замещенные бензоксазолы и аналоги в качестве эстрогенных агентов

Формула изобретения

1. Соединение формулы (II), имеющее структуру

где R₁ означает алкенил из 2-7 атомов углерода, где группа алкенил необязательно замещена -CN или галогеном;

R₂ и R _2а, каждый независимо, означают водород или галоген;

R₃ и R_3а, каждый независимо, означают водород или галоген;

Х означает О;

или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение по п.1, где Х означает О.

3. Соединение по п.1 или 2, где R₁ означает алкенил из 2-3 атомов углерода, который необязательно замещен -CN или галогеном.

4. Соединение по п.1, которым является 2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол или его фармацевтически приемлемая соль.

5. Соединение по п.1, которым является 2-(2-фтор-4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол или его фармацевтически приемлемая соль.

6. Соединение по п.1, которым является 2-(2,3-дифтор-4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол или его фармацевтически приемлемая соль.

7. Соединение по п.1, которым является 4-бром-2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол или его фармацевтически приемлемая соль.

8. Соединение по п.1, которым является 4,6-дибром-2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол или его фармацевтически приемлемая соль.

9. Соединение по п.1, которым является 7-(1-бромвинил)-2-(2-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол или его фармацевтически приемлемая соль.

10. Соединение по п.1, которым является 7-(1-бромвинил)-2-(2,3-дифтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол или его фармацевтически приемлемая соль.

11. Соединение по п.1, которым является 7-аллил-2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол или его фармацевтически приемлемая соль.

12. Соединение по п.1, которым является 2-(3,5-дифтор-4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол или его фармацевтически приемлемая соль.

13. Соединение по п.1, которым является 2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-7-(1-фторвинил)-1,3-бензоксазол-5-ол или его фармацевтически приемлемая соль.

14. Соединение, которым является

а) 2-(5-гидрокси-1,3-бензоксазол-2-ил)бензол-1,4-диол,

b) 3-(5-гидрокси-1,3-бензоксазол-2-ил)бензол-1,2-диол,

c) 2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

d) 2-(3-хлор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

e) 2-(2-хлор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

f) 2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-6-ол,

g) 2-(3-трет-бутил-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-6-ол,

h) 2-(6-гидрокси-1,3-бензоксазол-2-ил)бензол-1,4-диол,

i) 3 -(6-гидрокси-1,3-бензоксазол-2-ил)бензол-1,2-диол,

j) 4-(6-гидрокси-1,3-бензоксазол-2-ил)бензол-1,2-диол,

k) 2-(3-хлор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-6-ол,

l) 4-(5-гидрокси-1,3-бензоксазол-2-ил)бензол-1,3-диол,

m) 4-(6-гидрокси-1,3-бензоксазол-2-ил)бензол-1,3-диол,

n) 6-хлор-2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

о) 6-бром-2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

p) 6-хлор-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

q) 5-хлор-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-6-ол,

r) 7-бром-2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

s) 7-бром-2-(2-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

t) 7-бром-2-(2,3-дифтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

u) 2-(4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол,

v) 7-(1,2-дибромэтил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

w) 7-(1-бромвинил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

x) 7-этинил-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

у) 2-(4-гидроксифенил)-7-пропил-1,3-бензоксазол-5-ол,

z) 7-бутил-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

аа) 7-циклопентил-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

bb) этил 5-гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-7-карбоксилат,

cc) 2-(4-гидроксифенил)-7-фенил-1,3-бензоксазол-5-ол,

dd) 2-(4-гидроксифенил)-7-метокси-1,3-бензоксазол-5-ол,

ее) 7-этил-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

ff) 7-этил-2-(2-этил-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

gg) 5-гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-7-карбальдегид,

hh) 7-(гидроксиметил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

ii) 7-(бромметил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

jj) [5-гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-7-ил]ацетонитрил,

kk) 7-(1-гидрокси-1-метилэтил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол],

ll) 2-(4-гидроксифенил)-7-изопропенил-1,3-бензоксазол-5-ол,

mm) 2-(4-гидроксифенил)-7-изопропил-1,3-бензоксазол-5-ол],

nn)7-бром-2-(4-гидрокси-3-(трифторметил)фенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

оо) 7-(2-фурил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

рр) 2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-7-(2-фурил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

qq) 2-(4-гидроксифенил)-7-тиен-2-ил-1,3-бензоксазол-5-ол,

rr) 2-(4-гидроксифенил)-7-(1,3-тиазол-2-ил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

ss) 2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-5-гидрокси-1,3-бензоксазол-7-карбонитрил,

tt) 4-бром-2-(4-гидроксифенил)-7-метокси-1,3-бензоксазол-5-ол,

uu) 4,6-дибром-2-(4-гидроксифенил)-7-метокси-1,3-бензоксазол-5-ол,

vv) 7-бром-2-(3,5-дифтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол,

или его фармацевтически приемлемая соль.

15. Способ лечения или ингибирования воспалительной болезни кишечника, болезни Крона, язвенного проктита или колита у млекопитающего, нуждающегося в этом, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества соединения по любому из пп.1-13.

16. Способ лечения или ингибирования вазомоторных симптомов у млекопитающего, нуждающегося в этом, который включает введение указанному млекопитающему эффективного количества соединения по любому из пп.1-13.

17. Способ ингибирования зачатия у млекопитающего, нуждающегося в этом, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества соединения по любому из пп.1-13.

18. Способ лечения или ингибирования артрита у млекопитающего нуждающегося в этом, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества соединения по любому из пп.1-13.

19. Способ по п.18, где артритом является ревматоидный артрит, остеоартрит или спондилоартропатии.

20. Способ лечения или ингибирования опухания или эрозии суставов, или лечения или ингибирования поражения сустава после артроскопических или хирургических процедур у млекопитающего, нуждающегося в этом, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества соединения по любому из пп.1-13.

21. Способ лечения или ингибирования эндометриоза у млекопитающего, нуждающегося в этом, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества соединения по любому из пп.1-13.

22. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью агониста или антагониста рецептора эстрогена, включающая эффективное количество соединения по любому из пп.1-13 и фармацевтический носитель.

23. Способ лечения или ингибирования воспалительной болезни кишечника у млекопитающего, нуждающегося в этом, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества селективного в отношении ER лиганда, выбранного из соединений формулы II по п.1 или соединений по п.14, где сродство связывания селективного в отношении ER лиганда с ER по меньшей мере приблизительно в 20 раз больше, чем его сродство связывания с ER .

24. Способ по п.23, где воспалительной болезнью кишечника является болезнь Крона, язвенный колит, недетерминантный колит, инфекционный колит или язвенный проктит.

25. Способ по п.24, где сродство связывания селективного в отношении ER лиганда с ER по меньшей мере приблизительно в 50 раз больше, чем его сродство связывания с ER .

26. Способ по п.25, где селективный в отношении ER лиганд вызывает увеличение массы влажной матки, которое менее чем около 10% от того, которое наблюдается для максимально эффективной дозы 17 -эстрадиола в стандартной фармакологической тест-процедуре, измеряющей утеротрофическую активность, и селективный в отношении ER лиганд вызывает увеличение mRNA казеин-киназы II, которое менее чем около 10% от того, которое наблюдается для максимально эффективной дозы 17 -эстрадиола в стандартной фармакологической тест-процедуре, измеряющей маммотрофическую активность.

27. Способ по п.26, где селективный в отношении ERR лиганд не увеличивает значительно (р>0,05) массу влажной матки по сравнению с контролем, то есть лишен утеротрофической активности, и не увеличивает значительно (р>0,05) mRNA казеин-киназы II по сравнению с контролем, то есть лишен маммотрофической активности.

28. Способ лечения или ингибирования артрита у млекопитающего, нуждающегося в этом, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества неутеротрофического немаммотрофического селективного в отношении ERR лиганда, выбранного из соединений формулы II по п.1 или соединений по п.14, где сродство связывания селективного в отношении ER лиганда с ER- по меньшей мере приблизительно в 20 раз больше, чем его сродство связывания с ER .

29. Способ по п.28, где артритом является ревматоидный артрит, остеоартрит или спондилоартропатии.

30. Способ по п.29, где сродство связывания селективного в отношении ER лиганда с ER по меньшей мере приблизительно в 50 раз больше, чем его сродство связывания с ER .

31. Способ по п.30, где селективный в отношении ER лиганд вызывает увеличение массы влажной матки, которое менее чем около 10% от того, которое наблюдается для максимально эффективной дозы 17 -эстрадиола в стандартной фармакологической тест-процедуре, измеряющей утеротрофическую активность, и селективный в отношении ER лиганд вызывает увеличение в mRNA казеин-киназы II, которое менее чем около 10% от того, которое наблюдается для максимально эффективной дозы 17 -эстрадиола в стандартной фармакологической тест-процедуре, измеряющей маммотрофическую активность.

32. Способ по п.31, где селективный в отношении ER лиганд не увеличивает значительно (р>0,05) массу влажной матки по сравнению с контролем, то есть лишен утеротрофической активности, и не увеличивает значительно (р>0,05) mRNA казеин-киназы II по сравнению с контролем, то есть лишен маммотрофической активности.

33. Способ лечения или ингибирования опухания или эрозии суставов, или лечения или ингибирования поражения сустава после артроскопических или хирургических процедур у млекопитающего нуждающегося в этом, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества неутеротрофического немаммотрофического селективного в отношении ER лиганда, выбранного из соединений формулы II по п.1 или соединений по п.14, где сродство связывания селективного в отношении ERR лиганда с ER по меньшей мере приблизительно в 20 раз больше, чем его сродство связывания с ER .

34. Способ по п.33, где сродство связывания селективного в отношении ER лиганда с ER по меньшей мере приблизительно в 50 раз больше, чем его сродство связывания с ER .

35. Способ лечения или ингибирования эндометриоза у млекопитающего, нуждающегося в этом, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества селективного в отношении ER лиганда, выбранного из соединений формулы II по п.1 или соединений по п.14, где сродство связывания селективного в отношении ER лиганда с ER по меньшей мере приблизительно в 20 раз больше, чем его сродство связывания с ER .

36. Способ по п.35, где сродство связывания селективного в отношении ER лиганда с ER по меньшей мере приблизительно в 50 раз больше, чем его сродство связывания с ER .

37. Способ по п.36, где селективный в отношении ER лиганд вызывает увеличение массы влажной матки, которое менее чем около 10% от того, которое наблюдается для максимально эффективной дозы 17 -эстрадиола в стандартной фармакологической тест-процедуре, измеряющей утеротрофическую активность, и селективный в отношении ER лиганд вызывает увеличение в mRNA казеин-киназы II, которое менее чем около 10% от того, которое наблюдается для максимально эффективной дозы 17 -эстрадиола в стандартной фармакологической тест-процедуре, измеряющей маммотрофическую активность.

38. Способ по п.37, где селективный в отношении ER лиганд не увеличивает значительно (р>0,05) массу влажной матки по сравнению с контролем, то есть лишен утеротрофической активности, и не увеличивает значительно (р>0,05) mRNA казеин-киназы II по сравнению с контролем, то есть лишен маммотрофической активности.

39. Способ получения соединения формулы II

где R₁ означает алкенил из 2-7 атомов углерода, где группа алкенил необязательно замещена -CN или галогеном;

R₂ и R _2a, каждый независимо, означают водород или галоген;

R₃ и R_3а, каждый независимо, означают водород или галоген;

Х означает О;

или его фармацевтически приемлемой соли,

включающий взаимодействие соединения формулы

где R₁, R₂ , R_2a и Х являются такими, как определено выше, с соединением формулы

где R₃ и R _3а являются такими, как определено выше, и Y означает галоген, -ОН или алкокси из 1-6 атомов углерода;

с последующим, в случае необходимости, превращением полученного соединения формулы II в его фармацевтически приемлемую соль.

Описание изобретения к патенту

Предпосылки к созданию изобретения

Это изобретение относится к замещенным бензоксазолам, которые могут применяться в качестве эстрогенных агентов.

Плейотропные эффекты эстрогенов в тканях млекопитающих получили хорошее документальное подтверждение, и в настоящее время признано, что эстрогены влияют на многие системы органов [Mendelsohn and Karas, New England Journal of Medicine 340: 1801-1811 (1999), Epperson, et al., Psychosomatic Medicine 61: 676-697 (1999), Crandall, Journal of Womens Health & Gender Based Medicine 8: 1155-1166 (1999), Monk and Brodaty, Dementia & Geriatric Cognitive Disorders 11: 1-10 (2000), Hurn and Macrae, Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 20: 631-652 (2000), Calvin, Maturitas 34: 195-210 (2000), Finking, et al., Zeitschrift fur Kardiologie 89: 442-453 (2000), Brincat, Maturitas 35: 107-117 (2000), Al-Azzawi, Postgraduate Medical Journal 77: 292-304 (2001)]. Эстрогены могут оказывать влияния на ткани различными путями, и наиболее хорошо охарактеризованным механизмом действия является их взаимодействие с эстрогенными рецепторами, ведущее к альтерациям в генной транскрипции. Эстрогенные рецепторы являются лиганд-активируемыми факторами транскрипции и принадлежат к надсемейству нуклеарных гормональных рецепторов. К другим членам указанного семейства относятся рецепторы прогестерона, андрогена, глюкокортикостероида и минералокортикоида. Под действием связывающего лиганда указанные рецепторы димеризуются и могут активировать генную транскрипцию либо непосредственным связыванием со специфическими последовательностями DNA (известными как чувствительные элементы), либо путем взаимодействия с другими факторами транскрипции (такими как АР1), которые, в свою очередь, связываются непосредственно со специфическими последовательностями DNA [Moggs and Orphanides, EMBO Reports 2: 775-781 (2001), Hall, et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869-36872 (2001), McDonnell, Principles of Molecular Regulation, p351-361 (2000)]. Класс "корегуляторных" протеинов, которые могут также взаимодействовать с лиганд-связывающим рецептором и далее модулировать его транскрипционную активность (McKenna, et al., Endocrine Reviews 20: 321-344 (1999)]. Было также показано, что эстрогенные рецепторы могут подавлять NFkB-опосредуемую транскрипцию как зависимым от лиганда, так и независимым образом [Quaedackers, et al., Endocrinology 142: 1156-1166 (2001), Bhat, et al., Journal of Sreroid Biochemistry & Molecular Biology 67: 233-240 (1998), Pelzer, et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 286: 1153-7 (2001)].

Эстрогенные рецепторы также могут быть активированы фосфорилированием. Это фосфорилирование опосредуется ростовыми факторами, такими как EGF, и вызывает изменения в генной транскрипции в отсутствие лиганда [Moggs and Orphanides, EMBO Reports 2: 775-781 (2001), Hall, et al., Journal of Biological Chemistry 276: 36869-36872 (2001)].

Менее хорошо охарактеризованные механизмы, посредством которых эстрогены могут воздействовать на клетки, - это через так называемый мембранный рецептор. Существование такого рецептора является спорным, но документально хорошо подтверждено, что эстрогены могут вызывать очень быстрые негеномные отклики от клеток. Молекулярная сущность, ответственная за трансдукцию указанных эффектов, окончательно не выделена, но есть основания утверждать, что она по меньшей мере относится к нуклеарным формам эстрогенных рецепторов [Levin, Journal of Applied Physiology 91: 1860-1867 (2001), Levin, Trends in Endocrinolody & Metabolism 10: 374-377(1999)].

На данный момент открыто два эстрогенных рецептора. Первый эстрогенный рецептор клонирован около 15 лет назад и в настоящее время упоминается как ER [Green, et al., Nature 320: 134-9 (1986)]. Вторая форма эстрогенного рецептора обнаружена сравнительно недавно и названа как ER [Kuiper, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93: 5925-5930 (1996)]. Начальная работа по ER была сфокусирована на определении его сродства к разнообразным лигандам, и действительно были обнаружены некоторые различия с ER . Тканевое распределение ER было хорошо картировано на грызунах, и оно не совпадает с ER . Ткани, такие как матка мышей и крыс, экспрессирует преимущественно ER , тогда как легкое мышей и крыс экспрессируют преимущественно ER [Couse, et al., Endocrinolody 138: 4613-4621 (1997), Kuiper, et al., Endocrinolody 138: 863-870 (1997)]. Даже внутри одного и того же органа распределение ER и ER может быть разграничено. Например, в яичнике мышей ER высоко экспрессируется в зернистых клетках и ER ограничивается оболочковыми и относящимися к строме клетками [Sar and Welsch, Endocrinolody 140: 963-971 (1999), Fitzpatrick, et al., Endocrinolody 140: 2581-2591 (1999)]. Однако есть примеры, где рецепторы совместно экпрессируются, и есть основание, исходя из исследований in vitro, полагать, что ER и ER могут образовывать гетеродимеры [Cowley, et al., Journal of Biological Chemistry 272: 19858-19862 (1997)].

Было описано большое число соединений, которые или стимулируют, или блокируют активность 17 -эстрадиола. Соединения, имеющие приблизительно такие же биологические эффекты, как 17 -эстрадиол, наиболее сильный эндогенный эстроген, названы как "агонисты эстрогенного рецептора". Те же, которые в сочетании с 17 -эстрадиолом блокируют его эффекты, названы "антагонистами эстрогенного рецептора". В реальности же существует континиум между активностью агониста эстрогенного рецептора и антагониста эстрогенного рецептора, и на самом деле некоторые соединения ведут себя как агонисты эстрогенного рецептора в некоторых тканях и как антагонисты эстрогенного рецептора в других. Такие соединения со смешанной активностью названы селективными модуляторами эстрогенного рецептора (SERMS) и являются терапевтически применимыми агентами (напр. EVISTA)[McDonnell, Journal of the Society for Gynecologic Investigation 7: S10-S15 (2000), Goldstein, et al., Human Reproduction Update 6: 212-224 (2000)]. Точная причина, почему одно и то же соединение может иметь специфические в отношении клеток эффекты, не выяснена, но различия в конформации рецептора и/или среди корегуляторных протеинов подтверждены.

Известно, что на какое-то время эстрогенные рецепторы принимают различные конформации, когда связываются с лигандами. Однако последствие и тонкое различие указанных изменений обнаружены только недавно. Трехмерные структуры ER и ER были разделены совместной кристаллизацией с различными лигандами и ясно показали репозиционирование спирали 12 в присутствии антагониста эстрогенного рецептора, которое стерически затрудняет последовательности протеина, необходимые для взаимодействия рецептор-корегуляторный протеин [Pike, et al., Embo 18: 4608-4618 (1999), Shiau, et al., Cell 95: 927-937 (1998)]. В дополнение, методика демонстрации фагов была применена для идентификации пептидов, которые взаимодействуют с эстрогенными рецепторами в присутствии различных лигандов [Paige, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96: 3999-4004 (1999)]. Например, был идентифицирован пептид, который проводит различие между ER , связанным с полными агонистами эстрогенного рецептора 17 -эстрадиолом и диэтилстилбестеролом. Был обнаружен другой пептид, который проводит различие между кломифеном, связанным с ER и ER . Эти данные показывают, что каждый лиганд потенциально располагает рецептор в уникальной и непредсказуемой конформации, которая, вероятно, имеет различающиеся биологические активности.

Как упоминалось выше, эстрогены влияют на облачение биологических процессов. В дополнение, когда родовые отличия описаны (напр., частота заболеваний, отклики на вызов и т.п.), возможно, что объяснение предусматривает различие в уровнях содержания эстрогена между мужскими и женскими особями.

Описание изобретения

Изобретение относится к эстрогенному соединению формулы (I), имеющему структуру

где R₁ означает водород, гидроксил, галоген, алкил из 1-6 атомов углерода, трифторалкил из 1-6 атомов углерода, циклоалкил из 3-8 атомов углерода, алкокси из 1-6 атомов углерода, трифторалкокси из 1-6 атомов углерода, тиоалкил из 1-6 атомов углерода, сульфоксоалкил из 1-6 атомов углерода, сульфоноалкил из 1-6 атомов углерода, арил из 6-10 атомов углерода, 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, имеющее от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из О, N или S, -NO ₂, -NR₅R₆, -N(R₅)COR₆, -CN, -CHFCN, -CF₂CN, алкинил из 2-7 атомов углерода или алкенил из 2-7 атомов углерода, где группы алкил или алкенил необязательно замещены гидроксилом, -CN, галогеном, трифторалкилом из 1-6 атомов углерода, трифторалкокси из 1-6 атомов углерода, -COR₅, -СО₂R ₅, -NO₂, CONR₅ R₆, NR₅R ₆ или N(R₅)COR₆ ;

R₂ и R_2а, каждый независимо, означают водород, гидроксил, галоген, алкил из 1-6 атомов углерода, алкокси из 1-4 атомов углерода, алкенил из 2-7 атомов углерода или алкинил из 2-7 атомов углерода, трифторалкил из 1-6 атомов углерода или трифторалкокси из 1-6 атомов углерода, где группы алкил или алкенил необязательно замещены гидроксилом, -CN, галогеном, трифторалкилом из 1-6 атомов углерода, трифторалкокси из 1-6 атомов углерода, -COR₅, -СО ₂R₅, -NO₂, CONR₅R₆, NR ₅R₆ или N(R₅ )COR₆;

R₃, R_3а и R₄, каждый независимо, означают водород, алкил из 1-6 атомов углерода, алкенил из 2-7 атомов углерода, алкинил из 2-7 атомов углерода, галоген, алкокси из 1-4 атомов углерода, трифторалкил из 1-6 атомов углерода или трифторалкокси из 1-6 атомов углерода, где группы алкил или алкенил необязательно замещены гидроксилом, -CN, галогеном, трифторалкилом из 1-6 атомов углерода, трифторалкокси из 1-6 атомов углерода, -COR₅, -СО₂R ₅, -NO₂, CONR₅ R₆, NR₅R ₆ или N(R₅)COR₆ ;

R₅, R₆, каждый независимо, означают водород, алкил из 1-6 атомов углерода, арил из 6-10 атомов углерода;

Х означает О, S или NR ₇;

R₇ означает водород, алкил из 1-6 атомов углерода, арил из 6-10 атомов углерода, -COR ₅, -СО₂R₅ или -SO₂R₅;

или к его фармацевтически приемлемой соли.

Фармацевтически приемлемые соли могут быть образованы из органических и неорганических кислот, например уксусной, пропионовой, молочной, лимонной, винной, янтарной, фумаровой, малеиновой, малоновой, миндальной, яблочной, фталевой, хлористоводородной, бромистоводородной, фосфорной, азотной, серной, метансульфоновой, нафталинсульфоновой, бензолсульфоновой, толуолсульфоновой, камфорсульфоновой и подобных известных приемлемых кислот, когда соединение по изобретению содержит группу основного характера. Соли также могут быть образованы из органических и неорганических оснований, такие как соли щелочных металлов (например, натрия, лития или калия), соли щелочно-земельных металлов, соли аммония, соли алкиламмония, содержащего 1-6 атомов углерода или соли диалкиламмония, содержащего 1-6 атомов углерода в каждой алкилгруппе, и соли триалкиламмония, содержащего 1-6 атомов углерода в каждой алкилгруппе, когда соединение по изобретению содержит кислотную группу.

Термины алкил, алкенил и алкинил включают группы как с разветвленной, так и с прямой цепью. Примеры включают метил, этил, пропил, бутил, изопропил, втор-бутил, трет-бутил, винил, аллил, ацетилен, 1-метилвинил и тому подобное. Когда группы алкил и алкенил замещены, они обычно могут быть моно-, ди-, три- и пер-замещенными. Примеры для галоген-заместителя включают 1-бромвинил, 1-фторвинил, 1,2-дифторвинил, 2,2-дифторвинил, 1,2,2-трифторвинил, 1,2-дибромэтан, 1,2-дифторэтан, 1-фтор-2-бромэтан, CF ₂CF₃, CF₂CF ₂CF₃ и тому подобное. Термин галоген включает бром, хлор, фтор и иод. Термин арил означает фенил, 1-нафтил или 2-нафтил. Предпочтительные 5-6-членные гетероциклические кольца включают фуран, тиофен, пиррол, изопиррол, пиразол, имидазол, триазол, дитиол, оксатиол, изоксазол, оксазол, тиазол, изотиазолем, оксадиазол, фуразан, оксатриазол, диоксазол, оксатиазол, тетразол, пиран, пиридин, пиридазин, пиримидин, пиразин, триазин, оксазин, оксатиазин или оксадиазин. Более предпочтительно, когда гетероциклическим кольцом является фуран, тиофен или тиазол.

Из соединений по данному изобретению предпочтительно соединение формулы (I), которое имеет структуру

где R₁ означает алкенил из 2-7 атомов углерода, где группа алкенил необязательно замещена гидроксилом, -CN, галогеном, трифторалкилом из 1-6 атомов углерода, трифторалкокси из 1-6 атомов углерода, -COR₅ , -СО₂R₅, -NO ₂, CONR₅R₆, NR₅R₆ или N(R ₅)COR₆;

R₂ и R_2а, каждый независимо, означают водород, гидроксил, галоген, алкил из 1-6 атомов углерода, алкокси из 1-4 атомов углерода, алкенил из 2-7 атомов углерода, алкинил из 2-7 атомов углерода, трифторалкил из 1-6 атомов углерода или трифторалкокси из 1-6 атомов углерода, где группы алкил, алкенил или алкинил необязательно замещены гидроксилом, -CN, галогеном, трифторалкилом из 1-6 атомов углерода, трифторалкокси из 1-6 атомов углерода, -COR₅, -СО ₂R₅, -NO₂, CONR₅R₆, NR ₅R₆ или N(R₅ )COR₆;

R₃ и R_3а, каждый независимо, означают водород, алкил из 1-6 атомов углерода, алкенил из 2-7 атомов углерода, алкинил из 2-7 атомов углерода, галоген, алкокси из 1-4 атомов углерода, трифторалкил из 1-6 атомов углерода или трифторалкокси из 1-6 атомов углерода, где группы алкил, алкенил или алкинил необязательно замещены гидроксилом, -CN, галогеном, трифторалкилом из 1-6 атомов углерода, трифторалкокси из 1-6 атомов углерода, -COR₅, -СО₂R ₅, -NO₂, CONR₅ R₆, NR₅R ₆ или N(R₅)COR₆ ;

R₅, R₆, каждый независимо, означают водород, алкил из 1-6 атомов углерода, арил из 6-10 атомов углерода;

X означает О, S или NR ₇;

R₇ означает водород, алкил из 1-6 атомов углерода, арил из 6-10 атомов углерода, -COR ₅, -СО₂R₅ или -SO₂R₅;

или его фармацевтически приемлемая соль.

Более предпочтительно, когда Х означает О, и еще более предпочтительно, когда Х означает О и R₁ означает алкенил из 2-3 атомов углерода, который необязательно замещен гидроксилом, -CN, галогеном, трифторалкилом из 1-6 атомов углерода, трифторалкокси из 1-6 атомов углерода, -COR₅, -СО₂R ₅, -NO₂, CONR₅ R₆, NR₅R ₆ или -N(R₅)COR₆ .

Используемый в соответствии с данным изобретением термин "обеспечение" по отношению к обеспечению соединения или вещества, охватываемого данным изобретением, означает либо непосредственно введение такого соединения или вещества, либо введение пролекарства, производного или аналога, которые будут образовывать эффективное количество соединения или вещества внутри организма.

Используемый в соответствии с данным изобретением термин "селективный в отношении ER лиганд" означает, что сродство связывания (которое измеряют по IC₅₀, где IC ₅₀ 17 -эстрадиола равно не более чем 3-кратной дифференте между ER и ER ) лиганда с ER по меньшей мере приблизительно в 10 раз больше, чем его сродство связывания с ER в стандартной фармакологической тест-процедуре, которая служит для измерения величин сродства связывания с ER и ER . Предпочтительно, когда селективный в отношении ER лиганд будет иметь сродство связывания с ER , которое по меньшей мере приблизительно в 20 раз больше, чем его сродство связывания с ER . Более предпочтительно, когда селективный в отношении ER лиганд будет иметь сродство связывания с ER , которое по меньшей мере приблизительно в 50 раз больше, чем его сродство связывания с ER . Дополнительно предпочтительно, когда селективный в отношении ER лиганд является неутеротрофическим и немаммотрофическим.

Используемый в соответствии с данным изобретением термин "неутеротрофический" означает увеличение массы влажной матки в стандартной фармакологической тест-процедуре на менее чем около 50% от увеличения массы матки, наблюдаемого для максимально эффективной дозы 17 -эстрадиола или 17 -этинил-17 -эстрадиола в такой же процедуре. Предпочтительно, чтобы увеличение массы влажной матки было бы менее чем около 25% от наблюдаемого для эстрадиола и более предпочтительно, чтобы увеличение массы влажной матки было бы менее чем около 10% от наблюдаемого для эстрадиола. Наиболее предпочтительно, чтобы неутеротрофический селективный в отношении ER лиганд не увеличивал бы заметно влажную массу матки (р>0,05) по сравнению с контролем, который не имеет утеротрофической активности (например, носитель).

Используемый в соответствии с данным изобретением термин "немаммотрофический" означает формирование увеличения mRNA казеин-киназы II в стандартной фармакологической тест-процедуре менее чем около 50% от увеличения mRNA казеин-киназы II, наблюдаемого для максимально эффективной дозы 17 -эстрадиола или 17 -этинил-17 -эстрадиола в такой же процедуре. Предпочтительно, чтобы увеличение mRNA казеин-киназы II было бы менее чем около 25% от наблюдаемого для эстрадиола и более предпочтительно, чтобы увеличение mRNA казеин-киназы II было бы менее чем около 10% от наблюдаемого для эстрадиола. Наиболее предпочтительно, чтобы немаммотрофический селективный в отношении ER лиганд не увеличивал бы заметно mRNA казеин-киназы II (р>0,05) по сравнению с контролем, который лишен маммотрофической активности (например, носитель).

Изобретение также относится к применению селективного в отношении ER лиганда в лечении или подавлении артрита, воспалительной болезни кишечника и эндометриоза. Более конкретно, селективные в отношении ER лиганды применимы в лечении или подавлении ревматоидного артрита, остеоартрита или спондилоартропатий и болезни Крона, язвенного колита, недетерминантного колита, инфекционного колита или язвенного проктита. Данное изобретение дополнительно относится к применению селективного в отношении ER лиганда в лечении или подавлении опухания или эрозии суставов, или в лечении или подавлении поражения сустава после артроскопических или хирургических процедур. Предпочтительно, чтобы селективный в отношении ER лиганд был бы неутеротрофическым и немаммотрофическим.

Реагенты, используемые для получения соединений по данному изобретению, могут быть либо коммерчески доступны, либо могут быть получены стандартными процедурами, описанными в литературе.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу получения соединения по изобретению, содержащему одно из следующего:

а) взаимодействие соединения формулы

где R₁, R ₂, R_2а и Х являются такими, как определено выше, с соединением формулы

где R₃ и R _3а являются такими, как определено выше, и Y означает галоген, -ОН или алкокси из 1-6 атомов углерода;

или

b) превращение соединения формулы (II), как определено выше, в фармацевтически приемлемую соль его;

или

с) разделение изомерной смеси соединений формулы (II), чтобы изолировать энантиомер соединения формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли.

Соединения по данному изобретению могут быть получены, например, согласно следующим схемам синтеза (I-VIII)

Схема I

На схеме I, коммерчески доступный диметоксианилин 1 обрабатывают коммерчески доступным бензоилхлоридом 2 в присутствии триэтиламина, чтобы получить амид 3. Необходимый бензоилхлорид 2 также получают из коммерчески доступной бензойной кислоты 4 при кипячении с тионилхлоридом с обратным холодильником. Амид 3 превращают в фенольный бензоксазол 5 путем обработки гидрохлоридом пиридина при высокой температуре (200^оС).

Схема II

На схеме II, коммерчески доступный нитрофенол 6 подвергают бромированию Br₂/NaOAc в уксусной кислоте, чтобы получить бромфенол 7. Каталитическое гидрирование бромфенола 7 с использованием Ra-Ni в EtOAc дает анилин 8. Соединение анилина 8 с бензоилхлоридом 9 (коммерчески доступным или полученным из соответствующей бензойной кислоты и тионилхлорида) в присутствии пиридина дает амид-сложный эфир 10. Превращение соединения 10 в бензоксазол 11 осуществляют в кислотных условиях (п-толуолсульфоновая кислота) при высокой температуре (150°С). Деметилирование соединения 11 трибромидом бора в дихлорметане дает фенольный бензоксазол 12.

Схема III

На схеме III, анилин 8 превращают в бензоксазол 14 при обработке бензойной кислотой 13 и борной кислотой в п-ксилоле при высокой температуре (150°С). Деметилирование соединения 14 трибромидом бора в дихлорметане дает фенольный бензоксазол 15.

Схема IV

На схеме IV, нитрование соединения 16 азотной кислотой в уксусной кислоте дает соединение 17, которое восстанавливают водородом в присутствии Ra-Ni, чтобы получить анилин 18. Анилин 18 превращают в бензоксазол 19 подобно тому, как описано на схеме II, за исключением того, что стадию деметилирования осуществляют с гидрохлоридом пиридина при высокой температуре (200°С).

Схема V

На схеме V, гидроксильные группы бензоксазола 20 защищают либо как простые силил-эфиры 21 (R ₃=Ме₃С(СН₃) ₂Si), используя трет-бутилдиметилсилилхлорид/имидазол/4-диметиламинопиридин в N,N-диметилформамиде, или как сложные эфиры 21 (R ₃=СН₃СО), используя уксусный ангидрид/4-диметиламинопиридин в дихлорметане. Бензоксазолы 20 и 21 соединяют с различными реагентами олова (такими как трибутил(винил)олово, трибутил(аллил)олово, трибутил(2-фурил)олово), бороновыми кислотами или хлоридами цинка в присутствии палладиевого катализатора [напр., дихлор-бис(три-о-толилфосфин)палладия(II) или тетракис(трифенилфосфин)палладия(0)] в п-ксилоле, толуоле, тетрагидрофуране, диметоксиметане или 1,2-диметоксиэтане в присутствии основания (напр., Na₂CO ₃) для реакции соединения с борной кислотой при температурах в пределах от 20°С до 150°С, чтобы получить бензоксазолы 22 и 23.

Удаление защитных групп простого силилового эфира с соединения 22 (R₃=Ме₃ С(СН₃)₂Si) с помощью фтористоводородной кислоты (48 мас.% в воде) или фторида тетрабутиламмония дает бензоксазол 24. Омыление соединения 22 (R ₃=СН₃СО) с использованием карбоната калия в диоксане дает бензоксазол 24. Бензоксазол 23 (R=СН ₃) подвергают деметилированию с использованием трибромида бора в дихлорметане или гидрохлорида пиридина при высокой температуре (200°С), чтобы получить бензоксазол 24.

Схема VI

На схеме VI, бензоксазол 24 обрабатывают н-бутиллитием при низких температурах (-78°С) с последующим добавлением электрофила (напр., CNCO₂Et, Ph(CH ₃)NCHO, EtI и т.п.), чтобы получить соединение 25. Удаление защитных групп соединения 25 трибромидом бора (R=СН ₃) или фторидом тетрабутиламмония (R=Ме ₃С(СН₃)₂Si) дает бензоксазол 26 [R=CHO, CO₂Et, CH ₂CH₃, C(CH₃ )₂OH].

Третичный спирт 25 (R=С(СН ₃)ОН) обрабатывают гидрохлоридом пиридина при высокой температуре (200°С), чтобы получить 1-метил-винил-бензоксазол 27. Восстановление соединения 27 Н₂/Pd-C дает аналог изопропила 28.

Схема VII

На схеме VII, восстановление бензоксазола 29 боргидридом натрия в метаноле дает спирт 30. Обработка спирта 30 трибромидом бора в CH₂Cl ₂ в течение 1 часа дает бензоксазол 31, тогда как продолжительная (18 часов) обработка дает бромид 32. Бромид 32 превращают в ацетонитрил 33 при обработке цианидом калия и 18-краун-6-простым эфиром в N,N-диметилформамиде.

Схема VIII

На схеме VIII, бромбензоксазол 35 (R=СН ₃) вначале обрабатывают цианидом меди(I) в ДМФ, чтобы получить соответствующий арил-нитрил, который при обработке трибромидом бора дает бензоксазол 36. Бензоксазол 36 также получают по второму пути синтеза, где бромбензоксазол 35 обрабатывают цианидом цинка в присутствии палладиевого катализатора [например, тетракис(трифенилфосфин)палладия(0)], чтобы получить соответствующий арил-нитрил, который при деметилировании трибромидом бора дает бензоксазол 36. Бензоксазол 35 (R=H) обрабатывают бромидом меди(I) и свежеприготовленным метоксидом натрия в ДМФ, чтобы получить метоксибензоксазол 37. Бромирование бензоксазола 37 N-бромсукцинимидом в ацетонитриле дает монобром-бензоксазол 38 (главный продукт) и дибромбензоксазол 39 (малый продукт).

Стандартные фармакологические тест-процедуры легко доступны для определения профиля активности данного испытуемого соединения. Следующее кратко суммирует некоторые примеры тест-процедур и может включать данные для примеров соединений по изобретению. Все анализы, за исключением анализа связывания радиоактивного лиганда, могут быть использованы для определения активности соединений как агонистов или антагонистов эстрогенного рецептора. Как правило, активность агониста эстрогенного рецептора измеряют, сравнивая активность соединения с эстрогеном, выбранным для сравнения (например, таким как 17 -эстрадиол, 17 -этинил, 17 -эстрадиол, эстрон, диэтилстилбестерол и т.п.). Активность антагониста эстрогенного рецептора обычно измеряют путем совместной обработки испытуемым соединением с эстрогеном сравнения и сравнения результата с результатом, полученным только с эстрогеном сравнения. Стандартные фармакологические тест-процедуры для SERMs также приведены в патентах США 4418068 и 5998402, которые таким образом приобщены к сему ссылкой.

Оценка величин сродства связывания с ER и ER

Примеры образцов по изобретению оценивают по их способности конкурировать с 17 -эстрадиолом за ER и ER в обычном анализе связывания радиоактивного лиганда. Эта тест-процедура обеспечивает методологию определения относительных величин сродства связывания для рецепторов ER и ER . Используемая процедура кратко описана ниже.

Получение экстрактов рецептора для характеристики селективности связывания. Домены связывания лиганда, обычно определяемые здесь как вся последовательность ниже по потоку от домена связывания DNA, получают PCR, используя cDNA полной длины в качестве матриц и праймеров, которые содержат подходящие сайты рестрикции для субклонирования, обеспечивая в то же время подходящую рамку считывания для экспрессии. Указанные матрицы содержат аминокислоты M ₂₅₀-V₅₉₅ ER человека [Green, et al., Nature 320: 134-9 (1986)] и M ₂₁₄-О₅₃₀ ER человека [Ogawa, et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 243: 122-6 (1998)]. ER человека клонируют в pET15b (Novagen, Madison WI) как фрагмент Nco1-BamH1, несущий С-концевой Flag tag. ER человека клонируют как ER , за исключением того, что добавляют N-концевой His tag. Последовательности всех используемых конструктов проверяют установлением полной последовательности обеих нитей.

Клетки BL21(DE3) используют для экспрессии протеинов человека. Обычно 10 мл культуры, выдерженной в течение ночи, используют для инокуляции 1 л культуры среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. После инкубации в течение ночи при 37°С добавляют IPTG до конечной концентрации 1 мМ и продолжают инкубацию при 25°С в течение 2 часов. Клетки собирают центрифугированием (1500 х g) и осадки промывают и повторно суспендируют в 100 мл 50мМ Tris-Cl (pH 7,4), 150 мМ NaCl. Клетки подвергают лизису пропускания дважды через French пресс при 12000 фунтах на кв. дюйм. Лизат осветляют центрифугированием при 12000 х g в течение 30 минут при 4°С и хранят при -70°С.

Оценка экстрактов в отношении специфического связывания [³H]-эстрадиола. Физиологический раствор с фосфатным буфером Dulbecco (Gibco, 1 х конечная концентрация), обогащенный 1 мМ EDTA, используют в качестве буфера для анализа. Чтобы оптимизировать количество рецептора для использования в анализе, [³H]-17 -эстрадиол (New England Nuclear; конечная концентрация = 2 нМ) ± 0,6 мкМ диэтилстилбестрола и 100 мкл различных разбавлений лизата E. coli добавляют в каждую лунку высокосвязывающего маскированного титрационного микропланшета (EG&G Wallac). Конечный объем для анализа равен 120 мкл, и концентрация DMSO 1%. После инкубации при комнатной температуре в течение 5-18 часов несвязанный материал отсасывают и планшет промывают три раза приблизительно 300 мкл буфера для анализа. После промывания в лунки добавляют 135 мкл смеси для сцинтилляции (Optiphase Supermix, EG&G Wallac) и планшет герметизируют и встряхивают по меньшей мере 5 минут, чтобы смешать сцинтиллянт с остаточным промывочным буфером. Связанную радиоактивность оценивают путем сцинтилляционного отсчета жидкости (EG&G Wallac Microbeta Plus).

После определения разбавления каждого препарата рецептора, которое обеспечивает максимальное специфическое связывание, анализ далее оптимизируют определением IC₅₀ немеченого 17 -эстрадиола, используя различные разбавления препарата рецептора. Конечное рабочее разбавление для каждого препарата рецептора выбирают такое, где IC₅₀ немеченого 17 -эстрадиола равно 2-4 нМ.

Процедура испытания конкуренции при связывании лиганда. Испытуемые соединения вначале солюбилизируют в DMSO, и конечная концентрация DMSO в анализе связывания равна 1%. Восемь разбавлений каждого испытуемого соединения используют в качестве немеченого конкурента для [³ H]-17 -эстрадиола. Обычно набор разбавлений соединения испытывают одновременно на ER и ER человека. Результаты наносят на график как измеренный DPM против концентрации испытуемого соединения. Для подбора кривой для реакции на дозу подбирают четырехпараметрическую логистическую модель на преобразованных весовых данных и определяют IC ₅₀ как концентрацию соединения, снижающую максимальное связывание [³H]-эстрадиола на 50%.

Величины сродства связывания для ER и ER (которые измеряют по IC₅₀) для типичных примеров по изобретению показаны в таблице (1).

Таблица 1: Величины сродства связывания ER для типичных соединений по изобретению
Пример	ER-b IC50 (нМ)	ER-a IC50 (нМ)
1	140	720
2	963	5110
3	66	1570
4	239	5280
5	59	139
6	39	843
7	1600	5000
8	181	2353
9	440	1500
10	105	2040
11	703	>5000
12	49	1227
13	25	190
14	50	902
15	3	82
16	64	1813
17	42	1210
18	16	464
19	157	2765
20	2	155
21	3	260
22	1	47
23	3	113
24	6	1217
25	2	227
26	4	474
27	4	409
28	25	1036
29	155	803
30	134	3080
31	31	352
32	16	196
33	31	352
34	14	1101
35	15	481
36	11	390
37	79	498
38	102	1010
39	190	7827
40	235	1300
41	6	411
42	95	9620
43	59	2557
44	13	537
45	84	655
46	59	2638
47	1340	Не определено
48	40	2975
49	1042	5230
50	399	>5000
51	142	775
52	82	1200
53	166	1870
54	135	809
55	313	1980
56	97	1030
57	366	1340
58	26	1435
59	52	2668
60	64	559
61	93	1180
62	201	>10000
63	1	44
64	3	376

Результаты, полученные в стандартной фармакологической тест-процедуре, описанной выше, показывают, что соединения по данному изобретению связывают оба подтипа эстрогенного рецептора. Величины IC₅₀ обычно ниже для ER , что указывает на то, что эти соединения являются лигандами селективными преимущественно в отношении ER , но все еще считаются активными по отношению к ER . Соединения по данному изобретению будут проявлять диапазон активности на основе, по меньшей мере частично, их профилей селективности сродства к рецептору. Так как соединения по изобретению связывают ER с более высоким сродством, чем ER , они могут быть полезны при лечении или подавлении болезней, которые могут быть регулируемыми посредством ER . Дополнительно, так как каждый комплекс рецептора с лигандом является уникальным и, следовательно, его взаимодействие с различными корегуляторными протеинами является уникальным, соединения по данному изобретению будут проявлять различные и непредсказуемые активности в зависимости от клеточного контекста. Например, в некоторых типах клеток возможно, что соединение будет вести себя как агонист эстрогенного рецептора, тогда как в других тканях как антагонист эстрогенного рецептора. Соединения с такой активностью иногда можно отнести к SERM (селективным модуляторам эстрогенного рецептора). В отличие от многих эстрогенов, однако, многие SERM не вызывают увеличений массы влажной матки. Эти соединения являются антиэстрогенными в матке и могут полностью антагонизировать трофические эффекты агонистов эстрогенного рецептора в ткани матки. Эти соединения, однако, действуют как агонисты эстрогенного рецептора в костной, сердечно-сосудистой и центральной нервной системах. Благодаря селективному характеру этих соединений в отношении тканей они применимы для лечения или подавления болезненных состояний или синдромов у млекопитающих, которые вызываются или ассоциируются с недостаточностью эстрогена (в конкретных тканях, таких как костная или сердечно-сосудистая) или с избытком эстрогена (в матке или молочных железах). В дополнение, соединения по данному изобретению также имеют возможность вести себя как агонисты эстрогенного рецептора на одном типе рецептора, в то же время проявляя себя в качестве антагонистов эстрогенного рецептора на другом. Например, продемонстрировано, что соединения могут антагонизировать действие 17 -эстрадиола через ER , проявляя в то же время активность агониста эстрогенного рецептора с ER [Sun, et al., Endocrinology 140: 800-804 (1999)]. Такая активность ERSAA (селективного агониста-антагониста эстрогенного рецептора) обеспечивает различную эстрогенную активность в этих сериях соединений.

Регуляция mRNA металлотионеина II

Эстрогены, действуя через ER , но не ER , могут ап-регулировать уровни mRNA металлотионеина II в клетках Saos-2, как описано Harris [Endocrinology 142: 645-652 (2001)]. Результаты этой тест-процедуры могут быть объединены с результатами тест-процедуры, описанной ниже (ERE-репортерная тест-процедура), чтобы создать профиль селективности для соединений по данному изобретению (смотри также WO 00/37681). Данные для типичных соединений по изобретению показаны в таблице (2).

Таблица 2: Регуляция mRNA металлотионеина-II в клетках Saos-2
Соединение	Кратная регуляция
Пример 12	9,6
Пример 14	12,4
Пример 13	9,7

Оценка испытуемого соединения в раковых клетках молочной железы MCF-7 с использованием ERE-репортерной тест-процедуры

Исходные растворы испытуемых соединений (обычно 0,1 М) готовят в DMSO и затем разбавляют DMSO в 10-100 раз, чтобы получить рабочие растворы 1 или 10 мМ. Исходные растворы в DMSO хранят либо при 4°С (0,1 М), либо при -20^оС (<0,1 М). Клетки MCF-7 пассируют дважды в неделю с ростовой средой [D-MEM/F-12 среда, содержащая 10% (об./об.) инактивированной теплом фетальной телячьей сыворотки, 1% (об./об.) пенициллина-стрептомицина и 2 мМ glutaMax-1]. Клетки поддерживают в вентилируемых склянках при 37°С внутри инкубатора, где 5% СО₂ /95% влажного воздуха. За сутки до обработки клетки помещают с ростовой средой в 96-луночные планшеты при 25000 клеток/лунка и инкубируют при 37°С в течение ночи.

Клетки инфицируют в течение 2 часов при 37°С 50 мкл/лунка разбавленного 1:10 раствора аденовирусной 5-ERE-tk-люциферазы в экспериментальной среде [среда D-MEM/F без фенольного красного, содержащая 10% (об./об.) инактивированной теплом, десорбированной углем фетальной телячьей сыворотки, 1% (об./об.) пенициллина-стрептомицина, 2 мМ glutaMax-1, 1 мМ пирувата натрия]. Лунки затем промывают один раз 150 мкл экспериментальной среды. И наконец, клетки обрабатывают в течение 24 часов при 37°С в репликатах из 8 лунок/обработка 150 мкл/лунка носителя ( 0,1% об./об. DMSO) или соединением, которое разбавляют в 1000 раз в экспериментальной среде.

Начальный скрининг испытуемых соединений делают при разовой дозе 1 мкМ, то есть испытывают отдельно (образ действия агониста эстрогенного рецептора) или в сочетании с 0,1 нМ 17 -эстрадиолом (ЕС₈₀; образ действия антагониста эстрогенного рецептора). Каждый 96-луночный планшет также содержит контрольную группу носителя (0,1% об./об. DMSO) и контрольную группу агониста эстрогенного рецептора (либо 0,1, либо 1 нМ 17 -эстрадиол). Эксперименты реакции на дозу осуществляют в образах действия или агониста эстрогенного рецептора и/или антагониста эстрогенного рецептора на активные соединения при log увеличениях от 10^-14 до 10 ^-5 М. Из этих кривых реакции на дозу производят величины EC₅₀ и IC₅₀ соответственно. Финальная лунка в каждой группе обработки содержит 5 мкл 3 х 10^-5 М ICI-182780 (конечная концентрация 10^-6 М) в качестве контроля антагониста эстрогенного рецептора.

После обработки клетки подвергают лизису на шейкере в течение 15 мин с 25 мкл/лунка 1Х реагента лизиса клеточной культуры (Promega Corporation). Лизаты клеток (20 мкл) переносят на 96-луночный планшет люминометра и активность люциферазы измеряют в люминометре MicroLumat LB 96 P (EG & G Berthold), используя 100 мкл/лунка субстрата люциферазы (Promega Corporation). За 1 секунду перед впрыскиванием субстрата делают исходное измерение для каждой лунки. После впрыскивания субстрата активность люциферазы измеряют через 10 секунд после 1-секундной отсрочки. Данные переносят из люминометра в персональный компьютер Macintosh и анализируют с помощью программного обеспечения JMP (Институт SAS); эта программа вычитает исходное считывание из измерения люциферазы для каждой лунки и затем определяет среднее и стандартное отклонение для каждой обработки.

Данные по люциферазе подвергают логарифмическому преобразованию и оператор оценки Huber M используют, чтобы отсечь находящиеся вне пределов преобразованные наблюдения. Программное обеспечение JMP используют, чтобы анализировать преобразованные и весовые данные для однонаправленного ANOVA (тест Dunnett). Обработки соединением сравнивают с результатами контроля носителя в образе действий агониста эстрогенного рецептора или с результатами положительного контроля агониста эстрогенного рецептора (0,1 нМ 17 -эстрадиол) в образе действий антагониста эстрогенного рецептора. Для эксперимента начальной разовой дозы, если результаты обработки соединением значительно отличаются от соответствующего контроля (р<0,05), тогда результаты предоставляют как процент по отношению к контролю 17 -эстрадиола [т.е. ((соединение - контроль носителя)/(контроль 17 -эстрадиола - контроль носителя)) х 100]. Программное обеспечение JMP используют также для определения величин EC ₅₀ и/или IC₅₀ из нелинейных кривых реакции на дозу.

Оценка утеротрофической активности

Утеротрофическая активность испытуемого соединения может быть измерена согласно следующим стандартным фармакологическим тест-процедурам.

Процедура 1: Незрелых в половом отношении (в возрасте 18 дней) крыс Sprague-Dawley получают от Taconic и обеспечивают им неограниченный доступ к рациону на основе казеина (Purina Mills 5K96C) и воде. На 19, 20 и 21 день крысам подкожно вводят дозу 17 -этинил-17 -эстрадиола (0,06 мкг/крыса/сутки), испытуемого соединения или носителя (50% DMSO/50% Dulbecco's PBS). Чтобы оценить активность антагониста эстрогенного рецептора, соединения вводят совместно с 17 -этинил-17 -эстрадиолом (0,06 мкг/крыса/сутки). В группах по шесть крыс, и их умерщвляют путем асфиксии СО₂ и пневмоторакса приблизительно через 24 часа после последней инъекции. Матки извлекают и взвешивают после срезания связанного с ними жира и отжимания какой-либо внутренней жидкости. Образец ткани также может быть резко заморожен для анализа генной экспрессии (mRNA комплементарного фактора 3). Результаты, полученные от типичных соединений по изобретению, показаны в таблице (3).

Таблица 3: Оценка выбранных соединений в утеротрофической тест-процедуре на крысах
Соединение	средняя масса матки (мг) ± SEM
Носитель	21,4±1,59
17 -этинил, 17 -эстрадиол (0,06 мкг/крыса)	85,5±3,1
Пример 12 (2 мг/крыса) + 17 -этинил, 17 -эстрадиол (0,06 мкг/крыса)	60,2±4,0
Пример 41 (2 мг/крыса)	30,3±1,5
Пример 41 (2 мг/крыса) + 17 -этинил, 17 -эстрадиол (0,06 мкг/крыса)	76,6±3,0
Пример 24 (2 мг/крыса)	14,18±1,1
Пример 24 (2 мг/крыса) + 17 - этинил, 17 -эстрадиол (0,06 мкг/крыса)	80,7±5,3
Носитель	30,5±3,2
17 -этинил, 17 -эстрадиол (0,06 мкг/крыса)	104,7±5,4
Пример 20 (2 мг/крыса)	39,2±0,7
Пример 20 (2 мг/крыса) + 17 -этинил, 17 -эстрадиол (0,06 мкг/крыса)	95,9±5,5
Пример 21 (2 мг/крыса)	38,8±1,7
Пример 21 (2 мг/крыса) + 17 -этинил, 17 -эстрадиол (0,06 мкг/крыса)	93,9±5,9

Процедура 2: Незрелых в половом отношении (в возрасте 18 дней) мышей 129SvE получают от Taconic и обеспечивают им неограниченный доступ к рациону на основе казеина (Purina Mills 5K96C) и воде. На 22, 23, 24 и 25 день мышам подкожно вводят дозу соединения или носителя (кукурузное масло). В группах по шесть мышей, и их умерщвляют путем асфиксии СО₂ и пневмоторакса приблизительно через 6 часов после последней инъекции. Матки извлекают и взвешивают после срезания связанного с ними жира и отжимания какой-либо внутренней жидкости. Следующие результаты (таблица 4) получают для типичных соединений по изобретению.

Таблица 4: Оценка выбранных соединений в утеротрофической тест-процедуре на мышах
Соединение	средняя масса матки (мг) ± SEM
Носитель	10,2±2,1
17 -эстрадиол (50 мг/кг)	41,7±3,6
Пример 21 (20 мг/кг)	12,1±1,7
Носитель	11,7±0,5
17 -эстрадиол (50 мг/кг)	41,9±2,9
Пример 24 (50 мг/кг)	10,7±0,9
Носитель	9,6±0,4
17 -эстрадиол (50 мг/кг)	40,0±2,0
Пример 34 (50 мг/кг)	10,3±0,7
Носитель	9,4±0,4
17 -эстрадиол (50 мг/кг)	35,6±4,4
Пример 25 (50 мг/кг)	9,7±1,0
Носитель	13,7±2,0
17 -эстрадиол (50 мг/кг)	40,5±5,84
Пример 12 (50 мг/кг)	13,7±0,82
Пример 20 (50 мг/кг)	13,1±0,86
Носитель	9,6±0,36
17 -эстрадиол (50 мг/кг)	40,0±2,0
Пример 34 (50 мг/кг)	10,3±0,69
Носитель	9,8±1,2
17 -эстрадиол (50 мг/кг)	42,9±4,8
Пример 26 (50 мг/кг)	9,0±0,3
Пример 42 (50 мг/кг)	9,5±0,6
Пример 64 (50 мг/кг)	9,8±0,7

Оценка остеопороза и липидного регулирования (кардиозащита)

Самок крыс Sprague-Dawley, подвергнутых овариэктомии или фиктивной операции, получают через 1 день после операции от Taconic Farms (пределы массы 240-275 г). Их содержат по 3 или 4 крысы на клетку в комнате при режиме 12/12 (свет/темнота) и обеспечивают кормом (крысиная жвачка Purina 5K96C) и водой при свободном доступе к ним. Обработку для всех исследований начинают через 1 день после прибытия, и крысы получают дозу 7 дней в неделю, как указано для 6 недель. Группа подобранных по возрасту крыс, которым была сделана фиктивная операция, не получающая никакой обработки, служит в качестве интактной контрольной группы, хорошо обеспеченной эстрогеном, для каждого исследования.

Все испытуемые соединения готовят в носителе из 50% DMSO (JT Baker, Phillipsburg, NJ)/ 1x фосфатный физиологический раствор Dulbecco (GibcoBRL, Grand Island, NY) при конкретных концентрациях, так что объем для обработки равен 0,1 мл/100 г массы тела. 17 -эстрадиол растворяют в кукурузном масле (20 мкг/мл) и вводят подкожно, 0,1 мл/крыса. Все дозы корректируют при трехнедельных интервалах согласно измерениям средней массы тела в группе и вводят подкожно.

Через пять недель после начала обработки и за одну неделю до окончания исследования каждую крысу оценивают по минеральной плотности кости (BMD). Общую и трабекулярную плотность проксимальной большой берцовой кости оценивают на анестезированных крысах с помощью ХСТ-960М (pQCT; Stratec Medizintechnik, Pforzheim, Germany). Измерения проводят следующим образом: за пятнадцать минут перед сканированием каждую крысу анестезируют интраперитонеальной инъекцией 45 мг/кг кетамина, 8,5 мг/кг ксилазина и 1,5 мг/кг ацепромазина.

Правую заднюю конечность пропускают через поликарбонатную трубку с диаметром 25 мм и привязывают к акриловой раме с голеностопным суставом при угле 90° и коленном суставе при 180^о. Поликарбонатная трубка является принадлежностью скользящей платформы, которая поддерживает ее перпендикулярно к отверстию pQCT. Платформу регулируют так, чтобы дистальный конец бедренной кости и проксимальный конец большой берцовой кости находились в области сканирования. Двухмерный поисковый обзор проводят на длину 10 мм и при линейном разрешении 0,2 мм. Затем поисковый обзор воспроизводят на мониторе, проксимальный конец большой берцовой кости закрепляют. Сканирование pQCT начинают на отдалении 3,4 мм от этой точки. Полученное сканированием pQCT изображение имеет толщину 1 мм, имеет размер элемента объемного изображения (трехмерного минимального элемента изображения) 0,140 мм и состоит из 145 проекций через слой.

После завершения сканирования pQCT изображение воспроизводят на мониторе. Представляющий интерес участок, включающий большую берцовую кость, но исключающий бедренную кость, обрисовывают. Мягкую ткань математически исключают, используя итерационный алгоритм. Плотность остальной кости (общую плотность) сообщают в мг/см³. Внешние 55% кости математически отщепляют по концентрической спирали. Плотность остальной кости (трабекулярную плотность) дают в мг/см ³.

Через одну неделю после оценки BMD крыс умерщвляют путем асфиксии СО₂ и пневмоторакса и кровь собирают для определения холестерина. Матки также извлекают и взвешивают после срезания связанного с ними жира и отжимания какой-либо полостной жидкости. Общий холестерин определяют с помощью клинического анализатора Boehringer-Mannheim Hitachi 911 с использованием набора Cholesterol/HP. Статистические данные сравнивают, используя однонаправленный дисперсионный анализ с тестом Dunnet.

Следующие результаты получают с типичными соединениями по изобретению (таблица (5)).

Таблица 5: Оценка минеральной плотности кости у крысы с удаленными яичниками после введения выбранных соединений по изобретению
Соединение	Общая минеральная плотность кости (среднее мг/см3 ± SEM)	Трабекулярная минеральная плотность кости (среднее мг/см3 ± SEM)
Носитель	543,49±14,24	353,96±13,46
17 -эстрадиол (2 мкг/крыса)	639,49±14,47	453,28±24,93
Пример 24 (10 мг/кг)	517,56±9,67	321,16±9,04
Пример 21 (10 мг/кг)	501,40±11,97	312,34±19,73
Пример 20 (10 мг/кг)	525,51±7,93	287,56±17,56
Пример 20 (10 мг/кг) + 17 -эстрадиол (2 мкг/крыса)	682,41±24,01	491,43±36,43
Фиктивно оперированные (нет манипуляции)	685,28±15,68	510,96±16,99

Оценка антиоксидантной активности

Свиные аорты получают со скотобойни, промывают, переносят в охлажденный PBS и собирают эндотелиальные клетки аорты. Чтобы собрать клетки, межреберные сосуды аорты перевязывают и один конец аорты зажимают. Свежую стерильную фильтрованную 0,2% коллагеназу (Sigma тип I) помещают в сосуд и другой конец сосуда затем зажимают, чтобы получить закрытую систему. Аорту инкубируют при 37°С в течение 15-20 минут, после чего раствор коллагеназы собирают и центрифугируют в течение 5 минут при 2000 х g. Каждый осадок суспендируют в 7 мл среды для эндотелиальной клеточной культуры, содержащей освобожденную от фенольного красного среду DMEM/Ham's F12, обогащенную десорбированной углем FBS (5%), NuSerum (5%), L-глутамином (4мМ), пенициллином-стрептомицином (1000 ед./мл, 100 мкг/мл) и гентамицином (75 мкг/мл), высевают в 100 мм чашки Петри и инкубируют при 37°С в 5% СО₂ . Спустя 20 минут клетки промывают PBS и добавляют свежую среду, это повторяют снова через 24 часа. Клетки смыкаются приблизительно через 1 неделю. Эндотелиальные клетки обычно подпитывают дважды в неделю и, когда они смыкаются, обрабатывают трипсином и высевают при соотношении 1:7. Опосредованному клетками окислению при 12,5 мкг/мл LDL позволяют происходить в присутствии соединения, которое должно быть оценено, (5 мкМ) в течение 4 часов при 37°С. Результаты выражают как процентное ингибирование окислительного процесса, которое определяют методом TBARS (реакционно-способными веществами тиобарбитуровой кислоты) для анализа свободных альдегидов [Yagi, Biochemical Medicine 15: 212-6 (1976)].

Стандартная фармакологическая тест-процедура регуляции mRNA рецептора прогестерона

Эта тест-процедура может быть использована для оценки эстрогенной или антиэстрогенной активности соединений по данному изобретению [Shughrue, et al., Endocrinology 138: 5476-5484 (1997)]. Данные для типичных соединений по данному изобретению показаны в таблице (6).

Таблица 6: Влияние типичных соединений по изобретению на регуляцию mRNA прогестерона в предзрительном поле крысиного мозга
Соединение (10 мг/кг)	mRNA рецептора прогестерона (произвольные единицы; среднее ± ст.откл.)
Носитель	22,0±10,1
Пример 21	110,5±19,3
Пример 20	238,6±36,3
Пример 12	256,2±42,3
Носитель	189,2±27,2
Пример 34	511,5±23,7
Пример 25	447,0±60,7
Пример 26	467,8±66,7
Пример 64	431,3±65,6

Тест-процедура "приливов" у крыс

Влияние испытуемых соединений на "приливы" может быть оценено в стандартной фармакологической тест-процедуре, посредством которой измеряют способность испытуемого соединения притуплять повышение температуры кожи хвоста, которое случается, когда крыс, имеющих зависимость от морфина, резко отучают от лекарства с помощью налоксона [Merchenthaler, et al. Maturitas 30: 307-16 (1998)]. Это также может быть использовано для обнаружения активности антагониста эстрогенного рецептора путем совместного дозирования испытуемого соединения с эстрогеном сравнения. Следующие данные были получены от типичных соединений по изобретению (таблица (7))

Таблица 7: Влияние выбранных соединений по изобретению на крысиную модель "прилива"
Соединение	Изменение температуры через 15 минут после инъекции налоксона (среднее ± SEM)
Носитель	4,63±0,79
17 -этинил, 17 -эстрадиол (0,3 мг/кг)	2,12±1,14
Пример 20 (15 мг/кг)	5,28±0,71
Пример 41 (15 мг/кг)	5,25±0,72

Оценка вазомоторной функции на изолированных кольцах крысиной аорты

Крыс Sprague-Dawley (240-260 грамм) делят на 4 группы:

1. Нормальные, не подвергавшиеся овариэктомии (интактные)

2. Подвергнутые овариэктомии (ovex), обработанные носителем

3. Подвергнутые овариэктомии, обработанные 17 -эстрадиолом (1 мг/кг/сутки)

4. Подвергнутые овариэктомии животные, обработанные испытуемым соединением (различные дозы)

Животных повергают овариэктомии приблизительно за 3 недели перед обработкой. Каждое животное получает либо сульфат 17 -эстрадиола (1 мг/кг/сутки), либо испытуемое соединение, суспендированное в дистиллированной деионизированной воде с 1% Tween-80, путем кормления через желудочный зонд. Обрабатываемые носителем животные получают соответствующий объем носителя, используемого в обрабатываемых лекарством группах.

Животных умерщвляют ингаляцией СО₂ и обескровливанием. Грудную аорту быстро извлекают и помещают при 37°С в солевой раствор следующего состава (мМ): NaCl (54,7), KCl (5,0), NaHCO ₃ (25,0), MgCl₂·2H ₂O (2,5), D-глюкоза (11,8) и CaCl₂ (0,2), газированный СО₂-О ₂, 95%/5% до конечного рН 7,4. Адвентициальную оболочку удаляют с внешней поверхности и сосуд режут на кольца шириной 2-3 мм. Кольца суспендируют в 10 мл тканевой ванне так, что один конец прикреплен ко дну ванны, а другой - к динамометрическому датчику. Нагрузку натяжения в покое 1 г помещают на кольца. Кольца доводят до равновесного состояния в течение 1 часа, сигналы принимают и анализируют.

После приведения в равновесное состояние кольца подвергают воздействию возрастающих концентраций фенилэприна (10^-8 до 10^-4 М) и натяжение регистрируют. Ванны затем промывают 3 раза свежим буфером. После промывания добавляют 200 мМ L-NAME в тканевую ванну и доводят до равновесного состояния в течение 30 минут. Кривую реакции на концентрацию фенилэприна затем повторяют.

Оценка кардиозащитной активности

Мышей С57/B1J с недостаточностью аполипопротеина Е (аро Е КО) получают от Taconic Farms. Все процедуры с животными проводят строго в соответствии с правилами IACUC. Подвергнутых овариэктомии самок мышей аро Е КО в возрасте 4-7 недель содержат в клетках типа коробок для ботинок и обеспечивают свободный доступ к пище и воде. Животных распределяют произвольно по массе в группы (n=12-15 мышей на группу). Животным вводят дозы испытуемых соединений или эстрогена (сульфат 17 -эстрадиола при 1 мг/кг/сутки) в пищу, используя Протокол точного дозирования, где количество потребляемой пищи еженедельно измеряют и соответственно доводят дозу на основе массы животного. Используемой пищей является корм Western-style (57U5), который готовит Purina и который содержит 0,50% холестерина, 20% лярда и 25 межд.ед./кг витамина Е. Животным вводят дозы, кормят их, используя указанный принцип, в течение 12-недельного периода. Контрольным животным дают корм Western-style, и они не получают соединения. В конце периода исследования животных умерщвляют и отбирают пробы плазмы. Сердца подвергают перфузии на месте, вначале физиологическим раствором и затем нейтральным забуференным 10% раствором формалина.

Для определения липидов и липопротеинов плазмы определяют общий холестерин и триглицериды, используя ферментативные методы с коммерчески доступными наборами от Boehringer Mannheim и Wako Biochemicals соответственно, и анализируют с помощью анализатора Boehringer Mannheim Hitachii 911. Разделение и количественный анализ липопротеинов плазмы осуществляют, используя фракционирование по размеру FPLC. 50-100 мл сыворотки фильтруют и впрыскивают в колонки Superose 12 и Superose 6, соединенные последовательно, и элюируют при постоянном расходе 1 мМ натриевой солью EDTA и 0,15 М NaCl. Области каждой кривой, представляющие VLDL, LDL и HDL, интегрируют, используя программное обеспечение Waters Millennium , и каждую фракцию липопротеина количественно определяют, умножая величину общего холестерина на относительную процентную площадь каждого соответствующего пика хроматограммы.

Для количественной оценки атеросклероза аорты аорты осторожно изолируют и помещают в формалиновый фиксатив на 48-72 часа до манипуляций с ними. Атеросклеротические поражения идентифицируют с помощью окрашивания масляным красным О. Краситель сосудов быстро удаляют и затем получают их изображение с помощью микроскопа Nikon SMU800, снабженного системой видеокамеры Sony 3CCD во взаимодействии с сервисной программой IMAQ Configuration Utility (National Instrument) в качестве программного обеспечения, принимающего изображение. Поражения количественно определяют на поверхности вдоль дуги аорты с помощью заказного пакета пороговых сервисных программ (Coleman Technologies). Автоматизированную оценку поражения осуществляют на сосудах, используя пороговую функцию программы, конкретно на участке, находящемся внутри дуги аорты от проксимального края плече-головного ствола до дистального края левой подключичной артерии. Данные по атеросклерозу аорты выражают как процентное вовлечение в патологический процесс строго в пределах определенной области просвета.

Оценка улучшения познавательной способности

Подвергнутых овариэктомии крыс (n=50) приучают к 8-рукавному радиальному лабиринту периодами по 10 минут в течение 5 последовательных дней. Животных лишают воды перед приучиванием и испытанием. Аликвотные пробы 100 мкл воды, размещенные на концах всех рукавов, служат в качестве пополнения. Освоения задания выигрышного перемещения в радиальном рукавном лабиринте достигают, позволяя животному иметь доступ к одному рукаву с приманкой. После питья животное выходит из рукава и возвращается в центральное отделение, где оно теперь имеет доступ в рукав, где оно ранее побывало, или в новый рукав. Правильная реакция регистрируется, когда животное выбирает вход в новый рукав. Каждому животному дают 5 попыток в день в течение 3 дней. После последней попытки освоения животное определяют в одну из следующих 4 групп:

1. Отрицательные контроли: получают инъекции носителя 10% DMSO/кунжутное масло один раз ежедневно в течение 6 дней (1 мл/кг, SC)

2. Положительные контроли: получают инъекции бензоата 17 -эстрадиола 2 дня и их подвергают испытанию через 4 дня после второй инъекции (бензоат 17 -эстрадиола при 10 мкг/0,1 мл на крысу)

3. Эстрадиол: 17 -эстрадиол впрыскивают ежедневно в течение 6 дней (20 мкг/кг, SC)

4. Испытуемое соединение: впрыскивают ежедневно в течение 6 дней (дозы изменяют).

Все инъекции начинают после испытания в последний день приучивания. Последняя инъекция для групп 1, 3 и 4 имеет место за 2 часа до испытания рабочей памяти.

Испытание рабочей памяти - это задача отсроченного несогласования с образцом (DNMS)с использованием задержек 15, 30 или 60 секунд. Эта задача является вариантом задачи освоения, где крысу помещают на центральную арену и позволяют войти в один рукав, как прежде. Второй рукав открывают, как только крыса преодолеет полпути вниз по первому рукаву, и снова крысе требуется выбрать этот рукав. Когда она преодолеет полпути вниз по этому второму рукаву, обе дверцы закрывают и вводят задержку. Как только задержка заканчивается, обе первоначальные дверцы и третью новую дверцу открывают одновременно. Правильную реакцию регистрируют, когда животное преодолевает полпути вниз по третьему новому рукаву. Неправильную реакцию регистрируют, когда животное проходит полпути вниз либо по первому, либо по второму рукаву. Каждое животное получает по 5 попыток при каждом из трех интервалов задержки в целом 15 попыток на животное.

Оценка воздействия на плеврит

Способность уменьшать симптомы экспериментально вызванного плеврита у крыс может быть оценена согласно процедуре Cuzzocrea [Endocrinology 141: 1455-63 (2000)].

Оценка защиты против вызываемой глутаматом цитотоксичности (нейрозащиты)

Нейрозащитная активность соединений по данному изобретению может быть оценена в стандартной фармакологической тест-процедуре in vitro с использованием глутаматной провокационной пробы [Zaulyanov, et al., Cellular & Molecular Neurobiology 19: 705-18 (1999); Prokai, et al., Journal of Medicinal Chemistry 44: 110-4 (2001)].

Оценка в процедуре испытания концевых утолщений молочных желез

Эстрогены требуются для полного удлинения и разветвления молочных протоков и последующего развития лобуло-альвеолярных концевых утолщений под влиянием прогестерона. В этой тест-процедуре маммотрофическую активность выбранных соединений по изобретению оценивают согласно следующей стандартной фармакологической тест-процедуре. Крыс Sprague-Dawley в возрасте двадцати восьми дней (Taconic Farms) подвергают овариэктомии и дают им отдохнуть в течение девяти дней. Животных содержат при 12-часовом цикле свет/темнота, кормят пищей на основе казеина Purina Laboratory Rodent Diet 5K96 (Purina, Richmond, IN) и обеспечивают свободный доступ к воде. Затем крысам в течение 6 дней подкожно вводят дозы носителя (50% DMSO (JT Baker, Phillipsburg, NJ)/50% 1x физиологический раствор с фосфатным буфером Dulbecco (GibcoBRL), 17 -эстрадиола (0,1 мг/кг) или испытуемого соединения (20 мг/кг). Последние три дня крысам также вводят подкожно дозы прогестерона (30 мг/кг). На седьмой день крыс умерщвляют и вырезают жировой комок молочной железы. Этот жировой комок анализируют на mRNA казеин-киназы II как маркера пролиферации концевого утолщения. mRNA казеин-киназы II анализируют в режиме реального времени RT-PCR. RNA изолируют, следуя Trizol (GibcoBRL), согласно указаниям производителя. Образцы обрабатывают DNAазой I, используя набор без DNA (Ambion), и измеряют уровни содержания mRNA казеин-киназы II путем RT-PCR в режиме реального времени, используя процедуру Taqman Gold (PE Applied Biosystems). В целом 50 нг RNA анализируют в трипликате, используя специфическую по отношению к казеинкиназе II пару праймеров (5' праймер, CACACGGATGGCGCATACT; 3' праймер, CTCGGGATGCACCATGAAG) и заказной зонд (TAMRA-CGGCACTGGTTTCCCTCACATGCT-FAM). Уровни mRNA казеин-киназы II нормализуют до 18s рибосомной RNA, содержащейся в реакционной смеси каждого образца, с использованием праймеров и зонда, поставляемых PE Applied Biosystems. Следующие результаты получены для типичных соединений по изобретению (таблица (8)).

Таблица 8: Оценка соединений в маммотрофическом анализе на крысах
Соединение	mRNA казеин-киназы II/18S rRNA (среднее ± SEM)
Носитель + Прогестерон (30 мг/кг)	1,61±0,36
17 -эстрадиол (0,1 мг/кг) + прогестерон (30 мг/кг)	39,0±5,36
Пример 24 (20 мг/кг) + прогестерон (30 мг/кг)	3,98±0,79

Оценка в отношении воспалительной болезни кишечника в стандартной фармакологической тест процедуре на крысах HLA

Типичные соединения по изобретению оценивают на крысах HLA в стандартной фармакологической тест процедуре, которая имитирует воспалительную болезнь кишечника у людей. Далее кратко описана используемая процедура и достигнутые результаты. Самцов крыс HLA-B27 получают от Taconic и обеспечивают им неограниченный доступ к пище (PMI Lab diet 5001) и воде. Качество стула наблюдают ежедневно и классифицируют согласно следующей шкале: диарея = 3, мягкий стул = 2, нормальный стул = 1. В конце исследования сыворотку собирают и хранят при -70°С. Часть толстой кишки препарируют для гистологического анализа и дополнительный сегмент анализируют на активность миелопероксидазы.

В исследовании А крысам (в возрасте 22-26 недель) подкожно вводят дозы один раз в день в течение семи дней в соответствии с одним из режимов, указанных ниже. В каждой группе пять крыс, и последнюю дозу вводят за два часа до умерщвления.

. Носитель (50% DMSO/ 50% Dulbecco's PBS)

Пример 24 (50 мг/кг)

Результаты исследования А показаны в таблице (9). У крыс, которым вводили дозы носителя, диарея продолжалась в течение курса исследования. Качество стула улучшалось у крыс, обработанных соединением примера 24.

Таблица 9: Оценка характера стула у крыс HLA, обработанных подкожно соединениями в течение 5 дней. Представленные величины - средние оценки группы
День	Носитель	Пример 24 (50 мг/кг)
1	3	2,8
2	3	2
3	3	1,8
4	3	1,6
5	3	1,6
6	3	1,4
3 = диарея, 2 = мягкий стул, 1 = нормальный стул

В исследовании В крысам (в возрасте 8-10 недель) дозы вводили через рот в течение двадцати шести дней, как следует:

. Носитель (2% Tween-80/0,5% метилцеллюлоза)

. Пример 25 (10 мг/кг в дни с 1 по 14, затем с 15 дня увеличивали до 20 мг/кг)

. Пример 34 (10 мг/кг)

Получены следующие результаты (таблица (10)), и они показывают, что характер стула улучшился у всех крыс, обработанных типичными соединениями по изобретению.

Таблица 10: Оценка характера стула у крыс HLA, обработанных через рот носителем или типичными соединениями по изобретению. Представленные величины - средние оценки группы.
День	Носитель	Пример 25	Пример 34
1	1	1	1
2	1	1	1
3	1	1,25	1
4	1,25	1,25	1,25
5	2,5	1,75	2
6	2,75	1,5	1,75
7	2,75	2	1,75
8	2,75	2	1,5
9	3	1,75	1,5
10	3	1,5	1,25
11	2,75	2	1,5
12	2,75	1,75	1,5
13	2,75	2,25	1,25
14	2,75	2	1,25
15	2,75	2	1,25
16	3	1,5	1
17	2,75	1,5	1
18	2,75	1,5	1,25
19	2,75	1,25	1
20	ND	ND	ND
21	ND	ND	ND
22	3	1,25	1
23	3	1,25	1
24	3	1,25	1
25	3	1,25	1
26	3	1,25	1
ND: не определено 3 = диарея, 2 = мягкий стул, 1 = нормальный стул

В исследовании С крысам (в возрасте 8-10 недель) дозы одного из составов, перечисленных ниже, вводили через рот один раз в день в течение сорока шести дней. В каждой группе было по 4 крысы, и последнюю дозу вводили за два часа до умерщвления.

. Носитель (2% Tween-80/0,5% метилцеллюлоза)

. Пример 21 (10 мг/кг в дни с 1 по 18, затем с 19 дня увеличивали до 20 мг/кг)

. Пример 24 (10 мг/кг в дни с 1 по 24, затем с 25 дня увеличивали до 20 мг/кг)

Получены следующие результаты (таблица (11)), и они показывают, что характер стула улучшался с введением всех селективных по отношению к ER соединений:

Таблица 11: Оценки стула у крыс HLA, обработанных через рот носителем или типичными соединениями по изобретению. Представленные величины - средние оценки группы.
День	Носитель	Пример 24	Пример 21
1	2,75	2,75	2,75
2	3	2,75	3
3	3	2,75	2,75
4	3	2,5	2,75
5	3	2	2,75
6	3	2,5	2,5
7	3	2,25	2,5
8	3	2,25	2,75
9	3	2,25	2,5
10	3	2,25	2,75
11	3	2,25	2,5
12	3	1,75	2,5
13	3	2,25	2,5
14	3	2	2,5
15	3	1,75	2,5
16	3	1,75	2,5
17	3	1,75	2,5
18	3	1,75	2,5
19	3	1,75	2,75
20	3	1,75	2,5
21	3	1,75	2,75
22	3	1,75	2,5
23	3	1,75	2,25
24	3	2	1,75
25	3	2	2
26	2,75	2,25	2
27	3	1,75	2
28	3	1,75	2
29	3	1,5	2
30	2,75	1,5	2,25
31	3	1,5	2,25
32	3	1,5	2
33	3	1,75	1,5
34	3	1,75	1,75
35	3	1,5	1,5
36	3	1,5	1,75
37	3	1,25	1,5
38	3	1,75	1,5
39	3	1,75	2
40	3	1,5	1,75
41	3	1,75	2
42	3	1,5	2
43	3	1,5	2
44	3	1,5	2
45	3	1,25	2
46	3	1,25	2
ND: не определено 3 = диарея, 2 = мягкий стул, 1 = нормальный стул

Гистологический анализ. Ткань толстой кишки погружают в 10% нейтральный забуференный формалин. Каждый экземпляр толстой кишки разделяют на четыре образца для оценки. Фиксированные формалином ткани перерабытывают в вакуумном инфильтрационном процессоре Tissue Tek (Miles, Inc.; West Haven, Connecticut) для заделки в парафин. Из образцов изготавливают срезы толщиной 5 мкм и затем их окрашивают гематоксилином и эозином (H&E) для гистологических оценок слепым методом с использованием шкалы, модифицированной после Boughton-Smith. После завершения оценки образцы расшифровывают и данные заносят в таблицу и анализируют линейным моделированием ANOVA с множественными сравнениями средних значений. Срезы ткани толстой кишки оценивают по различным показателям болезни и дают относительные оценки. Как показано в таблице (12) (композиция двух исследований подкожного введения доз, включая исследование А), пример 24 является эффективным в отношении уменьшения нескольких измерений поражения ткани.

Таблица 12: Гистологическая оценка тяжести болезни на крысиной модели HLA-B27; Композиция двух исследований с использованием подкожного введения доз в течение 5 дней
Группа	Изъязвление (0-2)	Воспаление (0-3)	Глубина поражения (0-2)	Фиброз (0-2)	Общая оценка
Носитель	1,38	2,69	1,19	0,88	6,13
Пример 24 (50 мг/кг)	0,25*#	1,05*#	0,2*#	0*	1,5*#
Пример 24 (10 мг/кг)а	0,81*	1,63*	0,69*	0,50*	3,6*
Пример 24 (1 мг/кг) а	1,25	1,63*	0,88*	0,75	4,4*
а данные, взятые из второго исследования *sig < носитель или ЕЕ + ICI # sig < EE

Кишечную ткань из исследования В (смотри выше) также исследуют гистологически. Как показано ниже (таблица (13)), оба соединения значительно снижают общую оценку болезни.

Таблица 13: Гистологическая оценка тяжести болезни в толстой кишке от животных, которым в течение 4 недель вводили через рот типичные соединения по изобретению. Средние ± SD
Группа	Изъязвление (0-2)	Воспаление (0-3)	Глубина поражения (0-2)	Фиброз (0-2)	Общая оценка
Носитель	1,44±0,66	2,88±0,14	1,56±0,63	1,06±0,32	6,94±1,51
Пример 25	0,44±0,24*	1,50±0,35*	0,44±0,24*	0,31±0,13*	2,69±0,52*
Пример 34	0,75±0,46*	1,81±0,13*	0,63±0,32*	0,31±0,32*	3,50±1,10*
*sig < носитель

Кишечную ткань из исследования С (смотри выше) также исследуют гистологически. Как показано ниже (таблица (14)), пример 24 значительно снижает общую оценку болезни. Оценки примера 21 по всем параметрам болезни, хотя и статистически незначительно, были ниже, чем соответствующие оценки от обработанных носителем крыс.

Таблица 14: Гистологическая оценка тяжести болезни в толстой кишке от животных, которым в течение 7 недель вводили через рот типичные соединения по изобретению. Средние ± SD
Группа	Изъязвление (0-2)	Воспаление (0-3)	Глубина поражения (0-2)	Фиброз (0-2)	Общая оценка
Носитель	1,19±0,69	2,38±0,32	1,0±0,54	0,94±0,75	5,50±2,1
Пример 21	0,81±0,47	2,06±0,43	0,75±0,50	0,56±0,32	4,19±1,74
Пример 24	0*	0,69±0,24*	0*	0*	0,69±0,24*
*sig < носитель

Оценка на двух моделях артрита

Анализ на крысах Lewis вызванного адъювантом артрита. Шестьдесят самок крыс Lewis в возрасте 12 недель содержат согласно стандартным процедурам, облегчающим работу. Они получают стандартный рацион при свободном доступе к пище и воде. Каждое животное идентифицируют карточкой на клетке, указывающей группу проекта и номер животного. Номер каждой крысы наносят маркером с несмываемой краской на хвост. По меньшей мере за 10-21 день до исследования их анестезируют и подвергают овариэктомии стандартными хирургическими методами в асептических условиях.

Чтобы вызвать артрит, используют полный адъювант Фрейнда (Sigma Immuno Chemicals, St. Louis, MO), каждый мл содержит 1 мг убитых теплом и высушенных Mycobacterium tuberculosis, 0,85 мл минерального масла и 0,15 мл моноолеата маннида Lot No. 084H8800.

Следующее представляет примеры двух тест-процедур. Тест-процедура ингибирования: Тридцати крысам впрыскивают подкожно при основании хвоста 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда. Животных произвольно разбивают на четыре группы, каждая группа содержит шесть крыс. Каждый день группы получают носитель (50% DMSO (JT Baker, Phillipsburg, NJ)/ 1x фосфатный физиологический раствор Dulbecco (GibcoBRL, Grand Island, NY)) или испытуемое соединение (вводят подкожно). Обработку всех крыс начинают в 1 день. Данные для типичных соединений по изобретению показаны в таблице (15).

Тест-процедура обработки: Тридцати крысам впрыскивают подкожно при основании хвоста 0,1 мл полного адъюванта Фрейнда. Животных произвольно разбивают на четыре группы, каждая группа содержит шесть крыс. Каждый день группы получают носитель (50% DMSO (JT Baker, Phillipsburg, NJ)/ 1x фосфатный физиологический раствор Dulbecco (GibcoBRL, Grand Island, NY)) или испытуемое соединение (вводят подкожно). Обработку всех крыс начинают на 8 день после инъекции адъюванта. Данные для типичных соединений по изобретению показаны в таблицах (16), (17) и (18).

Статистический анализ проводят с использованием Abacus Concepts Super ANOVA (Abacus Concepts, Inc. Berkeley, CA). Все представляющие интерес параметры подвергают дисперсионному анализу с новым множественным post hoc (лат.) тестированием диапазонов по Duncan между группами. Данные везде представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD), и различия считаются значительными, если р<0,05.

Степень тяжести артрита отслеживают ежедневно с точки зрения следующих проявлений болезни: эритема задней лапы, опухание задней лапы, болезненность суставов и перемещения и положение тела. Числовую шкалу от 0 до 3 используют для количественной оценки степени эритемы (0 = нормальная лапа, 1=слабая эритема, 2 = умеренная эритема, 3 = тяжелая эритема) и опухания (0 = нормальная лапа, 1 = слабая припухлость, 2 = умеренное опухание, 3 = сильное опухание задней лапы). Максимальная оценка за день равна 12.

В конце исследования крыс умерщвляют СО₂, задние конечности отделяют при вскрытии трупа и фиксируют в 10% забуференном формалине и предплюсневые суставы декальцифицируют и заделывают в парафин. Гистологические срезы окрашивают гематоксилином и эозином или красителем Saffranin O - Fast Green.

Слайды кодируют так, чтобы эксперт не знал их принадлежности к группам обработки. Синовиальную ткань из предплюсневых суставов оценивают на основе синовиальной гиперплазии, инфильтрации воспаленных клеток и образования паннуса [Poole and Coombs, International Archives of Allergy & Applied Immunology 54: 97-113 (1977)], как описано в общих чертах ниже.

Категория	Степень
1. Синовиальные выстилающие клетки
а. Нет изменения	0
b. Клетки расширенные, слегка утолщенные	1
с. Клетки расширенные, увеличены по численности, умеренно утолщенные. Нет ворсинок.	2
d. Клетки расширенные, утолщенные. Ворсинки присутствуют.	3
2. Фиброплазия
а. Нет изменения	0
b. Фиброплазия присутствует под выстилающими клетками	1
с. Небольшая площадь альвеолярной ткани замещена фиброзной тканью	2
d. Замещение альвеолярной ткани фиброзной тканью	3
3. Воспалительные клетки
а. Иногда видны, разрозненные по всему отбору	0
b. Клетки присутствуют в малых количествах в слое выстилающих клеток или как раз под ним и/или вокруг кровеносных сосудов	1
с. Небольшое очаговое скопление клеток может присутствовать	2
d. Большое число клеток присутствует в капсуле и в или под слоями выстилающих клеток Часто наблюдается большой очаг	3
4. Паннус
а. Не поддается обнаружению	0
b. Поддается обнаружению	1

В дополнение, хрящ и кость сустава оценивают, используя систему гистологической оценки Mankin [Mankin. et al., Journal of Bone & Joint Surgery - American Volume 53: 523-37 (1971)], как показано ниже.

Категория	Степень
1. Структура
а. Нормальная	0
b. Неравномерность поверхности	1
с. Паннус и неравномерность поверхности	2
d. Трещины до переходной зоны	3
e. Трещины до радиальной зоны	4
f. Трещины до кальцифицированной зоны	5
g. Полная дезорганизация	6
2. Клетки
а. Нормальные	0
b. Диффузная гиперцеллюлярность	1
с. Клонирование	2
d. Гипоцеллюлярность	3
3. Окрашивание сафранином О
а. Нормальное	0
b. Легкое уменьшение	1
с. Умеренное уменьшение	2
d. Сильное уменьшение	3
е. Краситель не замечен	4
4. Целостность пограничной области
а. Интактная	0
b. Пересечена кровеносными сосудами	1

Таблица 15: Оценка воспаления сустава на крысах Lewis: протокол ингибирования
День	Носитель	Пример 24
1	0,00	0,00
2	0,00	1,00
3	4,50	4,50
4	5,50	4,83
5	9,33	5,83
6	10,50	6,16
7	10,60	6,16
8	11,00	5,33
9	11,50	5,66
10	11,33	4,33
11	10,83	3,16
12	10,83	3,16
13	11,00	2,16
14	11,00	3,33
15	11,00	3,00
16	11,00	1,66
17	10,50	1,50

Таблица 16: Оценка воспаления сустава на крысах Lewis: протокол обработки
День	Носитель	Пример 24	Пример 27	Пример 32
1	10,83	11,33	11,33	11,33
2	11,00	11,15	11,15	10,83
3	10,83	11,33	11,33	9,33
4	11,33	9,50	9,83	8,00
5	11,50	8,00	8,83	5,83
6	11,50	7,00	7,83	3,33
7	11,50	5,83	6,16	3,00
8	11,50	4,83	5,00	2,50
9	11,00	3,50	4,33	2,50
10	11,00	3,83	2,66	2,50
11	10,66	3,83	1,83	2,50
12	10,66	3,83	1,83	2,50
13	10,50	3,16	2,66	2,50
14	9,83	3,16	2,66	2,50
15	8,10	2,83	2,00	2,00
16	7,35	2,83	2,00	1,33
17	6,50	2,00	1,50	1,00

Таблица 17: Гистологическая оценка синовита в предплюсневых суставах на крысах Lewis (среднее ± SD): протокол обработки
Группа	Синовиальная структура (0-3)	Фиброплазия (0-3)	Воспалительные клетки (0-3)	Паннус (0-1)	Общая оценка синовита (0-10)
Носитель	2,58±0,38	1,75±0,42	2,92±0,20	1,00± 0,89	8,25± 1,57
Пример 24 (50 мг/кг)	1,42±0,49*	0,42±0,80*	1,33±0,41*	0,08±0,20*	3,25±1,54*
* sig < носитель

Таблица 18: Гистологическая оценка изменения хряща (оценки по Mankin) в предплюсневых суставах на крысах Lewis (среднее ± SD): протокол обработки
Группа	Структура хряща (0-6)	Клетки хряща (0-3)	Окрашивание сафранин-О/ быстрый зеленый (0-4)	Целостность пограничной области (0-1)	Общая оценка по Mankin (0-14)
Носитель	2,83±0,26	2,58±0,38	2,50±0,32	0	7,92±0,74
Пример 24 (50 мг/кг)	1,58±0,49*	0,83±0,75*	1,25±0,69*	0	3,67±1,86*
* sig < носитель

Оценка артрита на крысиной модели HLA-B27. Типичные соединения по изобретению оценивают в стандартной фармакологической тест-процедуре на крысах HLA-B27, которая имитирует артрит у людей. Следующее кратко описывает используемую процедуру и полученные результаты. Самцов крыс HLA-B27 получают от Taconic и обеспечивают им неограниченный доступ к пище (PMI Lab diet 5001) и воде. Оценки сустава и гистологические оценки делают так же, как описано выше для крысиной модели Lewis вызванного адъювантом артрита.

Исследование 1: Крысам (возраст 8-10 недель) один раз в день в течение сорока шести дней вводят через рот дозы одного из составов, перечисленных ниже. В каждой группе было по 4 крысы, и последнюю дозу вводили за 2 часа до умерщвления.

. Носитель (2% Tween-80/0,5% метилцеллюлоза)

. Пример 21 (10 мг/кг в дни с 1 по 18, затем с 19 дня увеличивают до 20 мг/кг)

. Пример 24 (10 мг/кг в дни 1-24, затем с 25 дня увеличивают до 20 мг/кг)

Получены следующие результаты для типичных соединений по изобретению (таблицы (19) и (20)).

Таблица 19: Оценка воспаления сустава из исследования 1
День	Носитель	Пример 24	Пример 21
29	2,5	1,5	0,75
30	6	0,5	1,75
31	5	0,5	1,25
32	6,75	1,25	0,75
33	8	2	1
34	8	2,25	1,25
35	8	2	2,25
36	6	2,25	1
37	7,5	2	4
38	6,5	2,75	1,5
39	7,5	2,25	1,5
40	7,5	1,75	2,25
41	6,5	2	2,25
42	6,5	2,5	1,5
43	6	4,75	1,25
44	6,75	3	1
45	5,5	2,75	2,5
46	6	3,25	2

Таблица 20: Оценка гистологии сустава из исследования 1
Соединение	Оценка синовита (среднее ± SD)	Оценка по Mankin (среднее ± SD)
Носитель	7,75±2,6	6,75±1,0
Пример 24	3,17±0,3*	3,5±1,8**
Пример 21	6,1±0,75	4,6±0,9
*sig < носитель, р<0,07 ** sig < носитель, p<0,05

Исследование 2: Крысам (возраст 8-10 недель) в течение двадцати шести дней вводят через рот дозы одного из составов, перечисленных ниже. В каждой группе 4 крысы, и последнюю дозу вводят за два часа до умерщвления.

. Носитель (2% Tween-80/0,5% метилцеллюлоза)

. Пример 25 (10 мг/кг в дни 1-14, затем с 15 дня увеличивают до 20 мг/кг)

. Пример 34 (10 мг/кг)

Получены следующие результаты для типичных соединений по изобретению (таблица (21)).

Таблица 21: Оценка воспаления сустава на крысах HLA из исследования 2
День	Носитель	Пример 25	Пример 34
1	0	0	0
2	0	0	0
3	0	0	0
4	0	0	0
5	0	0	0
6	0	0	0
7	0	0	0
8	2,5	1	0,25
9	3,75	2	0,75
10	2,75	2,25	0,5
11	3,5	2,25	0,5
12	1,25	2	0,25
13	1,25	2	0,5
14	1,25	2	0
15	5,25	3,75	0,5
16	4,5	3	0,5
17	3,5	2,75	0,25
18	3,75	2	0,75
19	5,5	1,5	1
22	3,25	1,25	1
23	6,5	2,5	1,75
24	6,5	2	1,75
25	6,25	2	2
26	7	1,75	3

Оценка канцерогенеза на моделях in vivo

Способность соединений по данному изобретению лечить и подавлять различные злокачественные или гиперпролиферативные нарушения может быть оценена в стандартных фармакологических тест-процедурах, которые легко доступны в литературе и включают следующие две процедуры.

Рак молочной железы. Атимических (голых) мышей nu/nu получают с удаленными яичниками из Charles River Laboratories (Wilmington, MA). За день до инъекции опухолевых клеток животным имплантируют замедленно высвобождающие таблетки, содержащие 0,36-1,7 мг 17 -эстрадиола (высвобождение 60 или 90 дней, Innovative Research of America, Sarasota, FL), или плацебо. Таблетку вводят подкожно в подлопаточный участок с помощью прецизионного троакара 10 размера. После этого мышам впрыскивают подкожно в ткань молочной железы или 1 х 10⁷ клеток MCF-7, или 1 х 10 ⁷ клеток BG-1. Клетки смешивают с равным объемом матригеля, базисного препарата мембранного матрикса, чтобы улучшить образование опухоли. Испытуемые соединения могут быть оценены или путем дозирования через день после имплантации опухолевых клеток (режим подавления), или после достижения опухолями конкретного размера (режим лечения). Соединения вводят каждый день или интраперитонеально, или перорально в носителе из 1% tween-80 в физиологическом растворе. Размер опухоли оценивают через каждые три или семь дней.

Рак толстой кишки. Способность лечить или подавлять рак толстой кишки может быть оценена в тест-процедуре Smirnoff [Oncology Research 11: 255-64 (1999)].

Оценка нейрозащиты в двух тест-процедурах in vivo

Временная глобальная ишемия на монгольской песчанке. Влияние испытуемых соединений на предотвращение или лечение поражения головного мозга в ответ на кислородную депривацию/реперфузию может быть измерено с помощью следующей тест-процедуры.

Самцов монгольской песчанки (60-80 г; Charles River Laboratories, Kingston, NY) размещают в оборудовании для содержания животных Wyeth-Ayerst (сертифициорованном AAALAC) с 12-часовым световым периодом и 12-часовым темным периодом и обеспечивают свободный доступ к водопроводной воде и казеиновому корму с низким содержанием эстрогена (Purina, Richmond, IN). После акклиматизации (3-5 дней) песчанок анестезируют изофлураном (2-3% смесь с О₂), подвергают овариэктомии (день 0). Начиная со следующего утра (день 1), песчанок обрабатывают подкожно каждый день или носителем (10% ЕТОН/кукурузное масло), или 17 -эстрадиолом (1 мг/кг, sc), или экспериментальным соединением. На 6 день песчанок (n=4-5/группа) анестезируют изофлураном, сонные артерии обнажают через разрез по срединной линии шеи и обе артерии одновременно закупоривают на 5 минут нетравмирующими микрозажимами для аневризмы. После закупорки зажимы удаляют, чтобы дать возможность церебральной реперфузии, и шейный разрез закрывают скобками для ран. Всех животных привязывают на ночь перед хирургической операцией по поводу глобальной ишемии, эта стадия способствует стойкому ишемическому поражению. На 12 день песчанок подвергают воздействию летальной дозы СО₂ и их головной мозг замораживают на сухом льду и хранят при -80°С. Протоколы животных, используемых для этих исследований, рассмотрены и утверждены Radnor/Collegeville Animal Care and Use Committee (RACUC/CACUC) at Wyeth-Ayerst Research.

Степень нейронной защиты оценивают анализом гибридизации in situ mRNA нейрогранина. 20 мкм коронарные криостатные срезы собирают на покрытые желатином слайды, сушат и хранят при -80°С. Во время обработки боксы для высушенных слайдов нагревают до комнатной температуры, слайды подвергают постфиксации в 4% параформальдегиде, обрабатывают уксусным ангидридом и затем обезжиривают и дегидратируют хлороформом и этанолом. Слайды с помещенным на них обработанным срезом гибридизируют с 200 мкл (6х10⁶ DPM/слайд) антисмыслового или смыслового (контроль) рибозонда для нейрогранина (³⁵S-UTP-меченный NG-241; основания 99-340) в 50% формамидной смеси для гибридизации и инкубируют в течение ночи при 55°С во влажной камере для слайдов без покровных стекол. На следующее утро слайды собирают в штативы, погружают в 2хSSC (0,3 М NaCl, 0,03 М цитрат натрия, рН 7,0)/10 мМ DTT, обрабатывают RNазой А (20 мкг/мл) и промывают (2 х 30 мин) при 67°С в 0,1 х SSC, чтобы удалить неспецифическую метку. После дегидратации слайды на ночь помещают против рентгеновской пленки BioMax (BMR-1; Kodak).

Уровень сигнала гибридизации нейрогранина используют для количественного определения степени нейронной потери в регионе СА1 после поражения и для оценки эффективности 17 -эстрадиола и экспериментальных соединений. mRNA нейрогранина выбрана для этих исследований, потому что она высоко экспрессирована в нейронах гиппокампа, включая СА1, но отсутствует в глиальных и других типах клеток, присутствующих в этом регионе головного мозга. Следовательно, измерение количества присутствующей mRNA нейрогранина представляет выжившие нейроны. Измерения относительной оптической плотности сигнала гибридизации нейрогранина получают от пленочных авторентгенограмм с системой анализа изображений на компьютерной основе (C-Imaging Inc., Pittsburgh, PA). Результаты от 6 срезов (толщиной 40 мкм) на животное устредняют и оценивают статистически. Числовые величины представлены как среднее ± SEM. Однонаправленный дисперсионный анализ используют для тестирования различий в уровне mRNA нейрогранина и всех утверждений о неразличимости результатов, имея в виду часть, где p>0,05.

Следующие результаты получены с типичными соединениями по изобретению (таблица (22)).

Таблица 22: Влияние типичных соединений по изобретению на предохранение нейронов в гиппокампе песчанок
Соединение	mRMA нейрогранина (произвольные единицы, среднее ± ст.откл.)
Носитель	0,0
Пример 24	0,0
Пример 41	43,0±21,8

Окклюзия срединной церебральной артерии на мышах. Нейрозащита может быть оценена согласно тест-процедурам, описанным Dubal [см. Dubal et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98: 1952-1957 (2001), Dubal, et al., Journal of Neuroscience 19: 6385-6393 (1999)].

Стандартная фармакологическая тест-процедура ингибирования овуляции

Тест-процедуру используют, чтобы определить, могут ли испытуемые соединения ингибировать или изменять время овуляции. Она может быть также использована для определения числа овулированных ооцитов [Lundeen, et al., J Steroid Biochem Mol Biol 78: 137-143 (2001)].

Следующие результаты получены с типичными соединениями по изобретению (таблица (23)).

Таблица 23: Влияние соединений по изобретению на ингибирование овуляции
Соединение	Число ооцитов (среднее ± SEM)
Носитель	13,00±0,72
Пример 20 (50 мг/кг)	14,13±0,79
Пример 24 (50 мг/кг)	13,86±0,77

Оценка в стандартной фармакологической тест-процедуре эндометриоза

Эта процедура является слегка модифицированным опубликованным методом [Bruner-Tran. et al., Journal of Clinical Investigation 99: 2851-2857 (1997)]. нормальную внутриматочную ткань человека (˜12 день цикла) обрабатывают in vitro в течение ночи 10 нМ 17 -эстрадиолом и затем имплантируют атимической голой мыши с удаленными яичниками. Для целей этих исследований мышам не имплантируют эстроген/плацебо, как описано в статье. Повреждениям позволяют восстановиться по меньшей мере в течение 10 дней, затем начинают ежедневное дозирование через рот и продолжают его по меньшей мере 15 дней. Следует отметить, что все мыши имели видимые повреждения при начале дозирования. При вскрытии определяют число мышей с повреждениями, а также число повреждений на мышь.

Соединение примера 24 оценивают три раза в этой процедуре при дозе 10 мг/кг. В каждой тест-процедуре у мышей, получавших дозы соединения примера 24, при вскрытии были обнаружены меньшие повреждения, чем у мышей, получавших дозы носителя. Например, в исследовании 1 каждая из четырех мышей в группе носителя имела по меньшей мере одно повреждение, и число повреждений в этой группе было 10. Напротив, только две из шести мышей, обработанных соединением примера 24, имели повреждения, и было найдено только одно повреждение на животное. Следовательно, поскольку все мыши имели повреждения при начале обработки, соединение примера 24 вызвало регрессию повреждений у четырех из шести мышей.

На основе результатов, полученных в стандартных фармакологических тест-процедурах, соединения по данному изобретению являются модуляторами эстрогенного рецептора, применимыми в лечении или ингибировании состояний, расстройств или болезненных состояний, которые по меньшей мере частично опосредуются недостаточностью или избыточностью эстрогена или которые могут быть излечены или ингибированы путем применения эстрогенного агента. Соединения по данному изобретению особенно применимы в лечении пациенток в период менопаузы, непосредственно перед ней и после, у которых значительно снижаются уровни продуцирования эндогенных эстрогенов. Менопауза обычно определяется как последний естественный менструальный период и характеризуется прекращением функции яичников, что приводит к существенному снижению циркуляции эстрогена в кровяном русле. Как используется здесь, менопауза включает также состояния пониженного продуцирования эстрогена, которые могут быть вызваны хирургически, химически или могут быть вызваны болезненным состоянием, которое ведет к преждевременному снижению или прекращению функции яичников.

Соединения по данному изобретению также применимы в ингибировании или лечении других эффектов недостаточности эстрогена, включая "приливы", вагинальную или вульварную атрофию, атрофический вагинит, вагинальную сухость, прурит, диспареунию, дизурию, частое мочеиспускание, недержание мочи, инфекции мочевых путей. Другие применения для половых путей включают лечение или ингибирование дисфункционального маточного кровотечения. Соединения также применимы в лечении или ингибировании эндометриоза.

Соединения по данному изобретению воздействуют также на головной мозг и, следовательно, применимы для ингибирования или лечения болезни Альцгеймера, снижения познавательной способности, пониженного либидо, старческого слабоумия, нейродегенеративных расстройств, депрессии, беспокойства, бессоницы, шизофрении и бесплодия. Соединения по данному изобретению применимы также в лечении или ингибировании доброкачественного или злокачественного аномального роста ткани, включая гломерулосклероз, гипертрофию простаты, лейомиому матки, рак молочной железы, склеродерму, фиброматоз, внутриматочный рак, синдром поликистозного яичника, внутриматочные полипы, доброкачественную болезнь молочной железы, аденомиоз, рак яичников, меланому, рак простаты, рак толстой кишки, рак ЦНС, такой как глиома или астиобластома.

Соединения по данному изобретению являются кардиозащитными и являются антиоксидантами и применимы для снижения уровней холестерина, триглицеридов, Lp(а) и LDL; для ингибирования или лечения гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, сердечно-сосудистой болезни, атеросклероза, болезни периферических сосудов, рестеноза и вазоспазма и ингибирования повреждения стенок сосудов от случаев, ведущих к иммуно-опосредуемому сосудистому поражению. Соединения по данному изобретению также применимы в лечении расстройств, связанных с воспалительными или аутоиммунными болезнями, включая воспалительную болезнь кишечника (болезнь Крона, язвенный колит, индетерминантный колит), артрит (ревматоидный артрит, спондилоартропатии, остеоартрит), плеврит, ишемическое/реперфузионное поражение (напр., удар, отторжение трансплантата, инфаркт миокарда и т.п.), астму, гигантоклеточный артериит, простатит, увеит, псориаз, рассеянный склероз, системную красную волчанку и сепсис.

Соединения по данному изобретению также применимы в лечении или ингибировании глазных расстройств, включая катаракты, увеит и дегенерацию желтого пятна, и в лечении состояний кожи, таких как старение, облысение и угри.

Соединения по данному изобретению также применимы в лечении или ингибировании метаболических расстройств, таких как диабет типа II, расстройств липидного метаболизма, аппетита (напр., таких как отсутствие аппетита на нервной почве и булимия).

Соединения по данному изобретению также применимы в лечении или ингибировании кровотечений, таких как наследственная геморрагическая телеангиэктазия, дисфункциональное маточное кровотечение, и для борьбы с геморрагическим шоком.

Соединения по данному изобретению применимы при болезненных состояниях, где аменорея является выгодной, таких как лейкоз, внутриматочные экстирпации, хроническая болезнь почек или печени или болезненные состояния или нарушения коагуляции.

Соединения по данному изобретению могут быть использованы в качестве противозачаточных средств, особенно в сочетании с прогестином.

Понятно, что при введении для лечения или ингибирования конкретного болезненного состояния или расстройства эффективная доза может изменяться в зависимости от конкретного используемого соединения, способа введения, состояния и тяжести его, состояния, которое требует лечения, а также различных физических факторов, относящихся к индивидууму, которого лечат. Эффективное введение соединений по данному изобретению может быть в оральной дозе от около 0,1 мг/сутки до около 1000 мг/сутки. Предпочтительно введение будет от около 10 мг/сутки до около 600 мг/сутки, более предпочтительно от около 50 мг/сутки до около 600 мг/сутки, в разовой дозе или в двух или более раздельных дозах. Планируемая суточная система доз, как предполагается, будет изменяться в зависимости от пути введения.

Такие дозы могут быть введены любым образом, применимым для направления данных активных соединений в кровяное русло реципиента, например перорально, посредством имплантата, парентерально (включая внутривенные, интраперитонеальные, внутрисуставные и подкожные инъекции), ректально, интраназально, местно, через глаза (посредством глазных капель), вагинально и трансдермально.

Составы для перорального введения, содержащие активные соединения по данному изобретению, могут содержать любые обычно используемые формы для перорального введения, включая таблетки, капсулы, защечные формы, лепешки, пастилки и жидкости для перорального приема, суспензии или растворы. Капсулы могут содержать смеси активного соединения (соединений) с инертными наполнителями и/или разбавителями, такими как фармацевтически приемлемые крахмалы (напр., кукурузный, картофельный или крахмал тапиоки), сахара, искусственные подслащиватели, порошкообразные целлюлозы, такие как кристаллическая и микрокристаллическая целлюлозы, мука, желатины, камеди и т.п. Применимые составы таблеток могут быть приготовлены методами обычного прессования, влажного гранулирования или сухого гранулирования, и в них могут быть использованы фармацевтически приемлемые разбавители, связующие агенты, смазки, дезинтегранты, модифицирующие поверхность агенты (включая поверхностно-активные вещества), суспендирующие или стабилизирующие агенты, включая, но без ограничения перечисленным, стеарат магния, стеариновую кислоту, тальк, лаурилсульфат натрия, микрокристаллическую целлюлозу, кальциевую соль карбоксиметилцеллюлозы, поливинилпирролидон, желатин, альгиновую кислоту, камедь акации, ксантановую камедь, цитрат натрия, комплексные силикаты, карбонат кальция, глицин, декстрин, сахарозу, сорбит, фосфат дикальция, сульфат кальция, лактозу, каолин, маннит, хлорид натрия, тальк, сухие крахмалы и сахарную пудру. Предпочтительные модифицирующие поверхность агенты включают неионогенные и анионогенные модифицирующие поверхность агенты. Типичные примеры модифицирующих поверхность агентов включают, но без ограничения перечисленным, полоксамер 188, хлорид бензалкония, стеарат кальция, цетостеариловый спирт, эмульгирующий воск цетомакрогол, сложные эфиры ангидросорбита, коллоидальный диоксид кремния, фосфаты, додецилсульфат натрия, смешанный силикат магния-алюминия и триэтаноламин. Данные составы для перорального введения могут использовать стандартные составы с замедленным или отсроченным высвобождением для изменения абсорбции активного соединения (соединений). К составам для перорального применения можно также отнести введение активного ингредиента в воде или во фруктовом соке, содержащем подходящие солюбилизаторы или эмульгаторы, если требуется.

В некоторых случаях может быть желательно вводить соединения непосредственно в дыхательные пути в виде аэрозоля.

Соединения по данному изобретению могут быть также введены парентерально или интраперитонеально. Растворы или суспензии этих активных соединений в форме свободного основания или фармацевтически приемлемой соли могут быть приготовлены в воде, подходяще смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии также могут быть приготовлены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях в маслах. При обычных условиях хранения и применения эти препараты содержат консервант для ингибирования роста микроорганизмов.

Фармацевтические формы, подходящие для применения для инъекций, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов или дисперсий для немедленного введения. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть жидкой до такой степени, чтобы быть пригодной для введения шприцем. Она должна быть стабильна в условиях изготовления и хранения и должна быть предохранена против загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (напр., глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль), подходящие смеси их и растительные масла.

Для целей данного раскрытия трансдермальные введения, как подразумевается, включают все введения через поверхность тела и внутренние выстилки проходов в теле, включая эпителиальную и слизистую ткани. Такие введения могут быть проведены с использованием данных соединений или их фармацевтически приемлемых солей в лосьонах, кремах, пенах, пластырях, суспензиях, растворах и суппозиториях (ректальных и вагинальных).

Трансдермальное введение может быть осуществлено путем использования трансдермального пластыря, содержащего активное соединение и носитель, который является инертным по отношению к активному соединению, является нетоксичным для кожи и обеспечивает доставку агента для системной абсорбции в кровяное русло через кожу. Носитель может принимать несколько форм, таких как кремы и мази, пасты, гели и окклюзивные устройства. Кремы и мази могут вязкими жидкими или полутвердыми эмульсиями типа масло в воде или вода в масле. Пасты, состоящие из абсорбирующих порошков, диспергированных в петролатуме или в гидрофильном петролатуме, содержащем активный ингредиент, также могут быть подходящими. Разнообразные окклюзивные устройства могут быть использованы для высвобождения активного ингредиента в кровяное русло, такие как полупроницаемая мембрана, покрывающая резервуар, содержащий активный ингредиент с носителем или без него, или матрица, содержащая активный ингредиент. Другие окклюзивные устройства известны в литературе.

Составы суппозиториев могут быть приготовлены из традиционных материалов, включая какао-масло, с добавлением или без парафинов для изменения температуры плавления суппозитория и глицерина. Растворимые в воде основы суппозиториев, такие как полиэтиленгликоли различных молекулярных масс, также могут быть использованы.

Приготовление типичных примеров по данному изобретению описано ниже.

Пример 1

2-(5-Гидрокси-1,3-бензоксазол-2-ил)бензол-1,4-диол

Стадия а) N-(2,5-Диметоксифенил)-2,5-диметоксибензамид

Смесь 2,5-диметоксибензойной кислоты (5,0 г, 27,5 ммоль) и тионилхлорида (15 мл) кипятят с возвращением флегмы в течение 1 ч. Летучие вещества удаляют в вакууме. Остаток растворяют в ТГФ (20 мл) и добавляют в холодный (0°С) раствор 2,5-диметоксианилина (4,6 г, 30,2 ммоль), триэтиламина (5 мл, 35,9 ммоль) и ТГФ (40 мл). Смесь перемешивают в течение 30 минут, выливают в воду, подкисляют HCl (2 н.) и экстрагируют EtOAc. Органические экстракты сушат над MgSO₄. Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (гексаны/EtOAc 2/1) дают белое твердое вещество (8,1 г, выход 93%, т.пл. 121-123°С); МС m/e 318 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₇Н ₁₉NO₅

Рассчитано: С 64,34; Н 6,03; N 4,41

Обнаружено: С 64,29; Н 5,95; N 4,44

Стадия b) 2-(5-Гидрокси-1,3-бензоксазол-2-ил)бензол-1,4-диол

Смесь N-(2,5-диметоксифенил)-2,5-диметоксибензамида (1,0 г, 3,1 ммоль) и гидрохлорида пиридина (2,0 г, 17,3 ммоль) перемешивают при 200°С в течение 1 часа. Смесь охлаждают до комнатной температуры и добавляют HCl (10 мл, 2 н.). Смесь затем экстрагируют EtOAc и органические экстракты сушат над MgSO ₄. Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (гексаны/ EtOAc 2/1) дают белое твердое вещество (0,8 г, выход 76%, т.пл. 309-311°С); МС m/e 242 (М-Н)⁺.

Анализ для: С₁₃Н₉ NO₄

Рассчитано: С 64,20; Н 3,73; N 5,76

Обнаружено: С 63,98; Н 3,71; N 5,62

Пример 2

3-(5-Гидрокси-1,3-бензоксазол-2-ил)бензол-1,2-диол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 1, из 2,5-диметоксианилина и 2,3-диметоксибензойной кислоты. Продукт получают в виде желтовато-коричневого твердого вещества, т.пл. 239-241°С; МС m/e 244 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₉NO₄

Рассчитано: С 64,20; Н 3,73; N 5,76

Обнаружено: С 63,86; Н 3,90; N 5,74

Пример 3

2-(3-Фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 1, из 2,5-диметоксианилина и 3-фтор-4-метоксибензойной кислоты и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 262-268°С; МС m/e 244 (М-Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₈FNO₃

Рассчитано: С 63,68; Н 3,29; N 5,71

Обнаружено: С 64,01; Н 3,25; N 5,63

Пример 4

2-(3-хлор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 1, из 2,5-диметоксианилина и 3-хлор-4-метоксибензойной кислоты и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 254-256°С; МС m/e 260 (М-Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₈ClNO₃

Рассчитано: С 59,67; Н 3,08; N 5,35

Обнаружено: С 59,59; Н 3,02; N 5,25

Пример 5

2-(2-Хлор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 1, из 2,5-диметоксианилина и 2-хлор-4-метоксибензойной кислоты и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 253-255°С; МС m/e 262 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₈ClNO₃

Рассчитано: С 59,67; Н 3,08; N 5,35

Обнаружено: С 59,79; Н 2,87; N 5,36

Пример 6

2-(3-Фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-6-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 1, из 2,4-диметоксианилина и 3-фтор-4-метоксибензойной кислоты и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 269-271°С; МС m/e 244 (М-Н) ⁺.

Анализ для: С₁₇Н ₁₇NO₃

Рассчитано: С 63,68; Н 3,29; N 5,71

Обнаружено: С 63,53; Н 3,71; N 5,38

Пример 7

2-(3-трет-бутил-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-6-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 1, из 2,4-диметоксианилина и 3-трет-бутил-4-метоксибензойной кислоты и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 220-222°С; МС m/e 284 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₇Н ₁₇NO₃

Рассчитано: С 72,07; Н 6,05; N 4,94

Обнаружено: С 72,03; Н 6,43; N 4,72

Пример 8

2-(6-Гидрокси-1,3-бензоксазол-2-ил)бензол-1,4-диол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 1, из 2,4-диметоксианилина и 2,5-диметоксибензойной кислоты и получают в виде желтовато-коричневого твердого вещества, т.пл. 278-280°С; МС m/e 244 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₉NO₄

Рассчитано: С 64,20; Н 3,73; N 5,76

Обнаружено: С 64,09; Н 3,14; N 5,65

Пример 9

3-(6-Гидрокси-1,3-бензоксазол-2-ил)бензол-1,2-диол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 1, из 2,4-диметоксианилина и 2,3-диметоксибензойной кислоты и получают в виде желтовато-коричневого твердого вещества, т.пл. 256-258°С; МС m/e 244 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₉NO₄

Рассчитано: С 64,20; Н 3,73; N 5,76

Обнаружено: С 63,91; Н 3,98; N 5,72

Пример 10

4-(6-Гидрокси-1,3-бензоксазол-2-ил)бензол-1,2-диол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 1, из 2,4-диметоксианилина и 3,4-диметоксибензойной кислоты и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 282-284°С; МС m/e 242 (М-Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₉NO₄

Рассчитано: С 64,20; Н 3,73; N 5,76

Обнаружено: С 63,57; Н 3,68; N 5,63

Пример 11

2-(3-Хлор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-6-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 1, из 2,4-диметоксианилина и 3-хлор-4-метоксибензойной кислоты и получают в виде не совсем белого твердого вещества, т.пл. 254-256°С; МС m/e 262 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₉NO₄

Рассчитано: С 64,20; Н 3,73; N 5,76

Обнаружено: С 63,57; Н 3,68; N 5,63

Пример 12

2-(4-Гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 1, из 2,5-диметоксианилина и 4-метоксибензоилхлорида и получают в виде светло-желтого твердого вещества, т.пл. 264-267°С; МС m/e 228 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₉NO₃

Рассчитано: С 68,72; Н 3,99; N 6,16

Обнаружено: С 67,87; Н 4,05; N 6,23

Пример 13

4-(5-гидрокси-1,3-бензоксазол-2-ил)бензол-1,3-диол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 1, из 2,5-диметоксианилина и 2,4-диметоксибензойной кислоты и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. более чем 300°С; МС m/e 242 (М-Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₉NO₄

Рассчитано: С 64,20; Н 3,73; N 5,76

Обнаружено: С 63,92; Н 3,74; N 5,56

Пример 14

2-(4-Гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-6-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 1, из 2,4-диметоксианилина и 4-метоксибензоилхлорида и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. более чем 300°С; МС m/e 226 (М-Н)⁺ .

Анализ для: С₁₃Н ₉NO₃

Рассчитано: С 68,72; Н 3,99; N 6,16

Обнаружено: С 68,09; Н 4,01; N 6,05

Пример 15

4-(6-Гидрокси-1,3-бензоксазол-2-ил)бензол-1,3-диол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 1, из 2,4-диметоксианилина и 2,4-диметоксибензойной кислоты и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 293-296°С; МС m/e 242 (М-Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₉NO₄

Рассчитано: С 64,20; Н 3,73; N 5,76

Обнаружено: С 64,43; Н 3,77; N 5,74

Пример 16

6-Хлор-2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Стадия а) N-(4-Хлор-2,5-диметоксифенил)-3-фтор-4-метокси-бензамид.

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 1, стадия а, из 4-хлор-2,5-диметоксианилина и 3-фтор-4-метоксибензойной кислоты и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 197-199°С; МС m/e 340 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₆Н ₁₅ClFNO₄

Рассчитано: С 56,56; Н 4,45; N 4,12

Обнаружено: С 56,33; Н 4,35; N 4,05

Стадия b) N-(4-Хлор-2,5-дигидроксифенил)-3-фтор-4-гидроксибензамид.

Комплекс трифторида бора и диметилсульфида (70 мл) добавляют в смесь N-(4-хлор-2,5-диметоксифенил)-3-фтор-4-метоксибензамида (1,75 г, 5,15 ммоль) и CH₂Cl ₂ (35 мл). После перемешивания в течение 20 часов растворитель и избыток реагента выпаривают в потоке азота в вытяжном шкафу. Остаток забирают в смесь льда и HCl (1 н.) и экстрагируют EtOAc. Органический слой промывают HCl (1 н.) и сушат над MgSO ₄. Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (CH ₂Cl₂/гексаны/EtOAc 5/3/2 и АсОН 10 мл на 1 литр элюирующего растворителя) дают белое твердое вещество (1,4 г, выход 91%, т.пл. 254-256°С); МС m/e 296 (М-Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₉ClFNO₄

Рассчитано: С 52,46; Н 3,05; N 4,71

Обнаружено: С 51,98; Н 2,98; N 4,56

Стадия с) 6-Хлор-2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 1, стадия b, из N-(4-хлор-2,5-дигидроксифенил)-3-фтор-4-гидроксибензамида и гидрохлорида пиридина и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 258-260°С; МС m/e 278 (М-Н)⁺ .

Анализ для: С₁₃Н ₁₇ClFNO₃

Рассчитано: С 55,83; Н 2,52; N 5,01

Обнаружено: С 55,35; Н 2,59; N 4,91

Пример 17

6-Бром-2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 16, из 4-бром-2,5-диметоксианилина и 3-фтор-4-метоксибензойной кислоты и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 224-226°С; МС m/e 322 (М-Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₁₇BrFNO₃

Рассчитано: С 48,18; Н 2,18; N 4,32

Обнаружено: С 48,69; Н 2,36; N 4,59

Пример 18

6-Хлор-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 16, из 4-хлор-2,5-диметоксианилина и 4-метоксибензоилхлорида и получают в виде не совсем белого твердого вещества, т.пл. 260-262°С; МС m/e 260 (М-Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₈ClNO₃

Рассчитано: С 59,67; Н 3,08; N 5,35

Обнаружено: С 59,09; Н 3,06; N 5,11

Пример 19

5-Хлор-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-6-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 16, из 5-хлор-2,4-диметоксианилина и 4-метоксибензоилхлорида и получают в виде не совсем белого твердого вещества, т.пл. 254-256°С; МС m/e 262 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₈ClNO₃

Рассчитано: С 59,67; Н 3,08; N 5,35

Обнаружено: С 59,40; Н 2,97; N 5,22

Пример 20

7-Бром-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Стадия а) 2-Бром-4-метокси-6-нитрофенол.

Бром (16,0 г, 100 ммоль) в уксусной кислоте (20 мл) добавляют в смесь 4-метокси-2-нитрофенола (16,9 г, 100 ммоль), ацетата натрия (16,4 г, 200 ммоль) и уксусной кислоты (100 мл). Смесь перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре и затем при 70°С в течение 2 ч и выливают в воду (1,5 л), содержащую концентрированную серную кислоту (10 мл). Осажденное твердое вещество отфильтровывают и кристаллизуют из (хлороформ/гексаны), чтобы получить коричневатое твердое вещество, т.пл. 116-118°С; МС m/e 246 (М-Н)⁺.

Анализ для: С ₇Н₆BrNO₄

Рассчитано: С 33,90; Н 2,44; N 5,65

Обнаружено: С 34,64; Н 2,16; N 5,43

Стадия b) 2-Амино-6-бром-4-метоксифенол.

Ni Ренея (2,5 г) добавляют в раствор 2-бром-4-метокси-6-нитрофенола (8,8 г, 35,5 ммоль) в EtOAc (100 мл). Смесь встряхивают в аппарате Parr в атмосфере водорода 25 фунтов на кв. дюйм в течение 2,5 ч. Реакционную смесь фильтруют через целит и концентрируют в вакууме, чтобы получить серое твердое вещество (7,4 г, выход 96%, 95-97°С); МС m/e 218 (М+Н)⁺.

Анализ для: С₇Н₈ BrNO₂

Рассчитано: С 38,56; Н 3,70; N 6,42

Обнаружено: С 38,32; Н 3,77; N 6,24

Стадия с) 2-Бром-4-метокси-6-[(4-метоксибензоил)амино] фенил-4-метоксибензоат

Безводный пиридин (37,0 мл, 468,5 ммоль) добавляют по каплям в холодную (0^оС) смесь (механически перемешиваемую) 2-амино-6-бром-4-метоксифенола (20,0 г, 91,7 ммоль), 4-метоксибензоилхлорида (38,9 г, 229,0 ммоль) и CH ₂Cl₂ (250 мл). Во время добавления пиридина образуется осадок. Смесь перемешивают в течение 30 мин и затем добавляют простой этиловый эфир (250 мл). Осажденные твердые вещества отфильтровывают и промывают простым этиловым эфиром. Твердые вещества забирают в воду и перемешивают в течение 20 мин. Твердые вещества затем отфильтровывают и сушат, чтобы получить не совсем белое твердое вещество (42,5 г, выход 95%, т.пл. 73-75°С); МС m/e 484 (М-Н)⁺.

Анализ для: С₂₃Н₂₀ BrNO₆

Рассчитано: С 56,80; Н 4,15; N 2,88

Обнаружено: С 56,50; Н 3,78; N 2,83

Стадия d) 7-Бром-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазол

Путь а)

Суспензию 2-бром-4-метокси-6-[(4-метоксибензоил)амино]- фенил-4-метоксибензоата (42,0 г, 86,4 ммоль), моногидрата п-толуолсульфоновой кислоты (32,8 г, 172,8 ммоль) и безводного п-ксилола (800 мл) кипятят с обратным холодильником в течение 1 ч с непрерывным удалением воды (ловушка Dean-Stark). Первоначальная суспензия превращается в коричневый раствор при температуре кипячения с обратным холодильником. Смесь охлаждают до комнатной температуры и промывают NaOH (2 н.). Органический слой сушат над MgSO ₄. Выпаривание и кристаллизация из ацетона/простого этилового эфира дают не совсем белое твердое вещество (23,5 г, выход 82%, т.пл. 139-141°С); МС m/e 334 (М+Н)⁺ .

Анализ для: С₁₅Н ₁₂BrNO₃

Рассчитано: С 53,91; Н 3,62; N 4,19

Обнаружено: С 53,83; Н 3,37; N 4,01

Путь b)

Смесь 2-амино-6-бром-метоксифенола (100 мг, 0,46 ммоль), 4-метоксибензойной кислоты (77 мг, 0,5 ммоль) и борной кислоты (31 мг, 0,5 ммоль) в п-ксилоле (9 мл) кипятят с обратным холодильником в течение 24 ч, используя сепаратор воды Dean-Stark. Смесь охлаждают до комнатной температуры и концентрируют в вакууме. Остаточный продукт очищают флэш-хроматографией (30% EtOAc/петролейный эфир), чтобы получить светло-розовое твердое вещество (99 мг, выход 65%, т.пл. 136-138°С); МС m/e 334 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₅Н ₁₂BrNO₃

Рассчитано: С 53,91; Н 3,62; N 4,19

Обнаружено: С 53,78; Н 3,55; N 4,01

Стадия е) 7-Бром-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Путь а)

Трибромид бора (1 М, 89,9 мл, 89,8 ммоль) добавляют по каплям в холодную (-70°С) суспензию 7-бром-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазола (10,0 г, 29,94 ммоль) и CH₂Cl ₂ (50 мл). Смеси позволяют нагреться до комнатной температуры. Во время периода нагревания суспензия превращается в темный раствор. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 дней и затем выливают медленно в холодный (0°С) простой этиловый эфир (1000 мл). Метиловый спирт (200 мл) добавляют медленно к новой смеси в течение 20 мин периода. Смесь затем выливают в воду (1,5 л). Органический слой промывают три раза водой и сушат над MgSO₄. Выпаривание и кристаллизация из ацетона/простого этилового эфира/гексанов дают не совсем белое твердое вещество (8,4 г, выход 92%, т.пл. 298-299°С); МС m/e 306 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₃Н₈BrNO₃

Рассчитано: С 51,01; Н 2,63; N 4,58

Обнаружено: С 50,96; Н 2,30; N 4,42

Путь b)

Трибромид бора (0,25 мл, 2,7 ммоль) добавляют по каплям в холодную (-78°С) смесь 7-бром-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазола (130 мг, 0,39 ммоль) и дихлорметана (1,5 мл). Реакционной смеси позволяют постепенно дойти до комнатной температуры и перемешивают в течение 1 ч. Смесь выливают в лед и экстрагируют EtOAc. Органические экстракты промывают насыщенным раствором соли и сушат над MgSO ₄. Выпаривание и флэш-хроматография (30-40% EtOAc/петролейный эфир) дают (102 мг, выход 86%) продукт в виде светло-розового твердого вещества, т.пл. 295-298°С; МС m/e 304 (М-Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₈BrNO₃

Рассчитано: С 51,01; Н 2,63; N 4,58

Обнаружено: С 51,06; Н 2,77; N 4,36

Пример 21

7-Бром-2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Стадия а) 2-Бром-6-[(3-фтор-4-метоксибензоил)амино]-4-метоксифенил 3-фтор-4-метоксибензоат

Смесь 3-фтор-4-метоксибензойной кислоты (39,0 г, 229 ммоль), тионилхлорида (100 мл) и N,N-диметилформамида (0,5 мл) кипятят с обратным холодильником в течение 1 ч. Летучие вещества удаляют в вакууме. Твердые вещества забирают в бензол (дважды) и летучие вещества удаляют в вакууме. Остаток растворяют в CH₂Cl₂ (100 мл) и добавляют в холодную (0°С) смесь (механически перемешиваемую) 2-амино-6-бром-4-метоксифенола (20,0 г, 91,7 ммоль) и CH ₂Cl₂ (150 мл). Безводный пиридин (37,0 мл, 468,5 ммоль) добавляют по каплям в новую смесь. Во время добавления пиридина образуется осадок. Смесь перемешивают в течение 30 мин и затем добавляют простой этиловый эфир (250 мл). Осажденные твердые вещества отфильтровывают и промывают простым этиловым эфиром. Твердые вещества забирают в воду и перемешивают в течение 20 мин. Твердые вещества затем отфильтровывают и сушат, чтобы получить не совсем белое твердое вещество (46,5 г, выход 97%, т.пл. 184-186°С); МС m/e 520 (М-Н)⁺ .

Анализ для: С₂₃Н ₁₈BrF₂NO₆

Рассчитано: С 52,89; Н 3,47; N 2,68

Обнаружено: С 52,79; Н 3,23; N 2,63

Стадия b) 7-Бром-2-(3-фтор-4-метоксифенил)-5-метокси-1,3-бензоксазол

Суспензию 2-бром-6-[(3-фтор-4-метоксибензоил)амино]-4-метоксифенил 3-фтор-4-метоксибензоата (46,0 г, 88,1 ммоль), моногидрата п-толуолсульфоновой кислоты (33,5 г, 177,2 ммоль) и безводного п-ксилола (1 л) кипятят с обратным холодильником в течение 3 ч с непрерывным удалением воды (ловушка Dean-Stark). Первоначальная суспензия превращается в коричневый раствор при температуре кипячения с обратным холодильником. Твердые вещества отфильтровывают и промывают простым этиловым эфиром. Твердые вещества суспендируют в простом этиловом эфире (200 мл), перемешивают в течение 10 мин, отфильтровывают и сушат, чтобы получить желтовато-коричневое твердое вещество (25,1 г, т.пл. 175-177°С). Слой простого этилового эфира концентрируют до 20 мл и получают дополнительно 2,5 г продукта (общий выход 90%). МС m/e 352 (М+Н)⁺.

Анализ для: С₁₅Н₁₁BrFNO ₃

Рассчитано: С 51,16; Н 3,15; N 3,98

Обнаружено: С 51,10; Н 2,92; N 3,89

Стадия с) 7-Бром-2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 20, стадия е, и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 265-267°С, МС m/e 332 (М-Н)⁺.

Анализ для: С ₁₃Н₇BrFNO₃

Рассчитано: С 48,18; Н 2,18; N 4,32

Обнаружено: С 48,19; Н 2,29; N 4,19

Пример 22

7-Бром-2-(2-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Стадия а) 2-Фтор-4-метоксибензойная кислота

В теплую (55°С) смесь Ag₂O (13,5 г, 58,4 ммоль), NaOH (19,5 г, 487 ммоль) и воды (200 мл) добавляют 2-фтор-4-метоксибензальдегид (15 г, 97,4 ммоль). Смесь перемешивают в течение 1 ч, фильтруют и осажденные твердые вещества промывают горячей водой (10 мл). Фильтрат добавляют медленно в холодную (0°С) HCl (5 н.) с энергичным перемешиванием. Осажденное твердое вещество отфильтровывают, промывают водой и сушат, чтобы получить белое твердое вещество (13,6 г, выход 82%, т.пл. 194-196°С), МС m/e 169 (М-Н)⁺.

Анализ для: С ₈Н₇FO₃

Рассчитано: С 56,48; Н 4,15

Обнаружено: С 56,12; Н 4,12

Стадия b) 7-Бром-2-(2-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 21, из 2-фтор-4-метоксибензойной кислоты и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 248-250°С, МС m/e 324 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₃Н₇BrFNO₃

Рассчитано: С 48,18; Н 2,18; N 4,32

Обнаружено: С 47,89; Н 1,95; N 4,18

Пример 23

7-Бром-2-(2,3-дифтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Стадия а) Метил 2,3-дифтор-4-метоксибензоат

Иодметан (10,7 мл, 172,5 ммоль) добавляют в смесь 2,3-дифтор-4-гидроксибензойной кислоты (10,0 г, 57,5 ммоль), карбоната лития (12,7 г, 172,5 ммоль) и N,N-диметилформамида (100 мл). Смесь перемешивают при 40°С в течение 12 ч и затем выливают в воду и экстрагируют EtOAc. Органические экстракты сушат над MgSO₄ . Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (гексаны/EtOAc 5/1) дают белое твердое вещество (10,2 г, выход 88%, т.пл. 66-68°С); МС m/e 203 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₉Н₈F₂O ₃

Рассчитано: С 53,47; Н 3,99

Обнаружено: С 53,15; Н 3,83

Стадия b) 2,3-Дифтор-4-метоксибензойная кислота

Гидроксид натрия (2 н., 50 мл) добавляют в смесь метил 2,3-дифтор-4-метоксибензоата (10,0 г, 49,5 ммоль), ТГФ (100 мл) и МеОН (100 мл). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 ч и подкисляют HCl (2 н.), осажденное твердое вещество отфильтровывают, промывают водой и сушат, чтобы получить белое твердое вещество (8,9 г, выход 96%, т.пл. 194-196°С); МС m/e 187 (М-Н)⁺.

Анализ для: С ₈Н₆F₂O ₃

Рассчитано: С 51,08; Н 3,21

Обнаружено: С 50,83; Н 2,92

Стадия с) 7-Бром-2-(2,3-дифтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 21, из 2,3-дифтор-4-метоксибензойной кислоты и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 258-260°С, МС m/e 342 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₃Н₆BrF₂NO ₃

Рассчитано: С 45,64; Н 1,77; N 4,09

Обнаружено: С 45,33; Н 1,62; N 4,02

Пример 24

2-(3-Фтор-4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол

Путь а)

Стадия а) 7-Бром-5-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-2-(4-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-3-фторфенил)-1,3-бензоксазол.

трет-Бутил(хлор)диметилсилан (23,2 г, 154 ммоль) добавляют порциями в смесь 7-бром-2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ола (16,6 г, 51,4 ммоль), имидазола (17,5 г, 257 ммоль), N,N-диметилпиридин-4-амина (1,0 г, 8,1 ммоль) и ДМФ (300 мл). Смесь перемешивают в течение 3 ч, выливают в воду и экстрагируют простым этиловым эфиром. Органические экстракты сушат над MgSO₄. Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (гексаны/EtOAc 50/1) дают белое твердое вещество (27,5 г, выход 97%, т.пл. 98-99°С); МС m/e 552 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₂₅Н₃₅BrFNO₃ Si₂

Рассчитано: С 54,34; Н 6,38; N 2,53

Обнаружено: С 54,06; Н 6,52; N 2,24

Стадия b) 5-{[трет-Бутил(диметил)силил]окси}-2-(4-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-3-фторфенил)-7-винил-1,3-бензоксазол.

Дихлорбис(три-о-толилфосфин)палладий(II) (0,63 г, 0,79 ммоль) добавляют в смесь 7-бром-5-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-2-(4-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}- 3-фторфенил)-1,3-бензоксазола (14,7 г, 26,6 ммоль), трибутил(винил)олова (10,5 г, 33,25 ммоль) и п-ксилола (85 мл). Реакционную смесь перемешивают при 90°С в течение 24 ч, охлаждают до комнатной температуры, разбавляют простым этиловым эфиром (100 мл) и обрабатывают активированным углем. Смесь фильтруют через MgSO ₄ и концентрируют. Очистка флэш-хроматографией (гексаны/EtOAc 50/1) дает белое твердое вещество (11,8 г, выход 89%, т.пл. 93-95°С); МС m/e 500 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₂₇Н₃₈FNO₃Si ₂

Рассчитано: С 64,89; Н 7,66; N 2,80

Обнаружено: С 64,59; Н 7,70; N 2,73

Стадия с) 2-(3-Фтор-4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол

Фтороводородную кислоту (48 мас.% в воде, 1 мл) добавляют в раствор 5-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-2-(4-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-3-фторфенил)-7-винил-1,3-бензоксазола (1,5 г, 3,0 ммоль), ТГФ (6 мл) и ацетонитрила (3 мл). Реакционную смесь перемешивают при 65°С в течение 8 ч и затем выливают в воду. Осажденное твердое вещество отфильтровывают и сушат. Кристаллизация продукта из ацетона/простого этилового эфира дает белое твердое вещество (0,72 г, выход 81%, т.пл. 249-251°С); МС m/e 272 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₅Н₁₀FNO₃

Рассчитано: С 66,42; Н 3,72; N 5,16

Обнаружено: С 66,31; Н 3,85; N 4,96

Путь b)

2-(3-Фтор-4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол

Дихлорбис(три-о-толилфосфин)палладий(II) (0,87 г, 1,1 ммоль) добавляют в смесь 7-бром-2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ола (7,16 г, 22,1 ммоль), трибутил(винил)олова (10,5 г, 33,25 ммоль) и простого диэтилового эфира этиленгликоля (65 мл). Реакционную смесь перемешивают при 115°С в течение 48 ч, охлаждают до комнатной температуры и обрабатывают активированным углем. Смесь фильтруют через MgSO₄ и концентрируют. Очистка флэш-хроматографией на кислотном силикагеле (гексаны/EtOAc/CH ₂Cl₂ 1/1/1) дает белое твердое вещество (4,35 г, выход 72%, т.пл. 250-252°С); МС m/e 272 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₅Н ₁₀FNO₃

Рассчитано: С 66,42; Н 3,72; N 5,16

Обнаружено: С 66,03; Н 3,68; N 5,09

Путь с)

Стадия а) 4-[5-(Ацетилокси)-7-бром-1,3-бензоксазол-2-ил]-2-фторфенил ацетат.

Уксусный ангидрид (1,0 мл, 9,95 ммоль) добавляют в холодный (0°С) раствор 7-бром-2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ола (1,24 г, 3,8 ммоль), N,N-диметилпиридин-4-амина (1,1 г, 9,18 ммоль) и 1,4-диоксана (13 мл). Реакционной смеси позволяют нагреться до комнатной температуры и перемешивают в течение 20 ч. К реакционной смеси добавляют воду (50 мл), экстрагируют EtOAc и сушат над MgSO₄. Выпаривание и кристаллизация из EtOAc/гексанов дают не совсем белое твердое вещество (0,87 г, выход 56%); МС m/e 408 (М+Н)⁺.

Анализ для: С₁₇Н₁₁BrFNO ₅

Рассчитано: С 50,02; Н 2,72; N 3,43

Обнаружено: С 49,58; Н 2,59; N 3,37

Стадия b) 2-[4-(Ацетилокси)-3-фторфенил]-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ил ацетат.

Дихлорбис(три-о-толилфосфин)палладий(II) (46 мг, 0,06 ммоль) добавляют в смесь 4-[5-(ацетилокси)-7-бром-1,3-бензоксазол-2-ил]-2-фторфенил ацетата (0,8 г, 1,98 ммоль), трибутил(винил)олова (0,9 г, 2,8 ммоль) и п-ксилола (9 мл). Реакционную смесь перемешивают при 130°С в течение 5 ч, охлаждают до комнатной температуры, разбавляют простым этиловым эфиром (10 мл) и обрабатывают активированным углем. Смесь фильтруют через MgSO₄ и концентрируют. Очистка флэш-хроматографией (гексаны/EtOAc 5/1) дает белое твердое вещество (0,4 г, выход 56%, т.пл. 154-156°С); МС m/e 356 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₉Н₁₄FNO₅

Рассчитано: С 64,23; Н 3,97; N 3,94

Обнаружено: С 63,94; Н 3,78; N 3,76

Стадия с) 2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол.

Карбонат калия (55 мг) добавляют в раствор 2-[4-(ацетилокси)-3-фторфенил]-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ил ацетата (0,14 г, 0,39 ммоль) и 1,4-диоксана (3 мл). Смесь перемешивают при 90°С в течение 1 ч, выливают в воду, подкисляют HCl (2 н.) и экстрагируют EtOAc. Органические слои сушат над MgSO ₄. Выпаривание и кристаллизация из EtOAc/гексанов дают белое твердое вещество (0,06 г, выход 46%, т.пл. 250-252°С); МС m/e 272 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₅Н₁₀FNO₃

Рассчитано: С 66,42; Н 3,72; N 5,16

Обнаружено: С 66,32; Н 3,47; N 5,18

Пример 25

2-(2-фтор-4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол.

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 24, путь а), из 7-бром-2-(2-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ола и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 274-275°С; МС m/e 272 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₅Н₁₀FNO₃

Рассчитано: С 66,42; Н 3,72; N 5,16

Обнаружено: С 66,18; Н 3,47; N 4,97

Пример 26

2-(2,3-Дифтор-4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол.

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 24, путь b), из 7-бром-2-(2,3-дифтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ола и получают в виде не совсем белого твердого вещества, т.пл. 276-278°С; МС m/e 290 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₅Н₉F₂NO ₃

Рассчитано: С 62,29; Н 3,14; N 4,84

Обнаружено: С 61,90; Н 3,05; N 4,52

Пример 27

2-(4-Гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол.

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 24, путь b), из 7-бром-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ола и получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 249-250°С; МС m/e 254 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₅Н₁₁NO₃

Рассчитано: С 70,99; Н 4,39; N 5,52

Обнаружено: С 70,75; Н 4,34; N 5,46

Примеры 28 и 29

4-Бром-2-(3-Фтор-4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол (Пр. 28) и 4,6-Дибром-2-(3-Фтор-4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол (Пр. 29)

N-Бромсукцинимид (0,49 г, 2,77 ммоль) добавляют в смесь 2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ола (0,75 г, 2,77 ммоль) и ацетонитрила (30 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 ч, выливают в воду и экстрагируют EtOAc. Органические экстракты сушат над MgSO₄. Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (гексаны/EtOAc/CH₂Cl₂ 2/1/1) дает (а) в виде белого твердого вещества (0,45 г, т.пл. 226-228°С); МС m/e 349 (М+Н)⁺.

Анализ для: С₁₅Н₉ BrNO₃

Рассчитано: С 51,45; Н 2,59; N 4,00

Обнаружено: С 51,08; Н 2,40; N 3,90

и (b) в виде белого твердого вещества (0,18 г, т.пл. 272-274°С); МС m/e 428 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₅Н₈Br₂NO ₃

Рассчитано: С 41,99; Н 1,88; N 3,26

Обнаружено: С 42,25; Н 1,90; N 3,14

Пример 30

7-(1,2-Дибромэтил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол.

Стадия а) 5-Метокси-2-(4-метоксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол.

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 24, путь с), стадия b), из 7-бром-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазола и получают в виде белого твердого вещества, МС m/e 282 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₇Н ₁₅NO₃

Рассчитано: С 72,58; Н 5,37; N 4,98

Обнаружено: С 72,33; Н 5,26; N 4,72

Стадия b) 7-(1,2-Дибромэтил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол.

Трибромид бора (0,85 мл, 8,95 ммоль) добавляют по каплям в холодную (-78°С) смесь 5-метокси-2-(4-метоксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазола (0,31 г, 1,12 ммоль) и CH₂Cl ₂ (4 мл). Смеси позволяют нагреться до комнатной температуры. После перемешивания в течение 18 часов при комнатной температуре смесь медленно выливают в холодный (0°С) простой этиловый эфир (20 мл). Метиловый спирт (10 мл) затем медленно добавляют к новой смеси. Новую смесь промывают водой (три раза) и сушат над MgSO₄. Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (гексаны/EtOAc 3/1) дают светло-желтое твердое вещество (0,27 г, выход 59%, т.пл. 175-177°С); МС m/e 412 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₅Н ₁₁Br₂NO₃

Рассчитано: С 43,62; Н 2,68; N 3,39

Обнаружено: С 43,85; Н 2,44; N 3,33

Пример 31

7-(1-Бромвинил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол.

1,8-Диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен (0,25 г) 1,65 ммоль) добавляют в раствор 7-(1,2-дибромэтил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ола (0,4 г, 0,96 ммоль) и ацетонитрила (4 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение 24, выливают в холодную (0°С) HCl (1 н., 10 мл) и экстрагируют EtOAc. Органические экстракты сушат над MgSO₄. Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (СН₂Cl₂/гексаны/изопропиловый спирт 15/5/1) дают белое твердое вещество (185 мг, выход 58%, т.пл. 228-230°С); МС m/e 332 (М+Н)⁺ .

Анализ для: С₁₅Н ₁₀BrNO₃

Рассчитано: С 54,24; Н 3,03; N 4,22

Обнаружено: С 54,27; Н 2,94; N 4,20

Пример 32

7-(1-Бромвинил)-2-(2-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол.

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примерах 29-30, из 7-бром-2-(2-фтор-4-метоксифенил)-5-метокси-1,3-бензоксазола и получают как не совсем белое твердое вещество т.пл. 235-237°С; МС m/e 350 (М+Н)⁺. Анализ для: С ₁₅Н₉BrFNO₃

Рассчитано: С 51,45; Н 2,59; N 4,00

Обнаружено: С 51,63; Н 2,38; N 3,98

Пример 33

7-(1-Бромвинил)-2-(2,3-дифтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол.

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примерах 29-30, из 7-бром-2-(2,3-дифтор-4-метоксифенил)-5-метокси-1,3-бензоксазола и получают как не совсем белое твердое вещество, т.пл. 240-242°С; МС m/e 366 (М-Н)⁺.

Анализ для: С ₁₅Н₈BrF₂NO ₃

Рассчитано: С 48,94; Н 2,19; N 3,80

Обнаружено: С 49,63; Н 2,33; N 3,61

Пример 34

7-Аллил-2-(3-фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол.

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 24, путь с, стадия b, из 7-бром-2-(3-фтор-4-метоксифенил)-5-метокси-1,3-бензоксазола, аллилтрибутилолова и дихлорбис(три-о-толилфосфин)палладия с последующим деметилированием согласно примеру 20, стадия е. Желательный продукт получают в виде светло-розового твердого вещества, т.пл. 169-171°С; МС m/e 284 (М-Н)⁺.

Анализ для: С ₁₆Н₁₂FNO₃

Рассчитано: С 67,37; Н 4,24; N 4,91

Обнаружено: С 67,37; Н 4,16; N 4,66

Пример 35

7-Этинил-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол.

Тетракис(трифенилфосфин)палладий(0) (52 мг, 0,045 ммоль) добавляют в смесь 7-бром-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазола (0,3 г, 0,9 ммоль), иодида меди (I) (17,1 мг, 0,09 ммоль), этинил(триметил)силана (0,2 г мг, 2 ммоль) и триэтиламина (12 мл). Смеси перемешивают при 110°С в течение 4 часов, выливают в водный хлорид аммония и экстрагируют EtOAc/ТГФ (1/1). Органические экстракты сушат над MgSO₄. Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (гексаны/EtOAc 6/1) дают не совсем белое твердое вещество (0,27 г, выход 85%). Продукт растворяют в CH₂ Cl₂ (2 мл), охлаждают до -78 ^оС и добавляют по каплям трибромид бора (0,6 мл). Смеси позволяют нагреться до комнатной температуры. После перемешивания в течение 18 ч при комнатной температуре смесь медленно выливают в холодный (0°С) простой этиловый эфир (10 мл). Затем медленно добавляют в смесь метиловый спирт (3 мл). Новую смесь промывают водой (три раза) и сушат над MgSO₄. Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (гексаны/EtOAc 3/1) дают желтое твердое вещество (86 мг, выход 38%, т.пл. 229-231°С); МС m/e 252 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₅Н₉NO₃

Рассчитано: С 71,71; Н 3,61; N 5,58

Обнаружено: С 71,39; Н 3,49; N 5,32

Пример 36

2-(4-Гидроксифенил)-7-пропил-1,3-бензоксазол-5-ол.

Тетракис(трифенилфосфин)палладий(0) (70 мг, 0,06 ммоль) добавляют в смесь 7-бром-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазола (0,4 г, 1,2 ммоль), бром(пропил)цинка (0,5 М в ТГФ, 3,6 мл, 1,8 ммоль) и ТГФ (4 мл). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 48 ч, выливают в HCl (1 н.) и экстрагируют EtOAc. Органические экстракты сушат над MgSO₄. Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (гексаны/EtOAc 6/1) дают не совсем белое твердое вещество (0,14 г). Продукт растворяют в CH ₂Cl₂ (2 мл), охлаждают до -78°С и добавляют по каплям трибромид бора (0,35 мл). Смеси позволяют нагреться до комнатной температуры. После перемешивания в течение 18 ч при комнатной температуре смесь медленно выливают в холодный (0°С) простой этиловый эфир (10 мл). Затем медленно добавляют в смесь метиловый спирт (3 мл). Новую смесь промывают водой (три раза) и сушат над MgSO₄. Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (гексаны/EtOAc 4/1) дают белое твердое вещество (90 мг, выход 27%, т.пл. 110-112°С); МС m/e 270 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₆Н₁₅NO₃

Рассчитано: С 71,36; Н 5,61; N 5,20

Обнаружено: С 71,02; Н 5,58; N 4,94

Пример 37

7-Бутил-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол.

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 35, из 7-бром-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазола и бром(бутил)цинка. Желательный продукт получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 125-127°С; МС m/e 282 (М-Н) ⁺.

Анализ для: С₁₇Н ₁₇NO₃

Рассчитано: С 72,07; Н 6,05; N 4,94

Обнаружено: С 72,78; Н 5,87; N 4,69

Пример 38

7-Циклопентил-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол.

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 35, из 7-бром-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазола и бром(циклопентил)цинка. Желательный продукт получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 220-222°С; МС m/e 296 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₈Н ₁₇NO₃

Рассчитано: С 73,20; Н 5,80; N 4,74

Обнаружено: С 73,05; Н 5,74; N 4,59

Пример 39

Этил-5-гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-7-карбоксилат

Стадия а) 7-бром-5-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-2-(4-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}фенил)-1,3-бензоксазол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 24, путь а, стадия а, из 7-бром-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазола и трет-бутил(хлор)диметилсилана. Желательный продукт получают в виде белого твердого вещества, т.пл. 90-91°С; МС m/e 534 (М+Н)⁺.

Анализ для: С₂₅Н₃₆ BrNO₃Si₂

Рассчитано: С 56,16; Н 6,79; N 2,62

Обнаружено: С 55,66; Н 6,86; N 2,68

Стадия b) Этил-5-гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-7-карбоксилат

н-Бутиллитий (2,5 М, 0,3 мл, 0,75 ммоль) добавляют по каплям в холодный (0°С) раствор 7-бром-5-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-2-(4-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}- фенил)-1,3-бензоксазола (0,4 г, 0,75 ммоль) и ТГФ (4 мл). Смеси позволяют нагреться вплоть до 40°С и затем перемешивают в течение 2 ч. [(Цианокарбонил)окси]этан (84 мг) в ТГФ (1 мл) добавляют в реакционную смесь и позволяют ей нагреться вплоть до 0°С и перемешивают в течение 1 ч. Реакцию гасят водным хлоридом аммония, смесь экстрагируют EtOAc и сушат над MgSO ₄. Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (гексаны/ CH₂Cl₂/изопропиловый спирт 18/2/1) дают бесцветное масло (340 мг). Продукт растворяют в ТГФ (3,5 мл) и обрабатывают фторидом тетрабутиламмония (1 М в ТГФ, 1,4 мл). Смесь перемешивают в течение 30 мин, выливают в HCl (1 н.) и экстрагируют EtOAc. Органические экстракты сушат над MgSO₄. Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (гексаны/CH₂Cl₂/изопропиловый спирт 5/2/1) дают белое твердое вещество (119 мг, выход 53%, т.пл. 305-307°С), МС m/e 300 (М+Н)⁺ .

Анализ для: С₁₆Н ₁₃NO₅

Рассчитано: С 64,21; Н 4,38; N 4,68

Обнаружено: С 64,04; Н 4,43; N 4,40

Пример 40

2-(4-Гидроксифенил)-7-фенил-1,3-бензоксазол-5-ол

Стадия а) 5-Метокси-2-(4-метоксифенил)-7-фенил-1,3-бензоксазол

7-Бром-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазол (200 мг, 0,60 ммоль) и тетракис(трифенилфосфин)палладий(0) (63 мг, 0,03 ммоль) растворяют в толуоле (5 мл) и перемешивают в течение 10 мин при комнатной температуре в атмосфере азота. Добавляют бензолбороновую кислоту (110 мг, 0,90 ммоль) с последующим добавлением водного карбоната натрия (2 М, 1,5 мл) и этанола (2 мл). Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 12 ч, разбавляют водой и экстрагируют EtOAc. Органические экстракты сушат над MgSO ₄. Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (20%-40% EtOAc/простой петролейный эфир) дают указанное в заголовке соединение как светло-розовое твердое вещество т.пл. 92°С, МС m/e 332 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₂₁Н ₁₇NO₃

Рассчитано: С 76,12; Н 5,17; N 4,23

Обнаружено: С 75,86; Н 5,08; N 4,07

Стадия b) 2-(4-гидроксифенил)-7-фенил-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают согласно процедуре примера 20, стадия е (путь b), и получают в виде пурпурного твердого вещества, т.пл. 255-258°С, МС m/e 302 (М-Н) ⁺.

Анализ для: С₁₉Н ₁₃NO₃ х 0,25 Н₂ О

Рассчитано: С 74,14; Н 4,42; N 4,55

Обнаружено: С 73,81; Н 4,40; N 4,35

Пример 41

5-Гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-7-карбонитрил

Стадия а) 5-Метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазол-7-карбонитрил.

Раствор 7-бром-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазола (200 мг, 0,60 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (1,5 мл) перемешивают и нагревают до кипения с возвращением флегмы в атмосфере сухого азота с цианидом меди (I) (80 мг, 0,90 ммоль) в течение 4 ч. Смесь охлаждают и выливают в избыток водной этилендиаминтетрауксусной кислоты. Изоляция сырого продукта из (30% EtOAc/петролейный эфир) дает нитрил (164 мг, выход 98%) в виде желтовато-коричневых игольчатых кристаллов, т.пл. 180-183°С, МС m/e 281 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₆Н ₁₂N₂O₃ х 0,2Н ₂О

Рассчитано: С 66,84; Н 4,48; N 9,74

Обнаружено: С 66,63; Н 4,33; N 9,60

Стадия b) 5-Гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-7-карбонитрил

Указанное в заголовке соединение получают согласно процедуре примера 20, стадия е (путь b), и получают в виде светло-розового твердого вещества, т.пл. 297-303°С, МС m/e 253 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₄Н ₈N₂O₃ х 0,5Н ₂О

Рассчитано: С 64,37; Н 3,47; N 10,72

Обнаружено: С 64,44; Н 3,49; N 9,92

Пример 42

5-Гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-7-карбоксамид

Указанное в заголовке соединение изолируют как малый продукт из реакционной смеси примера 40, стадия b, в виде светлого желтовато-коричневого твердого вещества, т.пл. 325°С, МС m/e 271 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₄Н ₁₀N₂O₄ х 0,5Н ₂О

Рассчитано: С 60,22; Н 3,97; N 10,03

Обнаружено: С 59,71; Н 3,91; N 9,84

Пример 43

2-(4-Гидроксифенил)-7-метокси-1,3-бензоксазол-5-ол

Смесь 7-бром-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ола (100 мг, 0,33 ммоль) и бромида меди (I) (56 мг, 0,39 ммоль) в безводном N,N-диметилформамиде (1,5 мл) перемешивают со свежеприготовленным метоксидом натрия (15 мас.% в метаноле, 1 мл) и нагревают до 120°С в течение 4 ч. Смесь охлаждают и разбавляют HCl (1 н., 5 мл). Изоляция сырого продукта с этилацетатом с последующей флэш-хроматографией (40%-50% EtOAc/петролейный эфир) дает указанное в заголовке соединение в виде не совсем белого твердого вещества (50 мг, выход 60%, т.пл. 225-228°С), МС m/e 258 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₄Н ₁₁NO₄ х 0,75Н₂ О

Рассчитано: С 62,11; Н 4,65; N 5,17

Обнаружено: С 62,53; Н 4,73; N 5,02

Пример 44

7-Этил-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Стадия а) 7-этил-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазол.

н-Бутиллитий (2,5 н., 0,43 мл, 1,08 ммоль) добавляют по каплям в холодную (-78°С) смесь 7-бром-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазола (300 мг, 0,90 ммоль) и ТГФ (2 мл). Смесь перемешивают в течение 0,5 ч. В смесь добавляют по каплям иодэтан (0,14 мл, 1,8 ммоль). Реакционной смеси позволяют нагреться до комнатной температуры и перемешивают в течение 2 ч. Реакцию гасят водным хлоридом аммония, смесь выливают в воду и экстрагируют EtOAc. Органические экстракты промывают насыщенным раствором соли и сушат над MgSO ₄. Выпаривание и флэш-хроматография (20% EtOAc/петролейный эфир) дают (231 мг, выход 91%) продукт в виде светло-коричневого твердого вещества, т.пл. 85°С, МС m/e 284 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₇Н ₁₇NO₃ х 0,2Н₂ О

Рассчитано: С 70,28; Н 6,17; N 4,94

Обнаружено: С 70,12; Н 5,74; N 4,82

Стадия b) 7-Этил-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают согласно процедуре примера 20, стадия е, (путь b), и получают в виде светло-коричневого твердого вещества (выход 98%), т.пл. 110-115°С, МС m/e 256 (М+Н)⁺.

Пример 45

7-Этил-2-(2-этил-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Стадия а) 7-Этил-5-метокси-2-(2-этил-4-метоксифенил)-1,3-бензоксазол

Указанное в заголовке соединение получают согласно процедуре примера 43, стадия а, используя два эквивалента н-бутиллития, и сырой продукт используют непосредственно на следующей стадии.

Стадия b) 7-Этил-2-(2-этил-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают из 7-этил-5-метокси-2-(2-этил-4-метоксифенил)-1,3-бензоксазола, согласно процедуре примера 20, стадия е (путь b), и получают в виде серого твердого вещества (выход 87%), МС m/e 284 (М+Н) ⁺.

Пример 46

5-Гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-7-карбальдегид

Стадия а) 5-Метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазол-7-карбальдегид

Указанное в заголовке соединение получают согласно процедуре примера 43, стадия а, используя N-метилформанилид в качестве электрофила, чтобы получить светло-оранжевое твердое вещество (94%, т.пл. 153-155°С), МС m/e 284 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₆Н ₁₃NO₄

Рассчитано: С 67,84; Н 4,63; N 4,94

Обнаружено: С 67,58; Н 4,53; N 4,75

Стадия b) 5-Гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-7-карбальдегид

Указанное в заголовке соединение получают из 5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазол-7-карбальдегида согласно процедуре примера 20, стадия е (путь b), и получают как темно-желтое твердое вещество (выход 99%, т.пл. 273-275°С), МС m/e 256 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₄Н₉NO₄ х 0,25Н ₂О

Рассчитано: С 64,74; Н 3,69; N 5,39

Обнаружено: С 64,32; Н 3,59; N 5,18

Пример 47

7-(Гидроксиметил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Стадия а) 5-Метокси-7-(гидроксиметил)-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазол

Боргидрид натрия (66,8 мг, 1,76 ммоль) добавляют в раствор 5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазол-7-карбальдегида (250 мг, 0,88 ммоль) в безводном МеОН (8 мл) при 0°С. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин и затем выпаривают в вакууме. Остаток растворяют в простом диэтиловом эфире и промывают водой и насыщенным раствором соли, сушат MgSO₄ и фильтруют. Выпаривание и флэш-хроматография (50% EtOAc/петролейный эфир) дают (210 мг, 83%) продукт, который используют непосредственно в следующей реакции.

Стадия b) 7-(Гидроксиметил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают из 5-метокси-7-(гидроксиметил)-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазола согласно процедуре примера 20, стадия е (путь b), и получают в виде светло-коричневого твердого вещества, т.пл. 282°С, МС m/e 258 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₄Н₁₁NO₄ х 0,5Н₂О

Рассчитано: С 63,16; Н 4,54; N 5,26

Обнаружено: С 63,33; Н 4,36; N 5,04

Пример 48

7-(Бромметил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают согласно процедуре примера 20, стадия е (путь b), из 5-метокси-7-(гидроксиметил)-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазола с продолжительным перемешиванием в присутствии трибромида бора и получают в виде светло-коричневого твердого вещества, т.пл. 250-260°С, МС m/e 321 (М+Н)⁺.

Анализ для: С₁₄Н₁₀ BrNO₃

Рассчитано: С 52,52; Н 3,15; N 4,38

Обнаружено: С 52,26; Н 3,17; N 4,07

Пример 49

[5-Гидрокси-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-7-ил]ацетонирил

К раствору 7-(бромметил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ола (122 мг, 0,40 ммоль) в N,N-диметилформамиде (1,5 мл) добавляют простой 18-краун-6-эфир (202 мг, 0,80 ммоль) и цианид калия (131 мг, 2 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч и затем выливают в воду и экстрагируют EtOAc. Органические экстракты промывают насыщенным раствором соли и сушат над MgSO ₄. Выпаривание и флэш-хроматография (50%-60% EtOAc/петролейный эфир) дают (80 мг, выход 75%) продукт в виде серого твердого вещества, т.пл. 170-180°С, МС m/e 265 (М-Н) ⁺.

Анализ для: С₁₅Н ₁₀N₂O₃ х 1,5 Н₂О

Рассчитано: С 61,43; Н 4,47; N 9,55

Обнаружено: С 61,41; Н 4,21; N 9,19

Пример 50

7-(1-Гидрокси-1-метилэтил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол]

Стадия а) 2-[5-Метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазол-7-ил] пропан-2-ол

Указанное в заголовке соединение получают согласно процедуре примера 43, стадия а, из 7-бром-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазола, используя ацетон в качестве электрофила, чтобы получить белое твердое вещество (выход 78%, т.пл. 149°С), МС m/e 314 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₈Н ₁₉NO₄

Рассчитано: С 68,99; Н 6,11; N 4,47

Обнаружено: С 68,78; Н 6,13; N 4,35

Стадия b) 7-(1-Гидрокси-1-метилэтил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол]

Указанное в заголовке соединение получают из 2-[5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазол-7-ил]пропан-2-ола согласно процедуре примера 20, стадия е (путь b), и получают в виде темно-коричневого твердого вещества (выход 90%, т.пл. 180-185°С), МС m/e 286 (М+Н)⁺.

Анализ для: С₁₆Н₁₅ NO₄ х 0,5Н₂О

Рассчитано: С 65,30; Н 5,48; N 4,76

Обнаружено: С 65,03; Н 5,20; N 4,72

Пример 51

2-(4-Гидроксифенил)-7-изопропенил-1,3-бензоксазол-5-ол

Гидрохлорид пиридина (400 мг) нагревают до 190°С. К расплаву добавляют 2-[5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазол-7-ил]пропан-2-ол (114 мг, 0,36 ммоль) и реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч. Смесь охлаждают до комнатной температуры, растворяют в воде и экстрагируют EtOAc. Органические слои объединяют и промывают HCl (1 н.), водой, затем насыщенным раствором соли и сушат над MgSO₄. Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (50%-60% EtOAc/петролейный эфир) дают (40 мг, выход 41%) продукт в виде светлого красно-коричневого твердого вещества, т.пл. 225-228°С, МС m/e 268 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₆Н₁₃NO₃ х 0,5Н₂О

Рассчитано: С 69,56; Н 5,11; N 5,06

Обнаружено: С 69,46; Н 5,22; N 4,56

Пример 52

2-(4-Гидроксифенил)-7-изопропил-1,3-бензоксазол-5-ол]

2-(4-Гидроксифенил)-7-изопропенил-1,3-бензоксазол-5-ол (64 мг, 0,24 ммоль) растворяют в смеси EtOAc (5 мл) и абсолютного этанола (5 мл) и помещают в инертную атмосферу с аргоном. К этой смеси добавляют 10% Pd-С (25 мг). Раствор гидрируют в аппарате Parr при 25 фунтах на кв. дюйм в течение 3 ч. Раствор фильтруют через целит и промывают этанолом. Фильтрат концентрируют и остаток очищают флэш-хроматографией (50% EtOAc/петролейный эфир), чтобы получить (58 мг, выход 90%) продукт в виде желтовато-коричневого твердого вещества, т.пл. 200°С, МС m/e 270 (М+Н) ⁺.

Пример 53

7-Бром-2-(4-гидрокси-3-(трифторметил)фенил)-1,3-бензоксазол-5-ол.

Стадия а) 2-Бром-4-метокси-6-{[4-метокси-3-(трифторметил) бензоил]амино}фенил 4-метокси-3-(трифторметил)бензоат.

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 20, стадия с, из 2-амино-6-бром-4-метоксифенола и 4-метокси-3-трифторметил-бензоил-хлорида. Продукт получают как не совсем белое твердое вещество, т.пл. 205-208°С; МС m/e 622 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₂₅Н₁₈BrF₆NO ₆

Рассчитано: С 48,25; Н 2,92; N 2,25

Обнаружено: С 48,47; Н 2,76; N 2,16

Стадия b) 7-Бром-5-метокси-2-(4-метокси-3-(трифторметил)фенил)-1,3-бензоксазол.

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 20, стадия d (путь а), из 2-бром-4-метокси-6-{[4-метокси-3-(трифторметил)бензоил]амино} фенил 4-метокси-3-(трифторметил)бензоата и моногидрата п-толуолсульфоновой кислоты. Продукт получают как не совсем белое твердое вещество, т.пл. 183-185°С; МС m/e 402 (М+Н)⁺ .

Анализ для: С₁₆Н ₁₁BrF₃NO₃

Рассчитано: С 47,79; Н 2,76; N 3,48

Обнаружено: С 47,60; Н 2,50; N 3,37

Стадия с) 7-бром-2-(4-гидрокси-3-(трифторметил)фенил)-1,3-бензоксазол-5-ол.

Указанное в заголовке соединение получают согласно процедуре примера 20, стадия е (путь b), из 7-бром-5-метокси-2-(4-метокси-3-(трифторметил)фенил]-1,3-бензоксазола и получают как светло-желтое твердое вещество (выход 50%, т.пл. 200-210°С); МС m/e 372 (М-Н)⁺.

Анализ для: С₁₄Н₇ BrF₃NO₃ х 0,5 Н ₂О

Рассчитано: С 43,89; Н 2,10; N 3,65

Обнаружено: С 43,59; Н 2,04; N 3,6

Пример 54

7-(2-Фурил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Стадия а) 7-(2-Фурил)-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазол

7-Бром-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазол (300 мг, 0,90 ммоль) и дихлорбис(три-о-толилфосфин)палладий(II) (71 мг, 0,09 ммоль) растворяют в п-ксилоле (3 мл) и перемешивают в течение 10 мин при комнатной температуре а атмосфере азота. 2-(трибутилстаннил)фуран (449 мг, 1,26 ммоль) добавляют и смесь кипятят с обратным холодильником в течение 4 часов. Смесь охлаждают до комнатной температуры, разбавляют насыщенным раствором хлорида аммония и экстрагируют EtOAc. Органические экстракты промывают водой, затем насыщенным раствором соли и сушат над MgSO ₄ и концентрируют. Очистка флэш-хроматографией (20%-30% EtOAc/петролейный эфир) дает указанное в заголовке соединение в виде белого твердого вещества (выход 99%, т.пл. 120-121°С), МС m/e 322 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₉Н₁₅NO₄

Рассчитано: С 71,02; Н 4,71; N 4,36

Обнаружено: С 70,23; Н 4,7; N 4,19

Стадия b) 7-(2-Фурил)-2-(4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают согласно процедуре примера 50 и получают в виде светло-розового твердого вещества (выход 64%, т.пл. 283-287°С), МС m/e 294 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₇Н ₁₁NO₄

Рассчитано: С 69,62; Н 3,78; N 4,78

Обнаружено: С 69,11; Н 3,6; N 4,64

Пример 55

2-(3-Фтор-4-гидроксифенил)-7-(2-фурил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Стадия а) 2-(3-Фтор-4-метоксифенил)-7-(2-фурил)-5-метокси-1,3-бензоксазол.

Указанное в заголовке соединение получают согласно процедуре примера 53, стадия а, из 7-бром-5-метокси-2-(4-метокси-3-(трифторметил)фенил]-1,3-бензоксазола и получают в виде янтарно-желтых кристаллов (выход 73%, т.пл. 155°С), МС m/e 340 (М+Н)⁺.

Анализ для: С₁₉Н₁₄FNO ₄

Рассчитано: С 67,25; Н 4,16; N 4,13

Обнаружено: С 66,88; Н 3,97; N 4,04

Стадия b) 2-(3-Фтор-4-гидроксифенил)-7-(2-фурил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают согласно процедуре примера 50 из 2-(3-фтор-4-метоксифенил)-7-(2-фурил)-5-метокси-1,3-бензоксазола и получают в виде серого твердого вещества (выход 81%, т.пл. 245-250°С), МС m/e 312 (М+Н)⁺.

Анализ для: С₁₇Н₁₀ FNO₄ х 0,7 С₃Н ₆О

Рассчитано: С 65,04; Н 4,37; N 3,79

Обнаружено: С 64,84; Н 4,29; N 3,70

Пример 56

2-(4-Гидроксифенил)-7-тиен-2-ил-1,3-бензоксазол-5-ол.

Стадия а) 5-Метокси-2-(4-метоксифенил)-7-тиен-2-ил)-1,3-бензоксазол

Указанное в заголовке соединение получают согласно процедуре примера 53, стадия а, из 7-бром-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазола и 2-(трибутилстаннил)тиофена. Продукт получают как белое твердое вещество (выход 95%), т.пл. 95-100°С); МС m/e 338 (М+Н).

Стадия b) 2-(4-Гидроксифенил)-7-тиен-2-ил-1,3-бензоксазол-5-ол.

Указанное в заголовке соединение получают согласно процедуре примера 50 из 5-метокси-2-(4-метоксифенил)-7-тиен-2-ил)-1,3-бензоксазола и получают как серое твердое вещество (выход 80%), т.пл. 278-280°С); МС m/e 310 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₇Н₁₁NO₃S x 0,25 H₂O

Рассчитано: С 65,06; Н 3,69; N 4,46

Обнаружено: С 64,93; Н 3,84; N 4,21

Пример 57

2-(4-Гидроксифенил)-7-(1,3-тиазол-2-ил)-1,3-бензоксазол-5-ол.

Стадия а) 5-Метокси-2-(4-метоксифенил)-7-(1,3-тиазол-2-ил)-1,3-бензоксазол

Указанное в заголовке соединение получают согласно процедуре примера 53, стадия а, из 7-бром-5-метокси-2-(4-метоксифенил)-1,3-бензоксазола и 2-(трибутилстаннил)тиазола. Продукт получают как не совсем белое твердое вещество (выход 93%, т.пл. 132-136°С); МС m/e 339 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₈Н₁₄N₂O ₃S

Рассчитано: С 63,89; Н 4,17; N 8,28

Обнаружено: С 63,53; Н 3,94; N 8,15

Стадия b) 2-(4-Гидроксифенил)-7-(1,3-тиазол-2-ил)-1,3-бензоксазол-5-ол.

Указанное в заголовке соединение получают согласно процедуре примера 50 из 5-метокси-2-(4-метоксифенил)-7-(1,3-тиазол-2-ил)-1,3-бензоксазола и получают как желтое твердое вещество (выход 55%, т.пл. 245-255°С); МС m/e 311 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₆Н₁₀N₂O ₃S x 1,5 H₂O

Рассчитано: С 56,97; Н 3,88; N 8,30

Обнаружено: С 57,24; Н 3,95; N 7,50

Пример 58

2-(3-Фтор-4-гидроксифенил)-5-гидрокси-1,3-бензоксазол-7-карбонитрил

Указанное в заголовке соединение получают согласно процедуре примера 35 из 7-бром-2-(3-фтор-4-метоксифенил)-5-метокси-1,3-бензоксазола и цианида цинка. Продукт получают как белое твердое вещество, т.пл. 308-310°С; МС m/e 269 (М-Н)⁺ .

Анализ для: С₁₄Н ₇FN₂O₃ x 1,5 H₂O

Рассчитано: С 61,01; Н 2,77; N 10,16

Обнаружено: С 60,68; Н 2,46; N 9,77

Примеры 59 и 60

4-Бром-2-(4-гидроксифенил)-7-метокси-1,3-бензоксазол-5-ол (Пр.59)

4,6-Дибром-2-(4-гидроксифенил)-7-метокси-1,3-бензоксазол-5-ол (Пр.60)

Указанные в заголовке соединения получают согласно процедуре примера 28 из 2-(4-гидроксифенил)-7-метокси-1,3-бензоксазол-5-ола и N-бромсукцинимида. Продукт (а) получают как белое твердое вещество, т.пл. 246-248°С; МС m/e 336 (М+Н)⁺ .

Анализ для: С₁₄Н ₁₀BrNO₄ x 0,1 H₂ O

Рассчитано: С 49,49; Н 3,08; N 4,12

Обнаружено: С 49,28; Н 2,89; N 3,87

Продукт (b) получают как белое твердое вещество, т.пл. 260-262°С; МС m/e 414 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₄Н ₉Br₂NO₄

Рассчитано: С 40,52; Н 2,19; N 3,37

Обнаружено: С 40,21; Н 2,00; N 3,3

Пример 61

7-Бром-2-(3,5-дифтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 21, из 3,5-дифтор-4-метоксибензойной кислоты и 2-амино-6-бром-4-метоксифенола и получают как белое твердое вещество, т.пл. 270-272°С; МС m/e 340 (М-Н) ⁺.

Анализ для: С₁₃Н ₆BrF₂NO₃

Рассчитано: С 45,64; Н 1,77; N 4,09

Обнаружено: С 45,81; Н 1,73; N 3,89

Пример 62

2-(3,5-Дифтор-4-гидроксифенил)-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 24, путь b, из 7-бром-2-(3,5-дифтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ола и получают как белое твердое вещество, т.пл. 160-262°С; МС m/e 288 (М-Н)⁺.

Анализ для: С ₁₅Н₉F₂NO ₃ x 0,1 H₂O

Рассчитано: С 61,52; Н 3,23; N 4,78

Обнаружено: С 61,53; Н 3,10; N 4,72

Пример 63

7-Бром-2-(4-гидрокси-2-метилфенил)-1,3-бензоксазол-5-ол

Указанное в заголовке соединение получают, по существу, таким же образом, как описано в примере 21, из 4-метокси-2-метилбензойной кислоты и 2-амино-6-бром-4-метоксифенола и получают как светло-пурпурное твердое вещество, т.пл. 120-135°С; МС m/e 320 (М+Н) ⁺.

Анализ для: С₁₄Н ₁₀BrNO₃

Рассчитано: С 52,52; Н 3,15; N 4,38

Обнаружено: С 52,24; Н 2,97; N 4,15

Пример 64

2-(3-Фтор-4-гидроксифенил)-7-(1-фторвинил)-1,3-бензоксазол-5-ол.

Гидрофторид пиридина (1,14 мл) добавляют по каплям в холодный (0°С) раствор 2-[4-(ацетилокси)-3-фторфенил]-7-винил-1,3-бензоксазол-5-ил-ацетата (0,25 г, 0,7 ммоль) в сульфолане (3 мл). Реакционную смесь перемешивают в течение 5 мин и затем 1,3-дибром-5,5-диметилимидазолидин-2,4-дион (120 мг) добавляют одной порцией. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч, разбавляют HCl (1 н.) и экстрагируют EtOAc. Органический слой сушат над MgSO₄ . Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (СН ₂Cl₂/изопропиловый спирт 0,3%) дают 7-(2-бром-1-фторэтил)-2-(3-Фтор-4-гидроксифенил)-1,3-бензоксазол-5-ол в виде белого твердого вещества (0,25 г, т.пл. 185-186°С). Продукт забирают в ацетонитрил (2 мл) и добавляют 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен (150 мг). Реакционную смесь перемешивают в течение 24 ч, выливают в холодную (0°С) HCl (1 н., 10 мл) и экстрагируют EtOAc. Органические экстракты сушат над MgSO₄. Выпаривание и очистка флэш-хроматографией (20% EtOAc/гексаны) дают белое твердое вещество (160 мг, т.пл. 213-214°С); МС m/e 290 (М+Н)⁺.

Анализ для: С ₁₅Н₉BrF₂NO ₃ х 0,3 Н₂О

Рассчитано: С 61,15; Н 3,28; N 4,75

Обнаружено: С 60,84; Н 3,41; N 4,57