способ получения аллергена из клещей домашней пыли рода дерматофагоидес

Формула изобретения

Способ получения аллергена из клещей домашней пыли рода Дерматофагоидес, включающий водно-солевую экстракцию исходного сырья с применением экстрагирующей жидкости Эванс-Кока, культивирование клещей в течение 3-4 месяцев при температуре 25±2°С и относительной влажности воздуха 73±3% на субстрате из домашней пыли и щетине, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют смесь культуры клещей домашней пыли Дерматофагоидес фарина или Дерматофагоидес птерниссинус и среды их культивирования, включающие экскременты, линочные шкурки клещей и оставшийся пищевой субстрат, водно-солевую экстракцию исходного сырья проводят после смешивания и гомогенизирования его со стеклянным порошком в течение трех суток, причем экстрагируемый материал ежедневно встряхивают трижды по 30 мин с интервалом 1,5 ч, в интервалах между встряхиваниями экстрагируемый материал поддерживают при температуре от 2 до 10°С, после окончания экстрагирования надосадочную жидкость сливают и проводят центрифугирование при 5000-6000 об./мин в течение 30-40 мин с последующей фильтрацией через бумажный фильтр, осуществляют стерилизующую фильтрацию, стабилизацию маточного раствора в течение 3-4 месяцев, разлив и получение готовой формы препарата.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к фармакологии и медицине, конкретно к способу получения аллергена из клещей домашней пыли рода Дерматофагоидес - Дерматофагоидес фарина и Дерматофагоидес птерониссинус.

Известен способ получения аллергена из клещей домашней пыли рода Дерматофагоидес - Дерматофагоидес фарина и Дерматофагоидес птерониссинус, включающий водно-солевую экстракцию исходного сырья и обработку его формальдегидом, экстрагирование раствором гидрокарбоната аммония, центрифугирование в течение 45 мин, фильтрацию экстракта, проведение диализа в течение 52 ч при температуре 6±2°С, дважды по 24 ч против 0,002 М раствора гидрокарбоната аммония и один раз в течение 4 ч против дистиллированной воды, центрифугирование диализованного экстракта в течение 1 ч, фильтрацию его через бумажный фильтр, проведение лиофильного высушивания до остаточной влажности не более 4%, растворение сухого остатка в стерильных условиях в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,5, добавление 1%-ного раствора формальдегида, проведение стерилизующей фильтрации, выдерживание формалинизированного аллергоида в течение 32 суток при температуре 32°С с последующим проведением диализа при температуре 6±2°С против 0,1 М фосфатного буферного раствора с рН 7,5 до получения готовой формы аллергена для диагностики (RU 2265450, А61К 39/00, 2005 г.).

Наиболее близким является способ получения аллергена из клещей домашней пыли рода Дерматофагоидес - Дерматофагоидес фарина и Дерматофагоидес птерониссинус, включающий водно-солевую экстракцию исходного сырья с использованием экстрагирующей жидкости Эванс-Кока, культивирование клещей в течение 3-4 месяцев при 25±2°С и относительной влажности 73±3% на субстрате из домашней пыли и щетине (Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1987, №6, с.57-59).

Недостатком известных способов является сложность и длительность технологического процесса.

Техническим результатом изобретения является упрощение технологического процесса за счет исключения процесса обработки исходного сырья формальдегидом, экстрагирования гидрокарбонатом аммония, диализа, лиофильного высушивания и создание высокоэффективного лечебного аллергена.

Для достижения указанного технического результата в способе получения аллергена из клещей домашней пыли рода Дерматофагоидес, включающем водно-солевую экстракцию исходного сырья с применением экстрагирующей жидкости Эванс-Кока, культивирование клещей в течение 3-4 месяцев при 25±2°С и относительной влажности 73±3% на субстрате из домашней пыли и щетине, согласно изобретению в качестве исходного сырья используют смесь культуры клещей домашней пыли Дерматофагоидес фарина или Дерматофагоидес птерниссинус и среды их культивирования, включающие экскременты, линочные шкурки клещей и оставшийся пищевой субстрат, водно-солевую экстракцию исходного сырья проводят после смешивания и гомогенизирования его со стеклянным порошком в течение трех суток, причем экстрагируемый материал ежедневно встряхивают трижды по 30 минут с интервалом 1,5 часа, в интервалах между встряхиваниями экстрагируемый материал поддерживают при температуре от 2 до 10°С, после окончания экстрагирования надосадочную жидкость сливают и проводят центрифугирование при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 минут с последующей фильтрацией через бумажный фильтр, осуществляют стерилизующую фильтрацию, стабилизацию маточного раствора в течение 3-4 месяцев, разлив и получение готовой формы препарата.

Изобретение иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1. Для получения аллергена в качестве исходного сырья используют смесь культуры клещей домашней пыли Дерматофагоидес фарина и среды их культивирования, включающую экскременты, линочные шкурки клещей и оставшийся пищевой субстрат. Культура клещей находится в термостате 3-4 месяца. Все это время поддерживается постоянная температура 26±2°С и влажность воздуха 75±5%. Влажность воздуха определяется по показаниям гигрометра. Один раз в две недели необходимо контролировать показатели термометра и гигрометра, рыхлить субстрат, проводить аэрацию термостатов, проводить контроль видовой специфичности клещей. Микропрепараты готовят в жидкости Фора-Берлезе или молочной кислоте. Определение вида клещей осуществляется по таблицам, изложенным в «Методах обнаружения и определения аллергенных клещей домашней пыли» Е.В. Дубининой, Б.Д. Плетнева, Л., 1977. Стеклянный порошок, содержащий клещей и среду культивирования, в которую входят экскременты, личиночные шкурки клещей и другие компоненты помещают в ступку с целью измельчения и завязывают марлей с отверстием в центре.

В отверстие марли опускают пестик и в течение 30 минут растирают содержимое. В емкость с 6,0 литрами экстрагирующей жидкости Эванс-Кока через воронку пересыпают измельченную среду культивирования клещей. Содержимое бутыли перемешивают, исключая сильное встряхивание. На 30-40 минут бутыль оставляют при комнатной температуре, после чего контролируют значение рН. Далее бутыль с раствором аллергена помещают в холодильную камеру с температурой от 2 до 10°С.

В последующие трое суток до полного извлечения из субстрата гликопротеидных комплексов проводят следующий режим обработки: ежедневно бутыль с экстрагируемым материалом помещают на аппарат для встряхивания жидкостей в сосудах трижды по 30 минут с интервалом 1,5 часа. В интервалах между встряхиваниями бутыль с экстрагируемым материалом должна находиться при температуре от 2 до 10°С.

В конце рабочего дня ежедневно контролируют рН раствора и проводят коррекцию рН до значения 7,0±0,2 добавлением 0,1 моль/л раствора гидроокиси натрия или 0,1 моль/л раствора соляной кислоты. После окончания надосадочную жидкость сливают, проводя предварительную фильтрацию. Далее осуществляют центрифугирование на рефрижераторной центрифуге при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 минут с последующей фильтрацией через бумажный фильтр.

Проводят стерилизующую фильтрацию. В день проведения данной операции необходимо проконтролировать значение рН приготовленного аллергена.

Стабилизация маточного раствора

Стерильный раствор аллергена для стабилизации физических и биологических свойств выдерживают от 3 до 5 месяцев при температуре от 2 до 10°С. В тех случаях, когда содержание белкового азота в маточном растворе превышает 5000±2000 PNU/мл, маточный раствор аллергена в период стабилизации разводят стерильной экстрагирующей жидкостью до содержания единиц белкового азота 5000±200 PNU/мл.

После разлива маточного раствора аллергена получают готовую форму препарата.

Контроль свойств полученных препаратов проводили в соответствии с «Методическими указаниями первичной экспериментально-клинической апробации новых форм аллергенов».

Пример 2. Осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве исходного сырья используют смесь культуры клещей домашней пыли Дерматофагоидес птерниссинус и среды их культивирования.

Изучение свойств аллергенов из клещей домашней пыли Дерматофагоидес птерониссинус и Дерматофагоидес фарина

При проведении исследований клещевых аллергенов in vitro применяли сыворотку больных, чувствительных к бытовым аллергенам.

Больным исследуемой и контрольной групп ставили скарификационные пробы и определяли сывороточные иммуноглобулины. При проведении исследований были отобраны сыворотки с высоким содержанием IgE-AT (3-4 класса) и при постановке скарификационных проб у больных были 3-4 креста на аллерген.

Проводили сравнительное определение белкового азота и белка методами: Несслера, Биуретового и по связыванию красителя кумасси G-250. Было показано, что наиболее точные результаты дает метод определения белка по Бредфорду.

Изучение фракционного состава методом изоэлектрофокусирования показало наличие в аллергенных экстрактах 10-12 белковых фракций. Изоэлектрические точки расположены в интервале рН от 3,5 до 6,55 Дерматофагоидес птерониссинус и Дерматофагоидес фарина имеют одинаковые белковые компоненты и некоторые различия в области рН 5,25 до 6,0.

С целью определения качественного и количественного антигенного состава использовали методы ракетного и перекрестного иммуноэлектрофореза. Аллергены из клещей Дерматофагоидес птерониссинус и Дерматофагоидес фарина имеют близкий антигенный состав из 9-18 компонентов и близко по составу к Международному стандарту.

Изучение фракционного состава и определение молекулярной массы аллергенов с помощью электрофореза в ПААГ (полиакриламидный гель) с додецилсульфатом натрия показало, что аллергены состоят из 10-12 фракций с молекулярной массой 10-140 кД.

Изучение специфической активности фракций с помощью иммуноблотинга показало, что IgE связывались компоненты с молекулярной массой для Дерматофагоидес птерониссинус 25,18 кД, для Дерматофагоидес фарина 10,40 кД.

Определение взаимодействия с аллергоспецифическими IgE и IgG антителами аллергенов из клещей методом ИФА выявило высокую специфическую активность серий клещевых аллергенов в реакции торможения ИФА. Процент торможения связывания аллергенспецифических IgE для Дерматофагоидес птерониссинус 90%, для Дерматофагоидес фарина 88%. Процент торможения связывания аллергенонеспецифических IgG антител для Дерматофагоидес птерониссинус 60%, для Дерматофагоидес фарина 49%.

Проведено сравнительное изучение клещевых аллергенов Дерматофагоидес птерониссинус и Дерматофагоидес фарина методом ЭФП с использованием сенсибилизированных лимфоцитов. Изменение ЭФП лимфоцитов, сенсибилизированных клещевыми аллергенами Дерматофагоидес птерониссинус и Дерматофагоидес фарина с добавлением данных аллергенов, показало видовую специфичность аллергенов, а также общность их антигенных свойств. Определение изменения ЭФП лимфоцитов под воздействием аллергенов Дерматофагоидес птерониссинус и Дерматофагоидес фарина в различных разведениях выявило большую аллергенную активность аллергена из клещей Дерматофагоидес птерониссинус. Изучение изменения различных по ЭФП субпопуляций лимфоцитов под воздействием клещевых аллергенов показало, что лимфоциты различных субпопуляций обладают неодинаковой чувствительностью к клещевым аллергенам. Максимальную чувствительность обнаруживают лимфоциты с наибольшими значениями ЭФП - третья субпопуляция.