животных, получавших только Г-КСФ, при р<0,05

Пример 10.

Интактным животным на фоне введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора («Нейпоген», Hofrman-la-Roche, Щвейцария) в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сутки в течение 3 дней совместно с внутрибрюшинным введением фактора стволовой клетки («Sigma», США) в дозе 50 мкг/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней дополнительно 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1000 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным вводили по аналогичным схемам только рчГ-КСФ и ФСК.

В ходе эксперимента на 4-е сутки после введения рчГ-КСФ и ФСК наблюдалось закономерное возрастание количества СК в периферической крови при изменениях неоднозначного характера со стороны их костномозговых пулов. При этом в большей степени отмечалось повышение числа циркулирующих коммитированных клеток-предшественников (КОЕ-Ф до 344,5% и СКК до 347% от фона), чем истинных (мезенхимальных) стволовых клеток (до 266,7% от фона). Дополнительное введение животным гиалуронидазы практически не оказывало влияния на содержание различных типов СК в гемопоэтической ткани по сравнению с контролем. Однако при этом имело место еще более выраженное возрастание числа родоначальных клеток в периферической крови. При этом максимальный уровень подъема отмечался, напротив, у наиболее примитивных - МСК (до 1088,2% от фона), чем у КОЕ-Ф (до 401,4% от фона) и СКК (до 502,0% от фона) (табл.10).

Таблица 10 Динамика содержания стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при введении рчГ-КСФ совместно с ФСК (1) и дополнительном введении 1000 УЕ/кг гиалуронидазы (2) (M±m)
	КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов	КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов	СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов	СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров	МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов	МСК в периферической крови, на 10 6 мононуклеаров
фон	3,17±0,48	7,0±0,37	14,3±2,1	7,0±0,98	28,0±4,0	9,0±6,0
1	2,64±0,14*	24,12±1,0*	19,6±3,4	24,3±1,8*	34,0±6,0	24,0±4,0*
2	6,4±0,72*#	28,1±1,09*	14,4±0,78	36,4±2,3*#	44,0±8,0*	98,0±22,0*#
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05

Таким образом, введение гиалуронидазы при ее совместном назначении с рчГ-КСФ и ФСК приводило к усилению мобилизации СК, причем в большей степени наиболее низкодифференцированных.

Пример 11.

Интактным животным на фоне однократного внутривенного введения белка СТСЕ-0214 (пептида-аналога SDF-1-фактора) в дозе 10 мг/кг («Sigma», США) дополнительно 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1000 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным в эквивалентном объеме (0,2 мл) внутривенно и 0,5 мл внутрибрюшинно вводили физиологический раствор.

На 3-и сутки после начала эксперимента в костном мозге регистрировалось увеличение числа стволовых кроветворных клеток (КОЕ-ГЭММ). В то же время имело место и увеличение количества данных элементов в периферической крови (до 433,3% от фона). Введение гиалуронидазы отменяло влияние фактора на содердание СКК в костном мозге, но приводило к значительно более выраженному увеличению числа данных родоначальных клеток в периферической крови, достигающему 747,6% от фона (табл.11).

Таблица 11 Динамика содержания стволовых кроветворных клеток в костном мозге и периферической крови при введении СТСЕ-0214 (1) и при дополнительном введении 1000 УЕ/кг гиалуронидазы (2) (M±m)
	СКК в костном мозге, на 10 5 миелокариоцитов	СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров
фон	5,8±0,97	2,1±0,24
1	8,4±0,36*	9,1±2,3*
2	7,62±1,2	15,7±1,07*#
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с показателями в группе животных, получавших только Г-КСФ, при р<0,05

Таким образом, гиалуронидаза усиливала мобилизирующий эффект субстанции СТСЕ-0214 (пептида-аналога SDF-1-фактора) в отношении стволовых кроветворных клеток.

В целом, исходя из полученных данных, следует, что при введении гиалуронидазы на фоне моделирования экстремальных воздействий и при патологических состояниях различного генеза, а также при введении в организм веществ, вызывающих выход СК в кровь, наблюдается значительное возрастание уровня мобилизированных стволовых клеток. Причем в большей степени происходит усиление мобилизирующего эффекта в отношении наиболее ранних родоначальных элементов - мезенхимальных (истиных) стволовых клеток. При этом механизмом указанного специфического действия данного фермента, очевидно, является разрушение/ослабление связей СК с одним из основных компонентов межклеточного матрикса - гиалуроновой кислотой, связанной in situ со стволовыми клетками посредством специфических рецепторов.

Предлагаемый способ позволяет существенно увеличить уровень мобилизации различных типов стволовых клеток при экстремальных воздействиях и патологических состояниях, а также повысить степень мобилизирующего эффекта веществ, способных стимулировать выход СК в кровь, путем дополнительного введения гиалуронидазы.