способ получения тимических пептидов

Формула изобретения

1. Способ получения тимических пептидов, предусматривающий измельчение иммунотропной ткани млекопитающих, содержащей пептиды с тимической активностью, из группы: тимус, селезенка, кожа, гомогенизацию, центрифугирование и фильтрацию с последующей очисткой и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что перед гомогенизацией производят троекратное замораживание и оттаивание ткани в смеси с дистиллированной водой в массовом соотношении 1:3, после гомогенизации осуществляют центрифугирование указанной смеси при 8000 об/мин в течение 30 мин и фильтрацию надосадочной жидкости с получением фильтрата, который осаждают 0,1-0,6 М сульфосалициловой кислотой и выделяют из фильтрата фракцию белка, выдерживают 30 мин, затем повторно центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 мин, отделяя надосадочную жидкость, которую осаждают 0,33% фосфорно-вольфрамовой кислотой, выдерживают в течение 60 мин, декантируют и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 мин, отделяют осадок, который суспендируют в дистиллированной воде, затем растворяют, добавляя насыщенный щелочной раствор до рН 9,0, а полученный раствор диализуют, осветвляют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 мин, полученную надосадочную жидкость подвергают адсорбционной хроматографии на гидроксиаппатите в водной системе, причем фракцию белка, не адсорбирующуюся на колонке, концентрируют гель-фильтрацией, отбирая белковую фракцию с молекулярной массой менее 10 кДа с последующей, в случае необходимости, лиофилизацией.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный раствор диализуют против проточной воды в течение 3-х суток и 2-х суток дистиллированной воды в холодильнике.

3. Способ по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что собранную белково-пептидную фракцию обессоливают, стандартизируют по концентрации белка и лиофильно сушат.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области получения иммуноактивных биологически активных добавок в форме белково-пептидных препаратов (препаратов тимических пептидов).

Известен способ получения из тимуса телят смеси иммунологически активных веществ (под названием "Тимозин"), заключающийся в гомогенизации ткани тимуса в 0,15 М растворе хлористого натрия, центрифугировании при 14000 g без предварительной инкубации гомогената, прогревании супернатанта до 80°С, удалении термоденатурирующих белков, осаждении ацетоном иммунологически активных веществ, высаливании сульфатом аммония, ультрафильтрации, хроматографировании на колонке с сефадексом G-25 и выделении конечного продукта "Тимозина" с мол. м. от 1200 до 14000 Да.

Однако этот способ трудоемок, дорогостоящий и не отличается экологической чистотой, т.к. требует использования большого количества ацетона - 5-кратный объем ацетона по отношению к объему гомогената (см. Goldestein A.L., Thurman G.B., Conen G.H., Hooper J.A. (Thymosin: chemistry, biology and clinicak applications) In: Biological activity of thymic hormones. Ed. by D.W Van Bekkum. Rotterdam - 1975, p.235-245).

Известен способ получения иммунологически активного препарата из тимуса телят "Тактивин", заключающийся в гомогенизации ткани тимуса в 0,15 М растворе хлористого натрия в соотношении 1 : 3, инкубации гомогената в течение 16 ч при +4°С (стадия аутолитической экстракции), центрифугировании в течение 1 ч при 2000g, фильтровании, нагревании до 80°С в течение 15 мин, удалении денатурирующих белков при 2000 g в течение 1 ч центрифугированием, осаждении ацетоном, центрифугировании при 2000 g в течение 30 мин, отмывке ацетоном, высушивании, растворении порошка в 10 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7,0, удалении нерастворимого осадка центрифугированием при 30000 g в течение 40 мин, высаливании сульфатом аммония, центрифугировании при 30000 g в течение 40 мин, закислении уксусной кислотой до рН 4,0 (трехкратное высаливание сульфатом аммония при различных значениях рН), ультрафильтрации, обессоливании на сефадексе G-15, хроматографировании на сефадексе G-50, выделении фракции с мол. м. 1000-6000 Да, обессоливании ее на сефадексе G-15, лиофилизации. В результате получают конечный продукт, проявляющий активность в количественном тесте в минимальной дозе 10 мкг (концентрация 10 мкг/мл) на 3·10 ⁶ клеток селезенки тимэктомированных мышей. Выход целевого продукта (белково-пептидная фракция) из 1 кг тимуса - 100 мг с мол. м. 1000-6000 дальтон, т.е. 0,01% /См. Арион В.Я. «Выделение, физико-химические свойства и биологическая активность Т-активина». В кн. «Итоги науки и техники» Сер. Иммунология. - М.: ВИНИТИ, 1982, т.10, с.45-53/.

Данный способ не является экологически чистым, т.к. требует применения большого количества ацетона для осаждения и отмывки препарата, длителен, трудоемок, высока себестоимость целевого продукта, не обеспечивается высокий выход активного материала (до 0,01% от исходного веса тимуса).

Наиболее близким способом к заявляемому изобретению по совокупности признаков является способ получения иммуностимулирующих полипептидов из сырья животного происхождения, при котором тимус северного оленя гомогенизируют в растворе хлористого натрия, подвергают аутолизу, центрифугируют, отделяют и нагревают надосадочную жидкость до 80°С, охлаждают, удаляют осадок, обрабатывают ацетоном, формируют преципитат, троекратно отмывают ацетоном, высушивают с последующим растворением в 0,01 М трис-HCl буфере, центрифугируют, проводят ультрафильтрацию, хроматографию на сефадексе с последующим сбором фракций, содержащих целевой продукт (белково-пептидная фракция), лиофилизируют, подвергают гельфильтрации, повторно лиофилизируют (SU 1737798, 1989).

Недостатками данного способа являются невысокая удельная активность и чистота получаемого препарата, сложность и высокая себестоимость процесса приготовления продукта, узость сырьевой базы из-за ограниченного диапазона пригодных исходных материалов.

Технической задачей изобретения является создание эффективного способа получения тимических пептидов (представляющих собой белково-пептидную фракцию) из иммунотропной ткани млекопитающих, содержащей пептиды с тимической активностью, из группы: тимус, селезенка, кожа, и расширение арсенала способов получения тимических пептидов.

Технический результат, обеспечивающий решение поставленной задачи, состоит в обеспечении высокой удельной активности и чистоты получаемого препарата, упрощении и удешевлении процесса приготовления продукта, расширение сырьевой базы за счет использования различных исходных материалов для медицинских и косметологических нужд.

Сущность изобретения состоит в том, что способ получения тимических пептидов предусматривает измельчение иммунотропной ткани млекопитающих, содержащей пептиды с тимической активностью из группы: тимус, селезенка, кожа, гомогенизацию, экстракцию с центрифугированием, очисткой и выделением белково-пептидной фракции в качестве целевого продукта, отличающийся тем, что перед гомогенизацией производят троекратное замораживание и оттаивание препарата в смеси с дистиллированной водой в массовом соотношении 1:3, производят гомогенизацию, центрифугирование указанной смеси и фильтрацию полученной при осаждении этой смеси надосадочной жидкости для получения экстракта, из последнего выделяют фракцию белка, растворимую в 0,1-0,6 М сульфосалициловой кислоте, и повторно центрифугируют, отделяя надосадочную жидкость, которую осаждают при 0,33% фосфорно-вольфрамовой кислоты, выдерживают при комнатной температуре, декантируют, центрифугируют и отделяют осадок, который суспензируют в дистиллированной воде, затем растворяют, добавляя насыщенный щелочной раствор, а полученный раствор диализируют, осветляют центрифугированием и отделяют надосадочную жидкость, которую подвергают адсорбционной хроматографии на гидроксилаппатите в водной системе, причем фракцию белка, не адсорбирующуюся на колонке, концентрируют и подвергают гель-фильтрации, выделяют и отбирают целевой продукт в виде белково-пептидной фракции с относительной молекулярной массой менее 10 кДа и лиофилизируют.

Предпочтительно надосадочную жидкость после осаждения при 0,33% фосфорно-вольфрамовой кислоты выдерживают при комнатной температуре в течение 60 минут, осадок суспензируют в минимальном количестве дистиллированной воды, после чего растворяют, добавляя при перемешивании по каплям насыщенный щелочной раствор и, контролируя при этом просветление раствора при рН-9,0, полученный раствор диализуют против проточной воды в течение 3-х суток и 2-х суток дистиллированной воды в холодильнике, центрифугирование осуществляют при 8000 об/мин в течение 30 минут, а собранную белково-пептидную фракцию обессоливают, стандартизируют по концентрации белка и лиофильно сушат.

Способ получения тимических пептидов реализуется следующим образом.

Очищенную иммунотропную ткань млекопитающих (преимущественно, сельскохозяйственных животных), содержащую пептиды с тимической активностью, из группы: тимус, селезенка, кожа, измельчают в мясорубке до консистенции фарша. Полученный фарш смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:3, троекратно замораживают и оттаивают.

Затем массу гомогенезируют и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость фильтруют через 4 слоя марли, получая экстракт.

Экстракт осаждают при 0,1-0,6 М сульфосалициловой кислоты, выдерживают при комнатной температуре в течение 60 минут и повторно центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 минут, отделяя надосадочную жидкость.

Надосадочную жидкость осаждают при 0,33% фосфорно-вольфрамовой кислоты (т.е. предпочтительно при 0,33% порошка сухой фосфорно-вольфрамовой кислоты от массы жидкости), смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 60 минут, декантируют (сливают жидкость с отстоявшегося осадка) и очередной раз центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 минут.

Осадок суспензируют в минимальном количестве дистиллированной воды, после чего суспензию растворяют перемешивая на магнитной мешалке, добавляя по каплям насыщенный щелочной раствор NaOH, контролируя при этом кислотность (рН) раствора. Осадок растворятся при рН 9,0 (т.е. раствор должен просветлеть при рН-9,0).

Полученный раствор диализуют (обессоливают) против проточной воды в течение 3-х суток и 2-х суток против дистиллированной воды в холодильнике, осветляют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 минут, отделяя надосадочная жидкость.

Надосадочную жидкость подвергают адсорбционной хроматографии на гидроксилаппатите в водной системе. Фракцию белка, не адсорбирующуюся на колонке, концентрируют.

Полученную белково-пептидную фракцию подвергают гель-фильтрации на сефадексе G-50, отбирают белковую фракцию с относительной молекулярной массой менее 10 кДа и лиофилизируют.

Гель-фильтрацию (во всех примерах) проводят на Sephadex G-50 medium (производство Швеции), предел эксклюзии которого 10 кДа (ZAO Amersham Biosciences) в условиях, рекомендованных фирмой-производителем. Для гель-фильтрации использовали колонку 50×600 (мм) фирмы Pharmacia fine chemicals (US) в системе 0,05М натрий-фосфатного буфера(рН 7,4) с добавлением 0,1 М NaCl.

Sephadex G-50 представляет собой реактив (порошок-гель), аппаратом является колонка и все необходимое для гель-фильтрации (коллектор, увикорд, перистальтический насос).

Молекулярную массу получаемой белково-пептидной фракции оценивают (во всех примерах) широко применяемым методом электрофореза в полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия и бета-меркаптоэтанола (Shapiro A.L. и др. "Molecule weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrilamide gels", Biochem. Biophys. Res. Commun., 1967, 28, pp.815-820). При электрофорезе в полиакриламидном геле применение додецилсульфата и бета-меркаптоэтанола обязательно.

Собранную белково-пептидную фракцию обессоливают на сефадексе G-10 и лиофильно сушат.

Технический результат достигается за счет осаждения неактивных компонентов сульфосалициловой кислотой и адсорбцией на гидроксилаппатите, а также полностью исключен ацетон, т.к. последний при реализации способа не используется. Получаемый заявляемым способом препарат имеет мол. м. менее 10000 Да и изоэлектрическую точку рН 4,5-6,5, содержит 4 главных компонента (окрашенные белково-пептидные зоны).

Получение препарата демонстрируется примерами.

Пример 1

Берут 1000 г ткани тимуса теленка.

Равномерно измельчают в мясорубке до консистенции фарша. Полученный фарш смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:3, троекратно замораживают и оттаивают.

Полученную массу гомогенезируют, центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 минут, отделяют и фильтруют над осад очную жидкость через 4 слоя марли, получая, таким образом, экстракт.

Экстракт осаждают при 0,1 М сульфосалициловой кислоты выдерживают при комнатной температуре в течение 60 минут и повторно центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 минут, отделяя надосадочную жидкость.

Надосадочную жидкость осаждают при 0,33% фосфорно-вольфрамовой кислоты, выдерживают при комнатной температуре в течение 60 минут, декантируют (сливают жидкость с отстоявшегося осадка) и очередной раз центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 минут.

Осадок суспензируют в минимальном количестве дистиллированной воды, после чего растворяют на магнитной мешалке, добавляя по каплям насыщенный раствор NaOH, контролируя при этом кислотность (рН) раствора. При рН 9,0 наблюдается просветление суспенцзии.

Полученный раствор диализуют (обессоливают) против проточной воды в течение 3-х суток и 2-х суток против дистиллированной воды в холодильнике, осветляют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 минут, отделяя надосадочную жидкость.

Надосадочную жидкость подвергают адсорбционной хроматографии на гидроксилаппатите в водной системе. Фракцию белка не адсорбирующуюся на колонке концентрируют.

Полученную белковую фракцию подвергают гель-фильтрации на сефадексе G-50, отбирают белково-пептидную фракцию с относительной молекулярной массой менее 10 кДа и лиофилизируют.

Собранную белково-пептидную фракцию обессоливают на сефадексе G-10 и лиофильно сушат. Получают 80 мг препарата.

Пример 2

Берут 1000 г ткани тимуса тюленя.

Равномерно измельчают в мясорубке до консистенции фарша. Полученный фарш смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:3, троекратно замораживают и оттаивают.

Затем массу гомогенезируют, центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 минут и фильтруют надосадочную жидкость через 4 слоя марли, получая экстракт.

Экстракт осаждают добавлением 0,25 М сульфосалициловой кислоты, выдерживают при комнатной температуре в течение 60 минут и повторно центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 минут, отделяя надосадочную жидкость.

Надосадочную жидкость осаждают при 0,33% фосфорно-вольфрамовой кислоты, выдерживают при комнатной температуре в течение 60 минут, декантируют и очередной раз центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 минут.

Осадок суспензируют в минимальном количестве дистиллированной воды, после чего солюбилизируют на магнитной мешалке, добавляя по каплям насыщенный раствор NaOH, контролируя при этом кислотность (рН) раствора. При рН 9,0 суспензия просветливает, то есть растворяется.

Полученный раствор диализуют против проточной воды в течение 3-х суток и 2-х суток дистиллированной воды в холодильнике, осветляют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 минут, получая надосадочную жидкость.

Надосадочную жидкость подвергают адсорбционной хроматографии на гидроксилаппатите в водной системе. Фракцию белка, не адсорбирующуюся на колонке, концентрируют.

Полученную белковую фракцию подвергают гель-фильтрации на сефадексе G-50, отбирают белково-пептидную фракцию с относительной молекулярной массой менее 10 кДа и лиофилизируют.

Собранную белково-пептидную фракцию обессоливают на сефадексе G-10 и лиофильно сушат. Получают 76 мг препарата.

Пример 3

Берут 1000 г ткани селезенки крупного рогатого скота.

Равномерно измельчают в мясорубке до консистенции фарша. Полученный фарш смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:3, троекратно замораживают и оттаивают.

Затем массу гомогенезируют, например, центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 минут и фильтруют надосадочную жидкость через 4 слоя марли, получая экстракт.

Экстракт осаждают при 0,45 М сульфосалициловой кислоты, выдерживают при комнатной температуре в течение 60 минут и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 минут.

Надосадочную жидкость осаждают добавлением 0,33% фосфорно-вольфрамовой кислоты, выдерживают при комнатной температуре в течение 60 минут, декантируют и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 минут.

Осадок суспензируют в минимальном количестве дистиллированной воды, после чего растворяют на магнитной мешалке, добавляя по каплям насыщенный раствор NaOH, контролируя при этом рН раствора. При рН 9,0 суспензия солюбилизируются, что характеризуется просветлением раствора.

Полученный раствор диализуют против проточной воды в течение 3-х суток и 2-х суток дистиллированной воды в холодильнике, осветляют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 минут.

Надосадочную жидкость подвергают адсорбционной хроматографии на гидроксилаппатите в водной системе. Фракцию белка, не адсорбирующуюся на колонке, концентрируют.

Полученную белковую фракцию подвергают гель-фильтрации на сефадексе G-50, отбирают белково-пептидную фракцию с относительной молекулярной массой менее 10 кДа и лиофилизируют.

Собранную белково-пептидную фракцию обессоливают на сефадексе G-10 и лиофильно сушат. Получают 86 мг препарата.

Пример 4

Берут 1000 г ткани кожи свиньи.

Равномерно измельчают ножницами и далее в мясорубке до консистенции фарша. Полученный фарш смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:3, троекратно замораживают и оттаивают.

После этого тканевую суспензию гомогенезируют и центрифугируют при 8000 об/мин и фильтруют надосадочную жидкость через 4 слоя марли, получая экстракт.

Экстракт осаждают при 0,6 М сульфосалициловой кислоты, выдерживают при комнатной температуре в течение 60 минут и повторно центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 минут, отделяя надосадочную жидкость.

Надосадочную жидкость осаждают при 0,33% фосфорно-вольфрамовой кислоты, выдерживают при комнатной температуре в течение 60 минут, декантируют и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 минут.

Полученный осадок суспензируют в минимальном количестве дистиллированной воды, после чего растворяют на магнитной мешалке, добавляя по каплям насыщенный раствор NaOH, контролируя при этом рН раствора. Суспензия растворяется при рН 9,0, то есть она должна просветлеть.

Полученный раствор диализуют против проточной воды в течение 3-х суток и 2-х суток против дистиллированной воды в холодильнике, после чего осветляют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 минут, получая надосадочную жидкость.

Надосадочную жидкость подвергают адсорбционной хроматографии на гидроксилаппатите в водной системе. Фракцию белка, не адсорбирующуюся на колонке, концентрируют.

Полученную белковую фракцию подвергают гель-фильтрации на сефадексе G-50, отбирают белково-пептидную фракцию с относительной молекулярной массой менее 10 кДа, и лиофилизируют.

Собранную белково-пептидную фракцию обессоливают на сефадексе G-10 и лиофильно сушат. Получают 62 мг препарата.

Исследование полученных препаратов проведено в соответствии с разделом «Методические указания по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ» (авторы Р.М.Хаитов, И.С.Гущин, Б.В.Пинегин, А.И.Зебрев), утвержденные Фармакологическим Государственным Комитетом (В кн.: «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ». - М., 2000, с.257-263).

Полученные препараты испытывали в опытах «in vivo» на лабораторных животных - самцах мышей межлинейных гибридов (СВА×C57BL6) F₁ в возрасте 10-12 недель со средней массой тела 18-20 г, полученных из питомника Столбовая. В каждом исследовании в группу входило по 10-12 мышей.

Препарат проверяли на биологическую активность двумя методами:

1. Определяли состояние гуморального иммунного ответа - количество антителообразующих клеток селезенкт мышей СВА на предмет первичного иммунного ответа (метод Ерне)

После введения препаратов, полученных согласно примерам 1-4, четырем группам мышей, этих мышей, а также интактных животных, иммунизировали внутрибрюшинно эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 5×10⁶, содержащейся в 0,5 мл. В качестве положительного и технического контроля использовали препарат ТАКТИВИНА (Биомед им.И.И.Мечникова) в концентрации 100 мкг/мл. Тестируемые образцы использовали в аналогичных концентрациях. На 4 сутки методом локального гемолиза в геле агарозы в селезенках мышей определяли количество АОК. В суспезиях клеток селезенки подсчитывали количество ядросодержащих клеток (ЯСК). Результаты выражали в виде среднего количества АОК в селезенках мышей каждой группы, в виде среднего количества АОК на 1 млн ЯСК и в виде индекса модуляции иммунного ответа по сравнению с показателями интактных, но иммунизированных ЭБ мышей.

Установлено достоверное повышение содержания АОК на селезенку у мышей опытных групп. Количество АОК составляет в данных группах 1096 и 1185, соответственно (р<0,05). В то время как в контрольной группе этот показатель равен 697.

2. Тестировали восстановление чувствительности фоновых розеткообразующих клеток селезенки тимэктомированных мышей и ингибирующему действию азатиоприна (метод Баха)

В качестве контроля использовали фармокопейный препарат ТАКТИВИНА (Биомед им.И.И.Мечникова) в концентрации 100 мкг/мл. Тестируемые образцы использовали в аналогичных концентрациях.

Мышь линии СВА иммунизировали 0,2 мл 15% взвеси эритроцитов барана внутрибрюшинно, на 5 сут животное забивали методом цервикальной дислокации шейных позвонков, выделяли селезенку и приготавливали взвесь спленоцитов. В группе контроля к 100 мкл проб взвеси клеток добавляли по 10 мкл физиологического раствора, в опытной группе - к 100 мкл проб добавляли по 10 мкл исследуемого препарата, полученного из тимуса теленка, разведенного в физиологическом растворе, в концентрации 10^-5 г/мл и инкубировали пробы 10-20 мин при температуре 36,5-37,0°С. Далее проводили постановку реакции определения числа розеткообразующих клеток. В контрольной группе количество розеткообразующих клеток находилось на уровне (43,65±2,21)×10⁶ / орган (в среднем 45%). Преинкубация клеток селезенки с исследуемым препаратом в концентрации 10^-5 г/мл приводила к увеличению количества розеткообразующих клеток до (32,30±3,11)×10 ⁶ / орган (в среднем 31%). Полученные данные указывают на наличие у этого препарата высокой иммунотропной активности.

Проведено сравнение активности иммунотропных препаратов прототипа и заявляемого способа по влиянию на В-систему иммунитета в тесте Ерне и Т-систему иммунитета в тесте восстановления чувствительности фоновых розеткообразующих клеток селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатипрона. Сравнение показало, что иммунотропные продукты, получаемые по заявляемому способу, активны в обоих методах: Ерне и азатиоприновом, в то время как вещества, получаемые по прототипу, активны лишь в методе Ерне. Иммунотропное вещество, полученное по прототипу, имеет максимальную активность при дозе 8-10 мкг/мышь, в то время как препараты, полученные по заявляемому способу, - при дозе 0,8-1 мкг/мышь.

В результате изобретения создан эффективный способ получения тимических пептидов из иммунотропной ткани млекопитающих, содержащей пептиды с тимической активностью, из группы: тимус, селезенка, кожа, и расширен арсенал способов получения тимических пептидов.

При этом обеспечены высокая удельная активность и чистота получаемого препарата, упрощение и удешевление процесса приготовления продукта, расширена сырьевая база за счет использования различных исходных материалов для медицинских и косметологических нужд.