способ выделения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев

Формула изобретения

Способ выделения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев, предусматривающий подготовку питательной среды, содержащей NaCl, MgSO₄·7H ₂O, KCl, CaCl₂·2Н ₂O, KNO₃, К₂ HPO₄·3Н₂O, автолизат дрожжей и дистиллированную воду, при следующем содержании компонентов, г/л:

NaCl	60,0
MgSO4·7H 2O	10,0
KCl	1,5
CaCl 2·2Н2O	2,0
KNO3	0,2
К2HPO 4·3Н2O	0,002
автолизат дрожжей	1,5
дистиллированная вода	до 1,0 л,

внесение в нее исследуемой пробы бентоса или воды, инкубацию проб, выделение чистой культуры жгутиконосцев с последующим, в случае необходимости, культивированием на среде того же состава и периодическим пересевом чистой культуры.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии, в частности к выделению галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев из водоемов с различной минерализацией, и может быть использовано при проведении цитологических, физиолого-биохимических и генетических исследований.

Предварительное наращивание биомассы галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев является необходимым этапом в изучении их видового состава в природных водоемах и для получения культуры, так как некоторые виды галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев, присутствующие в незначительном количестве в пробе, могут быть не учтены при микроскопическом исследовании.

Разработаны и активно используются способы выделения пресноводных гетеротрофных жгутиконосцев. Они основаны на добавлении в пробы воды синтетических сред (Пратта, Лозина-Лозинского и др.), создающих благоприятные условия для размножения гетеротрофных жгутиконосцев с дополнительным внесением бактерий определенных видов в качестве «подкормки» [Жуков Б.Ф. Атлас пресноводных гетеротрофных жгутиконосцев (биология, экология, систематика). - Рыбинск, 1993. - 160 с.].

Однако применение этих способов для изучения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев соленых водоемов ограничивается определенными трудностями: гибель негалотолерантных бактерий в условиях повышенной солености делает «подкормку» неэффективной; добавление синтетических сред приводит к значительному опреснению исходной пробы воды, что создает неблагоприятные условия для галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев, приспособленных к повышенной минерализации; скорость наращивания биомассы галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев в таких условиях очень низкая, что делает исследование довольно длительным.

Известен способ выделения и культивирования пресноводных и морских гетеротрофных жгутиконосцев на предварительно профильтрованной и стерилизованной природной воде [Cowling A.J. Free-living heterotrophic flagellates: methods of isolation and maintenance, including sources of strains in culture // The Biology of Free-living Heterotrophic Flagellates. (Ed.) Patterson D.J., Larsen J. - Oxford, 1991. - p.477-492].

Известный способ имеет ряд существенных недостатков, связанных с трудоемким многоэтапным методом предварительной подготовки: отбор воды, фильтрация через мембранный фильтр, автоклавирование. При большом количестве исследуемых водоемов с различной степенью минерализации этот способ значительно увеличивает количество применяемых вариантов сред и пролонгирует исследование. Другим значительным недостатком является непостоянство химического состава природной воды, который изменяется в зависимости от сезона года. Кроме того, этот способ не рассчитан на выделение гетеротрофных жгутиконосцев из местообитаний с экстремальной соленостью. Скорость размножения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев в воде высокоминерализованных водоемов довольно низка, что затрудняет получение большого выхода их биомассы.

Наиболее близким к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков является способ выделения и культивирования морских слабогалофильных жгутиконосцев с использованием среды Шмальца-Пратта: NaCl - 28,15 г; KCl - 0,67 г; MgCl₂×6H ₂O - 5,51 г; MgSO₄×7H ₂O - 6,92 г; CaCl₂×6Н ₂O - 1,45 г; KNO₃ - 0,025 г; К ₂HPO₄ - 0,013 г, дистиллированной воды до 1000 мл. Минерализация среды равна 36 . Среду разливают в чашки Петри и вносят образцы концентрированной или неконцентрированной воды из исследуемых водоемов. Для питания гетеротрофных жгутиконосцев необходимо добавлять какую-либо культуру живых или мертвых бактерий из видов Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Corynebacterium sp., Mycobacterium sp., Arthrobacter sp., Pseudomonas fluorescens и др. в зависимости от вида. Разные виды гетеротрофных жгутиконосцев имеют пищевые предпочтения по отношению к различным видам бактерий. Культивирование жгутиконосцев проводят при 25-28°С. Для контроля видового состава и состояния жгутиконосцев проводят микроскопическое исследование с использованием водной иммерсии и фазового контраста в динамике. Чистые культуры гетеротрофных жгутиконосцев получают с помощью микроманипулятора с микропипеткой. Полученные чистые культуры в дальнейшем культивируют на свежей среде Шмальца-Пратта с подкормкой определенным видом бактерий [Жуков Б.Ф., Мыльников А.П. Культивирование свободноживущих бесцветных жгутиконосцев из сооружений биологической очистки. // Протозоология. - Л.: Наука, 1983. Вып.8. - С.142-152] (прототип).

Недостатком прототипа, на взгляд авторов, является то, что минерализация среды Шмальца-Пратта равна 36 , что в 2-10 раз ниже, чем минерализация многих континентальных водоемов с повышенным содержанием солей. Поэтому на среде Шмальца-Пратта развиваются только слабогалофильные и галотолерантные виды гетеротрофных жгутиконосцев, адаптированные к морской среде (Cafeteria roenbergensis, Cafeteria marsupialis, Monosiga ovata, Pendulomonas adriperis, Bodo designis и др.), которые зачастую не являются доминирующими в галофильном биоценозе. В то же время представители галофильных видов (Pleurostomum salinum, Pleurostomum turgidum, Palustrimonas yorkeensis и др.) погибают на среде Шмальца-Пратта в связи с их неприспособленностью к низкой минерализации. Это объясняется узким диапазоном их галотолерантности, не соответствующим минерализации среды Шмальца-Пратта.

Также недостатком данного способа является то, что для длительного культивирования галофильных и гетеротрофных жгутиконосцев их необходимо регулярно подкармливать, так как бактерии быстро «выедаются» галофильными и галотолерантными гетеротрофными жгутиконосцами. А обычно используемые для подкормки бактерии не являются характерными для микрофлоры соленых водоемов и поэтому практически не размножаются. А многие галофильные и галотолерантные гетеротрофные жгутиконосцы, в свою очередь, не приспособлены употреблять их в пищу.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в сокращении трудоемкости и повышении эффективности выделения из планктонных и бентосных проб минерализованных водоемов галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев, что выражается в увеличении количества обнаруживаемых видов в пробе и в возрастании скорости их размножения.

Для достижения названного технического результата в заявляемом способе осуществляют подготовку питательной среды, содержащей NaCl, MgSO₄×7H ₂O, KCl, CaCl₂×2Н ₂O, KNO₃, К₂ НРО₄×3Н₂O, автолизат дрожжей и дистиллированную воду при следующем содержании компонентов, г/л:

NaCl	60,0
MgSO4×7H 2O	10,0
KCl	1,5
CaCl 2×2Н2O	2,0
KNO3	0,2
К2НРО 4×3Н2O	0,002
Автолизат дрожжей	1,5

Дистиллированная вода до 1,0 л, внесение в нее исследуемой пробы бентоса или воды, инкубацию проб, выделение чистой культуры жгутиконосцев с последующим, в случае необходимости, культивированием на среде того же состава и периодическим пересевом чистой культуры.

В предлагаемом способе в качестве основы питательной среды используются осмотически активные соли: хлорид натрия, сульфат магния, хлорид калия и хлорид кальция, входящие в состав наиболее широко используемых сред для галофильных микроорганизмов [Масюк Н.П. Морфология, систематика, экология, географическое распространение рода Dunaliella Teod. и перспективы его практического использования. - Киев: Наукова думка, 1973. - 244 с]. В результате минерализация среды, составляющая 68 , является оптимальной для большинства умеренно галофильных видов микроорганизмов, обитающих при 3-15% содержания солей, и галотолерантных видов, устойчивых к широкому диапазону солености. Используются простые доступные соли MgSO₄ ×7H₂O, KNO₃, К₂НРО₄×3Н ₂O, которые обычно входят в состав минеральных сред и являются источником биогенных элементов.

Автолизат дрожжей вносится при приготовлении среды в количестве 1,5 г на 1 л жидкой среды. Автолизат дрожжей является основным питательным субстратом, содержит азотистые вещества и ряд ферментов, обеспечивает интенсивный рост бактерий [Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. / Под ред. М.О.Биргера. - М.: Медицина, 1982. - 464 с.].

Авторами экспериментально установлено, что добавление в минеральную среду автолизата дрожжей способствует активному размножению бактерий, которые изначально присутствовали в природной воде. Численность бактерий в среде через сутки достигает 10⁸-10⁹ КОЕ/мл. Галофильные и галотолерантные гетеротрофные жгутиконосцы при обилии пищи размножаются с высокой скоростью, и исключается необходимость в дополнительной подкормке аллохтонными бактериями.

Соли и автолизат дрожжей смешивают и растворяют в дистиллированной воде. Затем питательную среду стерилизуют путем автоклавирования в течение 15 минут при температуре 121°С (1,1 атм).

В приготовленную питательную среду, разлитую в стерильные чашки, вносят исследуемые образцы. Достоинством предлагаемого способа является возможность исследования как планктонных, так и бентосных проб (ил, грунт), отобранных из природных водоемов. Инкубацию образцов проводят в термостате при оптимальной температуре 25-28°С, используемой для наращивания биомассы при выделении гетеротрофных жгутиконосцев из природных водоемов [Жуков Б.Ф., Мыльников А.П. Культивирование свобод-ноживущих бесцветных жгутиконосцев из сооружений биологической очистки. // Протозоология. - Л.: Наука, 1983. Вып.8. - С.142-152].

За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдают в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента внесения проб в среду.

Периодически проводят выделение чистых культур галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев методом получения клонов с помощью микроманипулятора с микропипеткой или методом серийных разведений. В последующем выделенные чистые культуры культивируются в лабораторных условиях и могут использоваться для наращивания биомассы, изучения физиологических свойств и ультраструктуры, экспериментальных исследований, определения систематического положения и т.д.

Для роста чистых культур галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев полученные с помощью микроманипулятора с микропипеткой или методом серийных разведений отдельные клетки помещают в чашки Петри с жидкой питательной средой того же состава. Инкубацию проводят в термостате при оптимальной температуре 25-28°С. За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдают в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента внесения проб в среду. В дальнейшем для каждой культуры галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев подбирается оптимальный режим пересева 1-2 раза в месяц. Пересев осуществляется путем внесения образца выросшей культуры галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев объемом 1 мл в свежую жидкую питательную среду того же состава объемом 15 мл.

При пересевах культуры галофильных и галотолерантных жгутиконосцев не очищаются от сопровождающих их автохтонных галофильных бактерий, которые интенсивно размножаются в свежей культуральной среде. Это приводит к тому, что культивируемые галофильные и галотолерантные гетеротрофные жгутиконосцы, питающиеся сопутствующими бактериями, в короткие сроки (2-3 суток) достигают максимальной численности (10⁵-10 ⁶ клеток/мл). Отсутствие дополнительной подкормки бактериями является одним из преимуществ предлагаемого способа.

Для осуществления способа используются минеральные соли марки «хч» отечественного или импортного производства и автолизат пекарных дрожжей производства ГНЦ прикладной микробиологии МЗ РФ (Отделение «Питательные среды», г.Оболенск).

Авторами были проведены исследования, позволившие оценить эффективность предлагаемого способа по сравнению со способом-прототипом. В озере Тузлучное (Оренбургская область) с минерализацией воды 100 выделяли галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев для определения их биологического разнообразия. Неконцентрированные и концентрированные пробы воды объемом по 5 мл были посеяны на питательные среды, приготовленные согласно предлагаемому способу и способу-прототипу. Концентрирование проб воды осуществляли путем фильтрования их через мембранный фильтр.

В результате использования предлагаемого способа на второй день инкубации в неконцентрированной пробе воды из озера было обнаружено 6 видов галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев (табл.). На пятый день они достигли большой численности и были использованы для получения чистых культур с применением микроманипулятора с микропипеткой. Достоверные результаты получены на второй день инкубации даже без предварительного концентрирования пробы воды.

Согласно способу-прототипу выделение галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев осуществляли также в двух вариантах - без предварительного концентрирования пробы воды и с ее концентрированием.

В неконцентрированной пробе воды на второй день наблюдения обнаружены только единичные клетки Percolomonas cosmopolitus, а на пятые сутки появились еще 2 вида галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев.

В концентрированной пробе воды на второй день наблюдения обнаружены 3 вида галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев, а на пятый день - 6 видов.

В отличие от предлагаемого способа способ-прототип позволил выявить 6 видов галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев на пятый день наблюдения, причем только в концентрированной пробе. Галофильные и галотолерантные гетеротрофные жгутиконосцы достигали большей численности в среде заявляемого состава по сравнению со средой Шмальца-Пратта (способ-прототип).

Из исследуемых проб с помощью микроманипулятора был выделен в чистой культуре один вид галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев - Percolomonas cosmopolites. Выделенные отдельные клетки Percolomonas cosmopolites поместили в чашку Петри со свежей жидкой питательной средой заявляемого состава объемом 15 мл. Инкубацию проводили в термостате при температуре 25°С, за развитием наблюдали в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней с момента внесения пробы в среду.

Рост Percolomonas cosmopolites после инокуляции в среду отмечался на 3 сутки, максимальной численности достигал на 6 сутки, затем численность начинала плавно снижаться. При использовании среды заявляемого состава Percolomonas cosmopolites сохранял свою жизнеспособность в течение 1 месяца. Для поддержания культуры Percolomonas cosmopolites в лабораторных условиях пересев производили 1 раз в 14 дней. С использованием этого режима пересева культура успешно сохраняется в лаборатории в течение 24 месяцев.

При использовании для культивирования выделенной культуры Percolomonas cosmopolites среды Шмальца-Пратта (согласно способу-прототипу) их рост начинался на 5 сутки, к 8 суткам численность достигала максимального значения, которое было значительно меньше, чем при использовании для культивирования среды заявляемого состава. После 8 суток наблюдалось резкое падение численности галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев. Percolomonas cosmopolitus сохранялся в активном состоянии на среде Шмальца-Пратта менее двух недель.

Таким образом, заявляемый способ выделения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев позволяет сократить сроки выделения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев из водоемов с различной минерализацией, повысить эффективность оценки их биоразнообразия, сократить трудоемкость и сроки культивирования галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев.

Способ осуществляется следующим образом.

1) Готовят жидкую питательную среду следующего состава, г/л:

NaCl	60,0
MgSO4×7H2O	10,0
KCl	1,5
CaCl2×2Н 2O	2,0
KNO3	0,2
К2НРО4 ×3Н2O	0,002
Автолизат дрожжей	1,5
Дистиллированная вода	до 1,0 л

Минерализация среды 68 .

Соли и автолизат дрожжей смешивают и растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют путем автоклавирования в течение 15 минут при температуре 121°С (1,1 атм).

2) Затем в приготовленную жидкую питательную среду, разлитую объемом 10 мл в стерильные чашки Петри диаметром 9,5 см, вносят образцы исследуемой природной воды объемом 5 мл или бентоса (грунт, ил) объемом 0,5 мл.

3) Инкубацию засеянных проб проводят в термостате при оптимальной температуре 25-28°С. За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдают в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента внесения проб в среду.

4) Периодически проводят выделение чистых культур галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев методом получения клонов с помощью микроманипулятора с микропипеткой или методом серийных разведений. Полученные отдельные клетки галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев помещают в чашку Петри диаметром 9,5 см со свежей жидкой питательной средой того же состава объемом 15 мл.

5) Инкубацию проводят в термостате при оптимальной температуре 25-28°С. За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдают в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента внесения проб в среду.

6) В случае необходимости дальнейшего поддержания полученных чистых культур галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев в лабораторных условиях используют приготовленную жидкую питательную среду вышеуказанного состава. Периодически (1-2 раза в месяц) производят пересев жгутиконосцев путем добавления 1 мл старой культуры в чашку Петри со свежей питательной средой объемом 15 мл.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1

В гипергалинном озере Развал (Оренбургская область) с минерализацией воды 300 необходимо оценить видовой состав галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев и получить их в чистой культуре. С этой целью отобраны пробы природной рапы 30 сентября 2004 г.

Для выделения галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев из образца воды использовали жидкую питательную среду. Для ее приготовления были отвешены минеральные соли: NaCl - 60 г; MgSO₄×7H₂ O - 10 г; KCl - 1,5 г; CaCl₂×2Н ₂O - 2,0 г; KNO₃ - 0,2 г; К ₂НРО₄×3Н₂ 0 - 0,002 г. Соли смешивали и растворяли в дистиллированной воде, доводя конечный объем до 1 л. Таким образом, общая минерализация среды составила 68 . Затем в среду добавляли автолизат пекарских дрожжей в количестве 1,5 г/л. После тщательного перемешивания и растворения всех компонентов среду разливали в стерильные флаконы и стерилизовали путем автоклавирования в течение 15 минут при температуре 121°С (1,1 атм).

Проба рапы объемом 5 мл была внесена в чашку Петри с приготовленной средой объемом 10 мл. Инкубацию проб проводили в термостате при температуре 25°С. За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдали в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента внесения проб в среду.

Через 2 суток инкубации в среде отмечено массовое развитие Macropharyngomonas halophila.

С помощью микроманипулятора Macropharyngomonas halophila был выделен в чистой культуре. Полученную культуру помещали в чашку Петри со свежей жидкой питательной средой того же состава объемом 15 мл и инкубировали при температуре 25°С. Рост Macropharyngomonas halophila после инокуляции в среду отмечался на 3 сутки, максимальной численности достигал на 7 сутки, затем численность начинала плавно снижаться. При использовании среды заявляемого состава Macropharyngomonas halophila сохранял свою жизнеспособность в течение более 2 месяцев. Для поддержания культуры Macropharyngomonas halophila в лабораторных условиях пересев производили 1 раз в месяц путем добавления 1 мл культуры в чашку Петри со свежей питательной средой объемом 15 мл. С использованием этого режима пересева культура успешно сохраняется в лаборатории в течение 24 месяцев.

Пример 2

Из озера Дунино (Оренбургская область) с минерализацией воды 150 были отобраны образцы грунта для определения видового состава галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев. Комочки грунта объемом 5 мл вносили в жидкую питательную среду, приготовленную аналогично примеру 1, и инкубировали в термостате при температуре 28°С. За развитием галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев наблюдали в динамике с использованием световой фазово-контрастной микроскопии с водной иммерсией в течение 30 дней от момента посева.

Через три дня появились единичные клетки Rhynchomonas nasuta, Percolomonas cosmopolitus, а через неделю инкубации в среде отмечено их массовое развитие.

Для изучения биологических свойств Rhynchomonas nasuta он был выделен в чистой культуре и в дальнейшем культивировался аналогично примеру 1.

Пример 3.

Из грязе-рапного озера Тузлучное (Оренбургская область) с минерализацией воды 100 для определения биологического разнообразия галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев были взяты пробы ила. Образцы ила объемом 5 мл вносили в жидкую питательную среду, приготовленную аналогично примеру 1, и инкубировали в термостате при температуре 26°С, а затем пробы наблюдали в динамике, что позволило к 6-м суткам выявить 5 видов: Caecitellus parvulus, Cafeteria roenbergensis, Monosiga ovata, Bodo sp., Percolomonas cosmopolitus. К 10 суткам численность галофильных и галотолерантных гетеротрофных жгутиконосцев достигла максимальных значений.

Для дальнейших исследований с помощью микроманипулятора была выделена чистая культура Monosiga ovata, которая развилась в среде в массовом количестве. Monosiga ovata культивировали на жидкой питательной среде заявляемого состава. Рост Monosiga ovata после инокуляции в среду отмечался на 5 сутки, максимальной численности культура достигала на 10 сутки, затем численность начинала плавно снижаться. Для поддержания культуры в лабораторных условиях пересев производили 1 раз в месяц.

Биологическое разнообразие простейших озера Тузлучное, определенное способом-прототипом и предлагаемым способом
Дни наблюдения	Способ-прототип без концентрирования пробы	Способ-прототип после концентрирования пробы	Предлагаемый способ без концентрирования пробы	Предлагаемый способ после концентрирования пробы
2 день	1. Percolomonas cosmopolitus	1. Percolomonas cosmopolitus	1. Percolomonas cosmopolitus	1. Percolomonas cosmopolitus
		2. Monosiga ovata	2. Monosiga ovata	2. Monosiga ovata
		3. Amoeba sp.	3. Amoeba sp.	3. Amoeba sp.
			4. Caecitellus parvulus	4. Caecitellus parvulus
			5. Procryptobia sorokini	5. Procryptobia sorokini
			6. Bodo saliens	6. Bodo saliens
5 день	1. Percolomonas cosmopolitus	1. Percolomonas cosmopolitus	1. Percolomonas cosmopolitus	1. Percolomonas cosmopolitus
	2. Monosiga ovata	2. Monosiga ovata	2. Monosiga ovata	2. Monosiga ovata
	3. Amoeba sp.	3. Amoeba sp.	3. Amoeba sp.	3. Amoeba sp.
		4. Caecitellus parvulus	4. Caecitellus parvulus	4. Caecitellus parvulus
		5. Procryptobia sorokini	5. Procryptobia sorokini	5. Procryptobia sorokini
		6. Bodo saliens	6. Bodo saliens	6. Bodo saliens