вектор, обеспечивающий экспрессию антигена вируса sars на поверхности клеток, и микроорганизмы, трансформированные этим вектором

Формула изобретения

1. Вектор, обеспечивающий экспрессию белка на поверхности клетки, включающий один, два или более генов pgsB, pgsC и pgsA, кодирующих комплекс синтетазы полигамма-глутаминовой кислоты, и ген, кодирующий белок-антиген шипов или белок-антиген нуклеокапсида коронавируса SARS, в котором ген, кодирующий белок-антиген шипов или белок-антиген нуклеокапсида коронавируса SARS, присоединен к С-концевой части одного, двух или более генов pgsB, pgsC и pgsA.

2. Вектор по п.1, в котором белком-антигеном шипов является SARS SA, SARS SB, SARS SC, SARS SD или SARS SBC.

3. Вектор по п.1, в котором белком-антигеном нуклеокапсида является SARS NA, SARS NB или SARS N.

4. Вектор по п.2, который является pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC или pHCE2LB:pgsA-SARS SBC.

5. Вектор по п.З, который является pHCE2LB:pgsA-SARS NB или pHCE2LB:pgsA-SARS N.

6. Микроорганизм, экспрессирующий на поверхности белок-антиген коронавируса SARS, трансформированный вектором по любому из пп.1-5.

7. Микроорганизм по п.6, который выбирают из группы, состоящей из Е. coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium. Vibrio cholerae, Mycobacterium bovis, Shigella, Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Listeria monocytogenes и Streptococcus.

8. Способ получения белка-антигена шипов или белка-антигена нуклеокапсида коронавируса SARS, включающий культивирование микроорганизма по п.6.

9. Способ по п.8, в котором микроорганизм является молочнокислыми бактериями.

10. Вакцина для предупреждения заражения вирусом SARS, включающая в качестве эффективного ингредиента белок-антиген шипов или белок-антиген нуклеокапсида, полученный согласно способу по п.8.

11. Вакцина по п.10, в которой в качестве белка-антигена используют микроорганизмы, экспрессирующие на поверхности указанный белок, в виде грубого экстракта или в очищенном виде.

12. Вакцина по п.10, которую вводят перорально или в составе пищевых продуктов.

13. Вакцина по п.10, которую вводят подкожно или внутрибрюшинно.

14. Вакцина по п.10, которую вводят интраназально.

15. Молочнокислая бактерия, экспрессирующая на поверхности белок-антиген шипов или белок-антиген нуклеокапсида коронавируса SARS, полученная согласно способу по п.9.

16. Вакцина для предотвращения SARS, включающая в качестве эффективного ингредиента молочнокислые бактерии по п.15, белок-антиген, экстрагированный из указанной молочнокислой бактерии, или белок-антиген, выделенный из указанной молочнокислой бактерии.

17. Вакцина по п.16, которую вводят перорально или в составе пищевых продуктов.

18. Вакцина по п.16, которую вводят подкожно или внутрибрюшинно.

19. Вакцина по п.16, которую вводят интраназально.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается вектора, обеспечивающего экспрессию антигенов SARS на поверхности микроорганизма, микроорганизма, трансформированного данным вектором, и вакцины для предупреждения SARS, содержащей трансформированный микроорганизм или экстрагированное и очищенное вещество из данного микроорганизма. В частности, настоящее изобретение касается вектора, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки {surface expression vector), содержащего ген, кодирующий белки-антигены коронавируса, вызывающего SARS, и любой из одного, двух или более генов pgsB, pgsC и pgsA, кодирующих комплекс синтетазы поли- -глутаминовой кислоты, которая в микроорганизмах представляет собой мотив «заякоривания» (anchoring motif) на поверхности клетки; микроорганизма, трансформированного данным вектором, и вакцины против SARS, содержащей в качестве действующего начала трансформированный микроорганизм.

Уровень техники

Атипичная пневмония, или тяжелый острый респираторный синдром (SARS, severe acute respiratory syndrome), представляет собой новый тип эпидемии, которая распространилась по всему миру, включая Гонконг, Сингапур, Канаду (Торонто) и так далее, начиная с момента, когда она была впервые выявлена в ноябре 2002 года в провинции Гуандун в Китае. Это заболевание сопровождается респираторными симптомами, такими как лихорадка с температурой 38°С или выше, кашель, затрудненное дыхание (одышка), атипичная пневмония. Было установлено, что агент, вызывающий SARS, является мутантом патогенного коронавируса.

Как правило, члены семейства коронавирусов представляют собой очень крупные РНК-содержащие вирусы, имеющие (+)-цепь РНК. Их геном состоит примерно из 29000-31000 нуклеотидов, а при наблюдении под микроскопом вирусная частица по форме напоминает корону. У человека они вызывают заболевания верхних дыхательных путей, у животных - респираторные заболевания и болезни печени, нервов и кишечника. В природе существуют три группы коронавирусов, из которых группы I и II инфицируют млекопитающих, а группа III инфицирует птиц.

У людей с ослабленной иммунной системой известные в природе коронавирусы иногда вызывают заболевания, связанные с легкими, или вызывают тяжелые заболевания у таких животных, как собаки, кошки, свиньи, мыши, птицы и тому подобных. Эти вирусы демонстрируют очень высокую скорость мутирования и высокую скорость рекомбинации на уровне около 25%. Предполагается, что эти свойства привели к мутации исходного коронавируса и к появлению нового мутантного коронавируса (коронавируса SARS), который распространился от животных к человеку.

Согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), с ноября 2002 года в 31 стране мира было идентифицировано 7447 пациентов с подозрением на SARS, из которых 551 человек умер. Зона с высокой опасностью по SARS в 2003 году включала провинции Бейджин, Гуандун, Гонконг, Внутренняя Монголия, Шанкси и Тьянджин в Китае, Сингапур, Торонто в Канаде, Тайвань, Улан-Батор в Монголии, Филиппины и тому подобное. Однако существует риск распространения данного вируса по всему миру.

С момента вспышки с 2002 года SARS, вызванного коронавирусом, Институт тропической медицины в Германии первым провел расшифровку нуклеотидной последовательности генома вируса SARS. Группа исследователей расшифровала нуклеотидную последовательность определенного генетического участка, на котором можно проводить амплификацию методом ПНР (полимеразная цепная реакция). Результат расшифровки был предоставлен компании Artus GmbH, которая в Германии работает в области биоинженерии, и был использован для создания диагностического набора для выявления инфекции SARS. Данный набор позволяет выявить инфекцию, вызванную вирусом SARS, с помощью амплификации вирусного гена при использовании материала, полученного из пациента с подозрением на SARS.

После этого был расшифрован весь геном вируса SARS, и в настоящее время полностью проанализированы последовательности более чем 12 выделенных штаммов вируса. Полная последовательность вируса штамма Urbani, который является первьм выделенным штаммом [назван по имени врача миссии ВОЗ, умершего от SARS, прежнее название - штамм SARS-Cov (Rota P.A., Science 108, 5952, 2003; GenBank Accession AY278741)], была расшифрована группой исследователей из CDC в США. Группа из Canada British Columbia Cancer search center проанализировала полную последовательность штамма Тоr2 вируса SARS, выделенного из пациента в Торонто, Канада, 12 апреля 2003 года (Магга М.А., Science 108, 5953, 2003; GenBank Accession 274119).

Несмотря на то, что эти две группы исследователей анализировали коронавирусы, выделенные из пациентов, инфицированных в двух разных местах, различие между двумя вирусами было обнаружено только в 15 нуклеотидах. Это позволяет предполагать, что SARS был вызван одним и тем же вирусом. Согласно данным геномного анализа коронавируса SARS также известно, что данный вирус имеет сходные с другими существующими коронавирусами компоненты, образующие белки, но демонстрирует при сравнении с ними низкую степень гомологии генома и аминокислотной последовательности, закодированной в геноме. Обнаружено сходство коронавируса SARS с вирусом гепатита крыс и вирусом бронхита индеек. Однако данные о корреляции коронавируса SARS и других коронавирусов, полученные с помощью молекулярного таксономического анализа, позволяют заключить, что коронавирус SARS отличается от существующих групп коронавирусов.

В настоящее время выявление коронавируса SARS начинается с ПЦР анализа и положительного результата в тесте на антитела, который проводят методом ELISA или IFA. Выделение вируса осуществляется посредством создания культуры клеток пациента, выявленного с помощью ПЦР, анализа этой культуры и установления факта инфицирования коронавирусом SARS.

Эффективных методов лечения SARS не существует, в настоящее время применяется только дополнительная поддерживающая терапия. Исследования коронавируса SARS, являющегося агентом, вызывающим новую эпидемию, находятся в начальной стадии, и пока не разработана вакцина для предупреждения этого заболевания. Во многих странах мира проводятся разнообразные исследования для создания такой вакцины.

Технология прикрепления и экспрессии определенного белка на клеточной поверхности микроорганизма носит название «технология экспонирования на клеточной поверхности» (cell surface display technology). Технология экспонирования на клеточной поверхности использует белки клеточной поверхности микроорганизмов (таких как бактерии или дрожжи) с мотивом «заякоривания» (anchoring motif) на поверхности для экспрессии чужеродных белков на поверхности клеток, а объем применения данной технологии включает производство рекомбинантной живой вакцины, создание библиотек пептидов и антител и их скрининг, абсорбентов на основе целых клеток, катализаторов для биотрансформации на основе целых клеток, и тому подобное. Область применения этой технологии определяется белком, который экспрессируется на поверхности клетки. Таким образом, технология экспонирования на клеточной поверхности имеет гигантский потенциал для промышленного применения.

Для успешного использования технологии экспонирования на клеточной поверхности наиболее важным является мотив, обеспечивающий «заякоривание» белка на поверхности. Поэтому ключевым для данной технологии является выбор и создание мотива для эффективной экспрессии чужеродного белка на клеточной поверхности.

Для выбора мотива для поверхностного «заякоривания» необходимо учитывать следующие свойства:

1) мотив должен содержать сигнал для секреции, чтобы облегчить чужеродному белку прохождение сквозь внутреннюю мембрану клетки и обеспечить перенос чужеродного белка на клеточную поверхность;

2) мотив должен иметь адресующий сигнал, чтобы обеспечить чужеродному белку стабильное закрепление на поверхности наружной мембраны клетки;

3) мотив может экпрессироваться в значительных количествах на клеточной поверхности, но не должен влиять на рост клеток;

4) мотив не должен влиять на размер белка и должен обеспечивать экспрессию чужеродного белка без изменения его пространственной трехмерной структуры.

Однако мотив «заякоривания» на поверхности, который удовлетворял бы всем перечисленным выше требованиям, пока не создан.

Известные и используемые в настоящее время мотивы «заякоривания» на поверхности подразделяются на четыре типа: белки наружной клеточной мембраны, липопротеины, секреторные белки и белки поверхностных органелл, такие как белок жгутиков. В случае грамотрицательных бактерий для этих целей использовались такие белки наружной клеточной мембраны, как LamB, PhoE (Charbit et al., J. Immunol., 139, 1658, 1987; Agterberg et al., Vaccine, 8, 85, 1990), OmpA и тому подобное. Также использовались липопротеины, такие как TraT (Felici et al., J. Mol. Biol., 222, 301, 1991), PAL (peptidoglycan associated lipoprotein, липопротеин, связанный с пептидогликаном) (Fuchs et al., Bio/Technology, 9,1369,1991) и Lpp (Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 489, 2713, 1992). Белки фимбрий (тонких выростов на поверхности клеток грамотрицательных бактерий), такие как белки адгезии фимбрий типа 1 (tppe 1) FimA или FimH (Hedegaard et al., Gene, 85, 115, 1989), белки пилей (отростков на поверхности микроорганизмов, образующиеся перед половым размножением, конъюгацией), такие как субъединица пилей РарА, также использовались в качестве мотива поверхностного «заякоривания» для экспрессии чужеродного белка. Кроме того, сообщалось, что белок, формирующий центры кристаллизации льда (ice nucleation protein, белки некоторых паразитирующих бактерий, способствующие образованию на их поверхности кристаллов льда) (Jung et al., Nat. Biotechnol., 16, 576, 1998; Jung et al., Enzyme Microb. Technol., 22, 348, 1998; Lee et al., Nat. Biotechnol., 18, 645, 2000), пуллуланаза (pullulanase) из Klebsiela oxytoca (Kornacker et al., Mol. Microl., 4,1101,1990), протеаза IgA из Neiseria (Klauser et al., EMBO J., 9, 1991, 1990), белок AIDA-1, обеспечивающий адгезию Е. coli, белок VirG из шигеллы, гибридный белок, полученный из Lpp и OmpA, также могут использоваться в качестве мотива «заякоривания» на поверхности. В случае грамположительных бактерий сообщалось, что малярийный антиген был эффективно экспрессирован с использованием в качестве мотивов «заякоривания» белков А и FnBPB из Staphyhcoccus aureus, для экспрессии на поверхности использовались также белок клеточной оболочки молочнокислых бактерий, белки клеточной поверхности грамположительных бактерий, такие как белок М6 из Streptococcus pyogenes (Medaglini D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92, 6868, 1995), белок S-слоя ЕА1 из Bacillus anthracis, белок CotB из Bacillus subtilis и тому подобное.

В настоящем изобретении создан новый вектор для эффективной экспрессии чужеродного белка на клеточной поверхности микроорганизма с использованием в качестве нового мотива «заякоривания» на поверхности ген комплекса синтетазы поли-гамма-глутаминовой кислоты (pgsBCA), происходящего из штамма рода Bacillus, а также предложен способ массовой экспрессии чужеродного белка на поверхности микроорганизма, трансформированного таким вектором (Korean Patent Application No. 10-2001-48373).

Были проведены специальные исследования для осуществления стабильной экспрессии патогенного антигена или антигенных детерминант в бактериях, подходящих для массового производства, с использованием методов генной инженерии и названных выше мотивов «заякоривания» на поверхности. В частности, сообщалось, что экзогенные иммуногены, экспрессируемые на поверхности непатогенных бактерий, при пероральном применении бактерий в живом виде могут обеспечивать более продолжительный и сильный иммунный ответ по сравнению с вакцинами, в которых использовались ослабленные патогенные бактерии или вирусы. Такая индукция иммунного ответа может объясняться усиливающим действием поверхностных структур бактерий, обеспечивающим увеличение антигенности экспрессируемого на их поверхности чужеродного белка и иммунного ответа на живые бактерии в живом организме. Создание рекомбинантной живой вакцины из непатогенных бактерий с использованием такой системы для поверхностной экспрессии привлекло внимание общественности.

Таким образом, в настоящем изобретении достигнут успех в массовой экспрессии антигенов коронавируса SARS, выбранных путем анализа генов и белков, на поверхности непатогенного микроорганизма (такого как молочнокислая бактерия), который удовлетворяет требованиям безопасности пищевых продуктов, с использованием гена комплекса синтетазы поли- -глутаминовой кислоты (pgsBCA), происходящего из штамма рода Bacillus, в качестве нового мотива «заякоривания» на поверхности, и в создании экономически выгодной и стабильной вакцины для индукции выработки антител против коронавируса SARS в крови и слизистых оболочках при иммунизации путем перорального введения микроорганизма.

Раскрытие изобретения

Таким образом, объектом настоящего изобретения является создание вектора, обеспечивающего экспрессию антигена коронавируса SARS с применением системы экспрессии на поверхности микроорганизма, и получение микроорганизма, трансформированного данным вектором.

Другим объектом настоящего изобретения является получение трансформированного микроорганизма, содержащего экспрессируемый на поверхности антиген коронавируса SARS, создание вакцины для предотвращения SARS, содержащей в качестве действующего начала антиген коронавируса SARS, экстрагированный из микроорганизма, или антиген коронавируса SARS, очищенный из микроорганизма.

Для достижения указанных выше целей настоящего изобретения был создан вектор, обеспечивающий экспрессию белка на поверхности клетки, включающий один, два или более генов pgsB, pgsC и pgsA, кодирующих комплекс синтетазы поли- -глутаминовой кислоты, и ген, кодирующий белок-антиген шипов или белок-антиген нуклеокапсида коронавируса SARS.

Согласно настоящему изобретению, в качестве гена поверхностного белка-антигена может использоваться любой ген, способный кодировать белок-антиген шипов коронавируса SARS. Можно использовать как один ген белка шипов коронавируса SARS, так и комплекс из двух или более генов. К тому же ген, кодирующий комплекс синтетазы поли- -глутаминовой кислоты, предпочтительно включает pgsA. В качестве белков-антигенов шипов могут использоваться SARS SA, SARS SB, SARS SC, SARS SD или SARS SBC, а в качестве белков-антигенов нуклеокапсида могут использоваться SARS NA, SARS NB или SARS N.

Настоящее изобретение также обеспечивает микроорганизм, трансформированный вектором для экспрессии, и способ для получения белка-антигена шипов или белка-антигена нуклеокапсида коронавируса SARS, включающий культивирование микроорганизма.

Микроорганизм, подходящий для использования в данном изобретении, может быть любым микроорганизмом, который не проявляет токсичности при применении на живом организме, или любым ослабленным микроорганизмом. Например, микроорганизм может быть выбран должным образом из грамотрицательных бактерий, таких как Е. coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Mycobacterium bovis, Shigella и тому подобное, или из грамположительных бактерий, таких как Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Listeria monocytogenes, Streptococcus и тому подобных. Особенно предпочтительным является выбор микроорганизма, который может использоваться в качестве пищевого продукта, как, например, молочнокислые бактерии.

Далее, настоящее изобретение обеспечивает вакцину для предотвращения SARS, в состав которой в качестве действующего начала входит микроорганизм, содержащий экспрессируемый на поверхности белок-антиген, грубый экстракт, состоящий из компонентов клеточной мембраны данного микроорганизма, полученный после разрушения микроорганизма, или белок-антиген, очищенный из данного микроорганизма.

Согласно данному изобретению, вакцина может использоваться в качестве лекарственного средства для предотвращения SARS (атипичной пневмонии), вызываемой коронавирусом SARS.

Согласно данному изобретению, вакцина может применяться перорально или в составе продуктов питания может вводиться в виде подкожных или внутрибрюшинных инъекций или путем интраназального введения.

К настоящему моменту известно, что инфекция коронавируса SARS возникает при заражении органов дыхания воздушно-капельным путем и предположительно развивается на слизистых оболочках органов дыхания. Таким образом, защита от инфекции за счет повышения иммунитета слизистых оболочек является очень важной. Поскольку микроорганизм, экспрессирующий на своей поверхности антиген коронавируса SARS, имеет преимущество, так как может более эффективно индуцировать образование антител на мембранах слизистых оболочек (мукозальный ответ), можно ожидать, что вакцина для перорального применения или вакцина для интраназального применения с использованием трансформированного микроорганизма будет более эффективной для защиты от коронавируса SARS, чем вакцина для парентерального применения.

Краткое описание фигур

Дальнейшие объекты и преимущества данного изобретения можно лучше понять из приведенного ниже детального описания, сопровождающего приведенные фигуры.

Фигура 1 демонстрирует соответствие между четырьмя антигенными участками (А, В, С и D) вируса инфекционного гастроэнтерита свиней (TGE) и белком шипов коронавируса SARS, выявленное с помощью анализа профиля гидрофильности по методу Кайта-Дулиттла (Kyte-Doolittle), индекса антигенности по методу Джеймсона-Вольфа (Jameson-Wolf) и графика вероятности поверхностной локализации по методу Эмини (Emini).

Фигура 2 демонстрирует соответствие между белком нуклеокапсида вируса инфекционного гастроэнтерита свиней и белком нуклеокапсида коронавируса SARS, выявленное с помощью анализа профиля гидрофильности по методу Кайта-Дулиттла (Kyte-Doolittle), индекса антигенности по методу Джеймсона-Вольфа (Jameson-Wolf) и графика вероятности поверхностной локализации по методу Эмини (Emini).

Фигура 3А представляет собой генетическую карту вектора pHCE2LB:pgsA-SARS SA, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки, с использованием грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов в качестве организма-хозяина согласно данному изобретению. Фигура 3В представляет собой генетическую карту вектора pHCE2LB:pgsA-SARS SC согласно данному изобретению, и Фигура 3С представляет собой генетическую карту вектора pHCE2LB:pgsA-SARS SBC согласно данному изобретению.

Фигура 4А представляет собой генетическую карту вектора pHCE2LB:pgsA-SARS NB согласно данному изобретению, и Фигура 4В представляет собой генетическую карту вектора pHCE2LB:pgsA-SARS N согласно данному изобретению.

Фигуры 5А, 5В и 5С демонстрируют идентификацию экспрессии антигенов SARS SA, SARS SC и SARS SBC, слитых с белком наружной мембраны pgsA, в Lactobacillus с помощью специфического связывания специфичных антител против pgsA с гибридными белками, определяемого методом вестерн-иммуноблоттинга.

Фигуры 6А и 6В демонстрируют идентификацию экспрессии антигенов SARS SA и SARS SBC, слитых с белком наружной мембраны pgsA, в Lactobacillus с помощью вестерн-иммуноблоттинга с использованием белков, полученных из разрушенных клеток молочнокислых бактерий, в качестве специфических антител против pgsA, и Фигура 6С демонстрирует идентификацию поверхностной экспрессии антигена SARS SBC в Lactobacillus методом FACScan.

Фигуры 7А и 7В демонстрируют идентификацию поверхностной экспрессии антигенов SARS NB и SARS N, слитых с белком наружной мембраны pgsA, в Lactobacillus с помощью вестерн-иммуноблоттинга с использованием белков, полученных из разрушенных клеток молочнокислых бактерий, в качестве специфических антител против PgsA.

Фигура 8 показывает результаты измерения титра IgG антител против антигенов SARS SA и SARS SC в сыворотке крови мышей, которым перорально или интраназально вводили штаммы Lactobacillus casei, каждый из которых был трансформирован векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE1LB:pgsA-SARS NB, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, согласно данному изобретению, и экспрессия антигенной группы на поверхности клеток была подтверждена методом ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay, твердофазный иммуноферментный анализ).

Фигура 9 показывает результаты измерения титра IgA антител против антигенов SARS SA и SARS SC в промывочных жидкостях кишечника и бронхиальных альвеол мышей, которым перорально или интраназально вводили штаммы Lactobacillus casei, каждый из которых был трансформирован векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE1LB:pgsA-SARS NB, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, согласно данному изобретению, и поверхностная экспрессия антигенной группы была подтверждена методом ELISA.

Фигура 10 показывает результаты измерения титра IgG антител против антигена SARS NB в сыворотке крови мышей, которым перорально или интраназально вводили штаммы Lactobacillus casei, каждый из которых был трансформирован векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE1LB:pgsA-SARS NB, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, согласно данному изобретению, и поверхностная экспрессия антигенной группы была подтверждена методом ELISA.

Фигура 11 показывает результаты измерения титра IgA антител против антигена SARS NB в промывочных жидкостях кишечника и бронхиальных альвеол мышей, которым перорально или интраназально вводили штаммы Lactobacillus casei, каждый из которых был трансформирован векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE1LB:pgsA-SARS NB, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, согласно данному изобретению, и поверхностная экспрессия группы антигенов была подтверждена методом ELISA.

Осуществление изобретения

Ниже настоящее изобретение будет рассмотрено более детально с помощью представленных далее примеров. Любому специалисту в данной области должно быть понятно, что примеры приводятся только для более конкретного объяснения настоящего изобретения и объем настоящего изобретения этими примерами не ограничивается.

В частности, хотя в приведенных ниже примерах используются гены антигенного участка белка шипов коронавируса SARS и гены антигенного участка белка нуклеокапсида коронавируса SARS, может быть использован любой антигенный белок или комплекс из двух или более белков.

В приведенных ниже примерах также используется ген pgsBCA белка наружной мембраны клеток, участвующий в синтезе поли- -глутаминовой кислоты, который был получен из Bacillus subtilis, вариант chungkookjang (KCTC 0697BP). Однако, согласно данному изобретению, включающие ген векторы сконструированы с использованием pgsBCA, полученного из всех штаммов бактерий рода Bacillus, продуцирующих поли- -глутаминовую кислоту, или микроорганизмов, трансформированные такими векторами. Например, в объем настоящего изобретения входит конструирование вектора для вакцины с использованием гена pgsBCA, полученного из другого штамма, имеющего гомологию последовательности 80% или более с последовательностью гена pgsBCA, из штамма Bacillus subtilis (вариант chungkookjang), и использование этого вектора.

Кроме того, в приведенных ниже примерах для конструирования вектора, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки, используется только pgsA из гена pgsBCA. Однако, как можно понять из приведенных непрямых примеров, в объем настоящего изобретения также входит конструирование вектора для вакцины с использованием всего гена или части гена pgsBCA.

В следующих примерах клетками-хозяевами для экспрессии вектора служат Salmonella typhi, как представитель грамотрицательных бактерий, и Lactobacillus, как представитель грамположительных бактерий. Однако любому специалисту в данной области понятно, что аналогичные результаты могут быть получены с использованием любой грамотрицательной бактерии или грамположительной бактерии, которая будет трансформирована по способу, предложенному в настоящем изобретении.

Кроме того, в приведенных примерах представлены результаты только тех экспериментов, где в качестве живой вакцины для введения живым организмам использовался целый микроорганизм, трансформированный вектором для получения вакцины согласно настоящему изобретению. Однако согласно данным, имеющимся в области получения и использования вакцин, совершенно очевидно, что идентичные или очень близкие результаты будут получены при применении на живых объектах экспрессируемых белков (белков-антигенов коронавируса SARS) в виде грубого экстракта из микроорганизма или в высоко очищенном виде.

Пример 1. Синтез гена антигенного участка белка шипов коронавируса SARS.

Белок шипов коронавируса SARS является гликопротеином, включающим 1256 аминокислот. В случае других коронавирусов, которые были тщательно проанализированы, белок шипов обычно встроен в белковую оболочку, покрывающую поверхность вирусной частицы, и образует структуру, выступающую снаружи над ее поверхностью. Расположенный снаружи участок и антигенный участок были интенсивно изучены как антиген-мишень вакцины для индукции вирусной инфекции и для предотвращения инфекции.

Поэтому для того, чтобы выбрать участок, способный проявлять антигенность, из последовательности 1256 аминокислот белка шипов коронавируса SARS, исходили из результатов сравнительного анализа белков и структурного сравнительного анализа с белком шипов другого коронавируса - коронавируса инфекционного гастроэнтерита свиней (TGE), который был изучен на предмет антигенности и синтезирован. Конкретно, антигенный участок белка шипов вируса инфекционного гастроэнтерита свиней, как хорошо известно, содержит четыре участка (А, В, С и D) (Enjuanes L., Virology, 183, 225, 1991). Соответствие между этими участками и белком шипов коронавируса SARS было проанализировано посредством сравнения профиля гидрофильности с использованием метода Кайта-Дулиттла (Kyte-Doolittle), индекса антигенности по методу Джеймсона-Вольфа (Jameson-Wolf) и графика вероятности поверхностной локализации по методу Эмини (Emini), и в результате из последовательности белка шипов коронавируса SARS штамма Тог2 были выбраны участки SARS SA, SARS SB, SARS SC и SARS SD (Фигура 1).

Сначала, основываясь на последовательности белка шипов коронавируса SARS штамма Тоr2 (21492-25259 нуклеотидов, 1255 аминокислот), полная последовательность которого была установлена, был выбран участок, включающий аминокислоты 2-114, который, как ожидалось, является антигенным участком, который обозначен как SARS SA, также был выбран участок, включающий аминокислоты 375-470, который обозначен как SARS SB, участок, включающий аминокислоты 510-596, который обозначен как SARS SC, и участок, включающий аминокислоты 1117-1197, который обозначен как SARS SD. Из числа этих антигенных участков, гены SARS SA и SARS SC участков были синтезированы.

Для того чтобы синтезировать ген, способный кодировать 113 аминокислот, который обозначен как SARS SA, проводили реакцию ПЦР с целью амплификации гена SARS SA длиной 339 п.н., используя праймеры, соответствующие последовательностям SEQ ID NOs: 1-8,

SEQ ID NO: 1: 5'-ggatcctttattttcttattatttcttactctcactagtggtagtgaccttgaccg-3'

SEQ ID NO: 2: 5'-tgagtgtaattaggagcttgaacatcatcaaaagtggtacaacggtcaaggtc-3'

SEQ ID NO: 3: 5'-aattacactcaacatacttcatctatgcgtggggtttactatcctgatgaaatttttc-3'

SEQ ID NO: 4: 5'-aaaatggaagaaataaatcctgagttaaataaagagtgtctgaacgaaaaattt-3'

SEQ ID NO: 5: 5'-cttccattttattctaatgttactgggtttcatactattaatcatacgtttggcaac-3'

SEQ ID NO: 6: 5'-ggcagcaaaataaataccatccttaaaaggaatgacagggttgccaaacgtatg-3'

SEQ ID NO: 7: S'-atttattttgctgccacagagaaatcaaatgttgtccgtggttgggtttttgg-3'

SEQ ID NO: 8: 5'-ggtaccaagcttattacacagactgtgacttgttgttcatggtagaaccaaaaaccc-3'

Для того чтобы синтезировать ген, способный кодировать участок длиной в 87 аминокислот, который обозначен как SARS SC, для получения амплифицированного гена SARS SC длиной 261 п.н. проводили ПЦР, используя праймеры с последовательностями SEQ ID NOs: 9-14.

SEQ ID NO: 9: 5'-ggatccgtttgtggtccaaaattatctactgaccttattaagaaccagtgtgtcaat-3'

SEQ ID NO: 10: 5'-gaagaaggagttaacacaccagtaccagtgagaccattaaaattaaaattgacacact-3'

SEQ ID NO: 11: 5'-aactccttcttcaaagcgttttcaaccatttcaacaatttggccgtgatgtttctga-3'

SEQ ID NO: 12: 5'-ctaaaatttcagatgttttaggatcacgaacagaatcagtgaaatcagaaacat-3'

SEQ ED NO: 13: 5'-ctgaaattttagacatttcaccttgtgcttttgggggtgtaagtgtaattaca-3'

SEQ ID NO: 14: 5'-ggtaccaagcttattaaacagcaacttcagatgaagcatttgtaccaggtgtaattac-3'

Кроме того, гены антигенных участков были получены посредством синтеза, ген, способный кодировать участок, включающий аминокислоты 264-596, был амплифицирован в реакции ПЦР при использовании кДНК клона шипа SARS (коронавирус SARS TOR2) из Canada's Michael Smith Genome Science Center в качестве матрицы и праймеров с последовательностями SEQ ГО NOs: 15 и 16 для получения гена длиной 996 п.н., который был обозначен как SARS SBC [этот ген содержит критический участок, необходимый для нейтрализации антител (PNAS, 101, 2536, 2004)].

SEQ ID NO: 15 (SBC смысловой): 5'-cgcggatccctcaagtatgatgaaaat-3'

SEQ ID NO: 16 (SBC анти-смысловой): 5'-cggggtaccttaaacagcaacttcaga-3'

Пример 2. Синтез антигенного участка гена белка нуклеокапсида коронавируса SARS.

Белок нуклеокапсида коронавируса SARS представляет собой белок, составленный из 422 аминокислот. Сообщалось, что наибольшая часть белков нуклеокапсида других коронавирусов, на которых было проведено много исследований, являются антигенами. Такие антигенные участки были интенсивно изучены с целью использования в качестве антигена-мишени вакцины для предотвращения инфицирования коронавирусом.

Поэтому участки в аминокислотной последовательности белка нуклеокапсида-коронавируса SARS, способные демонстрировать антигенность, были выбраны, исходя из результатов сравнительного анализа белков с белком нуклеокапсида коронавируса инфекционного гастроэнтерита свиней (TGE), и затем синтезированы.

Конкретно, соответствие между белком нуклеокапсида вируса инфекционного гастроэнтерита свиней и белком нуклеокапсида коронавируса SARS было проанализировано посредством сравнения профиля гидрофильности с использованием метода Кайта-Дулиттла (Kyte-Doolittle), индекса антигенности по методу Джеймсона-Вольфа (Jameson-Wolf) и графика вероятности поверхностной локализации по методу Эмини (Emini), и в результате из последовательности белка нуклеокапсида коронавируса SARS штамма Тог2 были выбраны участки SARS NA и SARS NB (Фигура 2).

Сначала, исходя из последовательности белка нуклеокапсида коронавируса SARS штамма Тог2 (28120-29388 нуклеотидов, 422 аминокислоты), полная последовательность которого была установлена, был выбран участок, включающий аминокислоты со 2 по 157, который, как ожидали, является антигенным участком, он обозначен как SARS NA, a также был выбран участок, включающий аминокислоты со 163 по 305, который обозначен как SARS NB. В настоящем изобретении ген SARS NB участка был синтезирован.

Для того чтобы синтезировать ген, способный кодировать участок из 143 аминокислот, обозначенный как SARS NB, реакцию ПЦР с целью амплификации гена SARS NB длиной 429 п.н. проводили, используя праймеры с последовательностями SEQ ID NOs: 17-26.

SEQ ID NO: 17: 5'-ggatcccctcaaggtacaacattgccaaaaggcttctacgcagagggtagccgtgg-3'

SEQ ID NO: 18: 5'-accacgactacgtgatgaagaacgagaagaggcttgactgccgccacggctacc-3'

SEQ ID NO: 19: 5'-cacgtagtcgtggtaattcacgtaattcaactcctggcagcagtcgtggtaat-3'

SEQ ID NO: 20: 5¹-gcgagggcagtttcaccaccaccgctagccatacgagcaggagaattaccacga-3'

SEQ ID NO: 21: 5'-gaaactgccctcgcacttttgctgcttgaccgtttgaaccagcttgagagcaa-3'

SEQ ID NO: 22: 5'-tagtgacagtttgaccttgttgttgttggcctttaccagaaactttgctctcaa-3'

SEQ ID NO: 23: 5'-caaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcatctaaaaagcctcgtcaaaaacgt-3'

SEQ ID NO: 24: 5'-ggaccacgacgcccaaatgcttgagtgacgttgtactgttttgtggcagtacgtttttg-3'

SEQ ID NO: 25: 5'-gggcgtcgtggtccagaacaaacccaaggtaatttcggggaccaagaccttatccgt-3'

SEQ ID NO: 26: 5'-ggtaccaagcttattaaatttgcggccaatgtttgtaatcagtaccttgacggataagg-3'

Кроме того, гены антигенных участков были получены посредством синтеза, ген, способный кодировать участок, включающий аминокислоты со 2 по 305, амплифицировали методом ПЦР, используя для получения гена длиной 912 п.н., который был обозначен как SARS N, клон кДНК нуклеокапсида SARS (коронавирус SARS TOR2) из Canada's Michael Smith Genome Science Center в качестве матрицы и праймеры с последовательностями SEQ ID NOs: 27 и 28.

SEQ ID NO: 27 (N смысловой): 5'-cgcggatcctctgataatggtccgcaa-3'

SEQ ID NO: 28 (N анти-смысловой): 5'-cggggtaccttaaatttgcggccaatgttt-3'

Пример 3. Конструирование векторов pHCE2LB:pgsA-SARS SA и pHCE2LB:pgsA-SARS SC, обеспечивающих экспрессию белка на поверхности клетки.

Векторы pHCE2LB:pgsA-SARS SA и pHCE2LB:pgsA-SARS SC, обеспечивающие экспрессию белка на поверхности клетки и способные экспрессировать антигенные участки SARS SA и SC белка шипов коронавируса SARS, были сконструированы с использованием pgsA гена (pgsBCA), кодирующего белок наружной клеточной мембраны из штамма рода Bacillus и участвующего в синтезе поли- -глутаминовой кислоты, используя грамотрицательный микроорганизм и грамположительный микроорганизм в качестве организмов-хозяев.

Во-первых, для того, чтобы ввести антигенные участки SARS SA и SARS SC белка шипов коронавируса SARS в вектор, обеспечивающий экспрессию белка на поверхности клетки, имеющий антиген L1 вируса папилломы человека, экспрессирующийся в грамотрицательных и грамположительных микроорганизмах как в организмах-хозяевах [вектор, содержащий промотор НСЕ, который является промотором, обеспечивающим стабильную высокоэффективную экспрессию, pgsA гена (pgsBCA) белка наружной клеточной мембраны, участвующего в синтезе поли- -глутаминовой кислоты, и HPV L1 в рАТ, который является вектором, подходящим для использования в грамотрицательных и в грамположительных бактериях], pHCE2LB:pgsA-HPVLl (KCTC 10349BP) переваривали, используя рестриктазы BamHI и KpnI. Ген HPVL1 был удален для получения вектора pHCE2LB:pgsA, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки.

Каждый из генов, способных кодировать антигены SARS SA и SARS SC, синтезированные в Примере 1, был переварен ферментами - эндонуклеазами рестрикции BamHI и KpnI и присоединен к С-концу гена pgsA белка наружной клеточной мембраны, который принимает участие в синтезе поли- -глутаминовой кислоты, находящегося в составе предварительно полученного вектора pHCE2LB:pgsA, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки, в соответствии с кодоном трансляции (с соблюдением целостности рамки считывания) для получения векторов pHCE2LB:pgsA-SARS SA и pHCE2LB:pgsA-SARS SC (Фигуры 3А и 3В). Грамположительные бактерии Lactobacillus были трансформированы сконструированными векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA и pHCE2LB:pgsA-SARS SC, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, и проанализированы на присутствие плазмид pHCE2LB:pgsA-SARS SA и pHCE2LB:pgsA-SARS SC в клетках Lactobacillus.

Пример 4. Конструирование вектора pHCE2LB:pgsA:SARS SBC, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки.

Вектор pHCE2LB:pgsA-SARS SBC, способный экспрессировать антигенный участок SARS SBC белка шипов коронавируса, локализующийся на поверхности клеток, был сконструирован с использованием pgsA гена (pgsBCA) белка наружной клеточной мембраны, происходящего из штамма рода Bacillus и участвующего в синтезе поли- -глутаминовой кислоты.

Во-первых, при использовании способа, описанного в Примере 3, был приготовлен вектор pHCE2LB:pgsA, обеспечивающий экспрессию белка на поверхности клетки. Ген, кодирующий участок, включающий аминокислоты 264-596, амплифицировали, проводя ПЦР, для которой в качестве матрицы для получения SARS SBC гена длиной 996 п.н. использовали клон кДНК шипа коронавируса SARS, описанный в Примере 1. Ген SARS SBC был затем встроен в вектор pHCE2LB:pgsA, обеспечивающий экспрессию белка на поверхности клетки, для получения pHCE2LB:pgsA-SARS SBC (Фигура 3С). Грамположительные бактерии Lactobacillus были трансформированы сконструированным вектором pHCE2LB:pgsA-SARS SBC, обеспечивающим экспрессию белка на поверхности клетки, и анализировали клетки Lactobacillus на наличие плазмиды pHCE2LB:pgsA-SARS SBC.

Пример 5. Конструирование вектора pHCE2LB:pgsA:SARS NB, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки.

Вектор pHCE2LB:pgsA-SARS NB, способный экспрессировать антигенный участок SARS NB белка нуклеокапсида коронавируса SARS, локализующийся на поверхности клеток, был сконструирован при использовании pgsA гена (pgsBCA) белка наружной клеточной мембраны, происходящего из штамма рода Bacillus и участвующего в синтезе поли- -глутаминовой кислоты.

Сначала при использовании способа, описанного в Примере 3, был приготовлен вектор pHCE2LB:pgsA, обеспечивающий экспрессию белка на поверхности клетки. Ген антигена SARS NB, синтезированный в Примере 2, переваривали ферментами - эндонуклеазами рестрикции BamHI и KpnI и присоединяли к С-концу гена pgsA белка наружной клеточной мембраны, участвующего в синтезе поли- -глутаминовой кислоты, находящегося в составе предварительно приготовленного вектора pHCE2LB:pgsA, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки, в соответствии с кодоном трансляции для получения вектора pHCE2LB:pgsA-SARS NB (Фигура 4А). Грамположительные бактерии Lactobacillus трансформировали приготовленным вектором pHCE2LB:pgsA-SARS NB, обеспечивающим экспрессию белка на поверхности клетки, и анализировали клетки Lactobacillus на наличие плазмиды pHCE2LB:pgsA-SARS NB.

Пример 6. Конструирование вектора pHCE2LB:pgsA-SARS N, обеспечивающего экспрессию белка на поверхности клетки.

Вектор pHCE2LB:pgsA-SARS N, способный экспрессировать антигенный участок SARS N белка нуклеокапсида коронавируса SARS, локализующийся на поверхности клеток, был сконструирован с использованием pgsA гена (pgsBCA) белка наружной клеточной мембраны, происходящего из штамма рода Bacillus и участвующего в синтезе поли- -глутаминовой кислоты.

Сначала способом, описанным в Примере 3, был приготовлен вектор pHCE2LB:pgsA, обеспечивающий экспрессию белка на поверхности клетки. Ген, кодирующий участок, включающий 2-305 аминокислоты, был амплифицирован методом ПЦР при использовании в качестве матрицы клона кДНК нуклеокапсида коронавируса SARS, описанного в Примере 2, для получения гена SARS N длиной 912 п.н. Ген SARS N затем был встроен в вектор pHCE2LB:pgsA, обеспечивающий экспрессию белка на поверхности клетки, для получения pHCE2LB:pgsA-SARS N (Фигура 4 В). Грамположительные бактерии Lactobacillus были трансформированы полученным вектором pHCE2LB:pgsA-SARS N, обеспечивающим экспрессию белка на поверхности клетки, и клетки Lactobacillus были проанализированы на присутствие плазмиды pHCE2LB:pgsA-SARS N.

Пример 7. Подтверждение экспрессии белка-антигена шипов вируса SARS на поверхности молочнокислых бактерий.

Lactobacillus трансформировали векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE2LB:pgsA-SARS SBC, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, и проверяли на наличие экспрессии соответствующих белков-антигенов.

Экспрессия антигенных участков антигена шипов вируса SARS, слитых с С-концом гена pgsA, синтезирующего поли- -глутаминовую кислоту, была индуцирована посредством трансформации Lactobacillus casei векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE2LB:pgsA-SARS SBC, и культивирования трансформированного штамма в среде MRS (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA) до получения стационарной культуры при 37°С.

Экспрессию каждого антигена идентифицировали, осуществляя вестерн

- иммуноблоттинг, используя SDS-электрофорез в полиакриламидном геле и специфичные антитела против pgsA. При приготовлении образцов были взяты в одинаковом количестве целые клетки Lactobacillus casei, в которых была индуцирована экспрессия, проведена денатурация и получены белки. Образцы были проанализированы методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле и после разделения белки были перенесены на PVDF мембрану (polyvinylidene-difluoride мембраны, Bio-Rad). Затем PVDF мембрану с белками переносили в буферный раствор для блокирования неспецифического связывания (50 mM трис HCl, 5% обезжиренное молоко, рН 8,0) и блокировали при покачивании в течение 1 часа, затем течение 12 часов проводили реакцию с поликлональными первичными антителами против pgsA, полученными из кролика, которые были разведены в 1000 раз буферным раствором для блокирования.

После завершения реакции мембрану промывали буферным раствором и проводили в течение 4 часов реакцию со связанными с биотином вторичными антителами против кроличьих антител, которые были разведены в 1000 раз раствором для блокирования. После завершения реакции мембрану промывали буферным раствором и проводили реакцию с реагентом авидин-биотин в течение 1 часа, а затем промывали. Отмытую мембрану обрабатывали H ₂O₂, раствором DAB, который использовали в качестве субстрата, и агентом для развития окраски для подтверждения специфического связывания между специфичными антителами против pgsA и слитым белком (Фигура 5). На Фигуре 5А на дорожке 1 представлены нетрансформированные Lactobacillus casei, на дорожках 2, 3 и 4 - Lactobacillus casei, трансформированные вектором pHCE2LB:pgsA-SARS SA. На Фигуре 5 В на дорожке 1 представлены нетрансформированные Lactobacillus casei, на дорожках 2, 3, 4, 5 и 6 представлены Lactobacillus casei, трансформированные вектором pHCE2LB:pgsA-SARS SC. На Фигуре 5С на дорожке 1 представлены нетрансформированные Lactobacillus casei, на дорожке 2 - Lactobacillus casei, трансформированные вектором pHCE2LB:pgsA-SARS SBC.

Как показано на Фигуре 5, в целых клетках соответствующих молочнокислых бактерий были идентифицированы специфичные слитые белки [pgsA-SARS SA размером около 54 кДа (Фигура 5А), pgsA-SARS SC размером около 51 кДа (Фигура 5В) и pgsA-SARS SBC размером около 78 кДа (Фигура 5С)].

Также, для того чтобы подтвердить, что соответствующие белки-антигены с pgsA экспрессировались на поверхности молочнокислых бактерий, трансформированных векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA и pHCE2LB:pgsA-SARS:SBC, обеспечивающими экспрессию белка на клеточной поверхности, молочнокислые бактерии, трансформированные соответствующими векторами, фракционировали посредством метода клеточного фракционирования с использованием ультрацентрифуги на клеточную стенку и цитоплазму и наличие соответствующих слитых белков подтверждали методом вестерн-блоттинга, используя специфичные антитела против pgsA.

Конкретно, Lactobacillus, которые демонстрировали экспрессию слитых белков на клеточной поверхности, индуцированную описанным выше способом, выращивали для эксперимента до достижения той же концентрации клеток, что и нетрансформированные Lactobacillus. Клетки несколько раз промывали буфером TES (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 mM EDTA, 25% сахарозы), суспендировали в дистиллированной воде, содержащей 5 мг/мл лизоцима, 1 мМ PMSF и 1 мМ EDTA, несколько раз замораживали при -60°С и оттаивали при комнатной температуре, обрабатывали ДНКазой (0,5 мг/мл) и РНКазой (0,5 мг/мл) и подвергали озвучиванию для разрушения клеток. Затем клеточный лизат центрифугировали при 4°С в течение 20 минут при 10000 × g для отделения не лизированных целых клеток Lactobacillus (осадок; фракция не разрушенных клеток) и клеточного дебриса (супернатант). Отделенный клеточный дебрис центрифугировали при 4°С в течение 1 часа при 21000 × g для получения супернатанта (растворимая фракция), содержащего белки цитоплазмы Lactobacillus, и осадков. Полученные осадки суспендировали в растворе ТЕ (10 мМ трис-HCl, рН 8,0,1 мМ EDTA, рН 7,4), содержащем 1% SDS, для получения белков клеточной стенки (фракция клеточной стенки) Lactobacillus.

Соответствующие фракции подвергали вестерн-иммуноблоттингу с использованием SDS-электрофореза в полиакриламидном геле и антител против антигена pgsA для подтверждения того, что антигены шипов вируса SARS, слитые с pgsA, из проанализированных фракций Lactobacillus локализуются во фракции клеточной стенки (Фигура 6). На Фигуре 6А на дорожке 1 представлены нетрансформированные Lactobacillus casei, на дорожке 2 представлены целые клетки Lactobacillus casei, трансформированные pHCE2LB:pgsA-SARS SA, на дорожках 3 и 4 представлены растворимая фракция и фракция клеточной стенки штамма, трансформированного pHCE2LB:pgsA-SARS SA, соответственно. На Фигуре 6 В на дорожке 1 представлены нетрансформированные Lactobacillus casei, на дорожке 2 представлены целые клетки Lactobacillus casei, трансформированные pHCE2LB:pgsA-SARS SBC, на дорожках 3 и 4 представлены растворимая фракция и фракция клеточной стенки штамма, трансформированного pHCE2LB:pgsA-SARS SBC, соответственно.

Как показано на Фигуре 6, белок SARS SA размером около 54 кДа, слитый с pgsA, и белок SARS SBC размером около 78 кДа, слитый с pgsA, были идентифицированы в целых клетках и во фракции клеточной стенки молочнокислых бактерий. Исходя из этих результатов было отмечено, что соответствующие белки-антигены SARS, слитые с pgsA, экспрессируются и располагаются на поверхности бактерий в результате миграции к поверхности молочнокислой бактерии, опосредованной pgsA.

Кроме того, методом проточной цитометрии с сортировкой клеток на основе флуоресценции (fluorescence-activating cell sorting, FACS), было установлено, что на поверхности Lactobacillus имела место экспрессия антигенной группы антигена шипов вируса SARS за счет его слияния с С-концом белка pgsA, синтезирующего поли- -глутаминовую кислоту.

Для иммунофлуоресцентного окрашивания клетки Lactobacillus, в которых была индуцирована экспрессия, были собраны при одинаковой концентрации клеток. Клетки промывали несколько раз буферным раствором (буфер PBS, рН 7,4), суспендировали в 1 мл буферного раствора, содержащего 1% бычий сывороточный альбумин, и проводили реакцию с мышиными поликлональными первичными антителами против антигена шипов вируса SARS, которые были разведены в 1000 раз, при 4°С в течение 12 часов. После завершения реакции клетки промывали несколько раз буферным раствором, суспендировали в 1 мл буферного раствора, содержащего 1% бычий сывороточный альбумин, и проводили реакцию со связанными с биотином вторичными антителами, которые были разведены в 1000 раз, при 4°С в течение 3 часов. После завершения реакции клетки снова промывали несколько раз буферным раствором, суспендировали в 0,1 мл буферного раствора, содержащего 1% бычий сывороточный альбумин, и связывали со стрептавидин-R-фикоэритрин красящим агентом, специфичным к биотину, который был разведен в 1000 раз.

После завершения реакции клетки Lactobacillus промывали несколько раз и исследовали с помощью проточной цитометрии с сортировкой клеток на основе флуоресценции (FACS). Было отмечено, что по сравнению с нетрансформированными Lactobacillus белок-антиген SBC шипов вируса SARS был экспрессирован на поверхности Lactobacillus (Фигура 6С). На фигуре 6С участок серого цвета соответствует нетрансформированным Lactobacillus casei, а участок белого цвета соответствует трансформированным pHCE2LB:pgsA-SARS SBC/Lactobacillus casei. Как показано на Фигуре 6С, очевидно, что SBC белок-антиген шипов был экспрессирован на поверхности молочнокислых бактерий, трансформированных вектором pHCE2LB:pgsA-SARS SBC, в то время как в нетрансформированных Lactobacillus casei флуоресценция отсутствовала, то есть экспрессия не наблюдалась.

Пример 8. Подтверждение экспрессии белка-антигена нуклеокапсида вируса SARS на поверхности молочнокислых бактерий.

Lactobacillus трансформировали векторами pHCE2LB:pgsA-SARS NB и pHCE2LB:pgsA-SARS N, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, и проверяли на наличие экспрессии соответствующих белков-антигенов.

Экспрессию антигенных участков антигена нуклеокапсида вируса SARS, слитых соответственно с С-концом гена pgsA, участвующего в синтезе поли- -глутаминовой кислоты, индуцировали посредством трансформации Lactobacillus casei векторами pHCE2LB:pgsA-SARS NB и pHCE2LB:pgsA-SARS N, соответственно, и культивирования трансформированного штамма в среде MRS (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA) при 37°С до стационарной культуры.

Для того чтобы подтвердить, что соответствующие белки-антигены с pgsA были экспрессированы на поверхности молочнокислых бактерий, трансформированных векторами pHCE2LB:pgsA-SARS NB и pHCE2LB:pgsA-SARS N, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, молочнокислые бактерии, трансформированные каждым вектором при использовании того же метода, который описан в Примере 7, были фракционированы посредством метода клеточного фракционирования с использованием ультрацентрифуги на клеточную стенку и цитоплазму, после чего локализация соответствующих слитых белков была определена методом вестерн-блоттинга с использованием специфических антител против pgsA.

В результате соответствующие фракции были проанализированы с применением вестерн-иммуноблоттинга с использованием SDS-электрофореза в полиакриламидном геле и антител против антигена pgsA для подтверждения того, что нуклео-антигены вируса SARS, слитые с pgsA, локализуются в клеточной стенке и обнаруживаются в составе соответствующих фракций Lactobacillus (Фигура 7). На Фигуре 7А на дорожке 1 представлены нетрансформированные Lactobacillus casei, на дорожке 2 представлены целые клетки, трансформированные pHCE2LB:pgsA-SARS NB/Lactobacillus casei, на дорожках 3 и 4 представлены растворимая фракция и фракция клеточной стенки штамма, трансформированного pHCE2LB:pgsA-SARS NB, соответственно. На Фигуре 7В на дорожке 1 представлены нетрансформированные Lactobacillus casei, на дорожке 2 представлены целые клетки, трансформированные pHCE2LB:pgsA-SARS N/Lactobacillus casei, на дорожках 3 и 4 представлены растворимая фракция и фракция клеточной стенки штамма, трансформированного pHCE2LB:pgsA-SARS N, соответственно.

Как показано на Фигуре 7, белок SARS NB, размером около 57 кДа, слитый с pgsA, и белок SARS N, размером около 75 кДа, слитый с pgsA, были идентифицированы в целых клетках и во фракции клеточной стенки молочнокислых бактерий. Исходя из этих результатов, было отмечено, что соответствующие белки-антигены SARS, слитые с pgsA, экспрессировались и локализовались на поверхности молочнокислых бактерий в результате миграции к поверхности, опосредованной pgsA.

Пример 9. Анализ полезного действия вакцины, содержащей молочнокислые бактерии, экспрессирующие на поверхности белок-антиген шипов и белок-антиген нуклеокапсида вируса SARS.

Грамположительные бактерии Lactobacillus casei были трансформированы векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE2LB:pgsA-SARS NB, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, приготовленными в описанных выше Примерах, затем была индуцирована экспрессия антигенов на поверхности Lactobacillus casei. Антигенные свойства белка-антигена шипов и белка-антигена нуклеокапсида вируса SARS, слитого с белком наружной мембраны клетки pgsA, участвующим в синтезе поли- -глутаминовой кислоты, были проверены при использовании мыши в качестве модели.

Конкретно, Lactobacillus casei трансформировали векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE2LB:pgsA-SARS NB, обеспечивающими экспрессию белка на поверхности клетки, в соответствии с настоящим изобретением. Культуры клеток выращивали до одинаковой концентрации клеток, собирали и промывали несколько раз буферным раствором (буфер PBS, рН 7,4). Клетки Lactobacillus (5×10 ⁹ клеток) с антигеном, экспрессированным на поверхности, вводили перорально 4-6-недельным мышам BALB/c 3 раза в день через день, 3 раза в день через день после 1 недели, 3 раза в день через день после 2 недель и 3 раза в день через день после 4 недель. Также, клетки Lactobacillus (1×10 ⁹ клеток) с антигеном, экспрессированным на поверхности, вводили мыши интраназально 3 раза в день через день, 3 раза в день через день после 1 недели, 2 раза в день через два дня после 2 недель и 2 раза в день через два дня после 4 недель. После перорального и интраназального введения каждые две недели была отобрана (1) сыворотка каждой мыши и в ней измерено значение титра IgG антител против белка-антигена шипов и белка-антигена нуклеокапсида в сыворотке и (2) в суспензиях, которые были получены после промывания изнутри кишечника каждой мыши, и суспензиях, которые были получены после промывания изнутри бронхов и альвеол каждой мыши, были измерены значения титра IgA антител против белка-антигена шипов и белка-антигена нуклеокапсида с использованием метода ELISA.

В одну группу объединяли по десять мышей BALB/c (4-6-недельного возраста). Смесь молочнокислых бактерий, экспрессирующих SARS SA и SARS SC, составляли одну группу, молочнокислые бактерии, экспрессирующие SARS NB, составляли одну группу, и смесь молочнокислых бактерий, экспрессирующих SARS SA, SARS SC и SARS NB, составляли одну группу. Эти три группы были в свою очередь разделены на группу для перрорального введения и группу для интраназального введения, в результате получили 8 групп, включая контрольную группу.

На Фигуре 8 показан результат измерения величины титра IgG антител против SARS SA и SARS SC антигенов, которые являются белками-антигенами шипов вируса SARS, в сыворотке мыши. На Фигуре 9 показан результат измерения методом ELISA величины титра IgA антител против антигенов SARS SA и SARS SC, которые являются белками-антигенами шипов, в суспензии, которая была получена после промывания изнутри кишечника, и в суспензии, которая была получена после промывания изнутри бронхов и альвеол мыши, на панели А - величина титра IgA антител для группы перорального введения и на панели В - величина титра IgA антител для группы интраназального введения.

Кроме того, Фигура 10 показывает величины титра IgG антител против антигена SARS NB, который является белком-антигеном нуклеокапсида вируса SARS, в сыворотке мыши. Фигура 11 представляет величины титра IgA антител против антигена SARS NB, который является белком-антигеном нуклеокапсида вируса SARS, в суспензии, которая получена после промывания изнутри кишечника, и в суспензии, которая получена после промывания изнутри бронхов и альвеол мыши, согласно ELISA, где на панели А - величина титра IgA антител для группы перорального введения и на панели В - величина титра IgA антител для группы интраназального введения.

Как показано на Фигурах 8-11, было отмечено, что величина титра IgG антител и величина титра IgA антител против антигенных групп белков-антигенов шипов и нуклеокапсида вируса SARS были значительно выше в сыворотке, промывочной жидкости кишечника и промывочной жидкости бронхов и альвеол BALB/c у мышей, которым были введены Lactobacillus, трансформированные векторами pHCE2LB:pgsA-SARS SA, pHCE2LB:pgsA-SARS SC и pHCE2LB:pgsA-SARS NB, только одним или в комбинации, по сравнению с контрольной группой.

Следовательно, было отмечено, что микроорганизм, имеющий антигенные группы белков-антигенов шипов и нуклеокапсида вируса SARS, экспрессированные на его поверхности согласно настоящему изобретению, может быть эффективно использован в виде живой вакцины.

Несмотря на то, что настоящее изобретение описано с помощью достаточно конкретных иллюстративных воплощений, оно не ограничивается только этими воплощениями, а включает в себя все воплощения, приведенные в формуле изобретения. Это должно приниматься во внимание всеми специалистами в данной области, способными внести изменения или модификации в конкретные воплощения без отклонения от объема и сущности данного изобретения.

Применимость в производстве

Как описано выше, трансформированный микроорганизм, экспрессирующий на своей поверхности белок-антиген коронавируса, вызывающего SARS, в соответствии с настоящим изобретением, и белок-антиген, экстрагированный и очищенный из микроорганизма, могут быть использованы как вакцина для профилактики и лечения SARS. В частности, значительным преимуществом является возможность промышленного производства вакцины для перрорального применения с использованием рекомбинантного штамма, экспрессирующего антиген коронавируса SARS согласно настоящему изобретению.