способ оценки гранулоцитопоэзстимулирующей активности фармакологических веществ
Классы МПК: | G01N33/49 крови G01N33/15 медицинских препаратов |
Автор(ы): | Гольдберг Евгений Данилович (RU), Дыгай Александр Михайлович (RU), Зюзьков Глеб Николаевич (RU), Жданов Вадим Вадимович (RU), Симанина Елена Владиславна (RU), Гурьянцева Лариса Аркадьевна (RU), Хричкова Татьяна Юрьевна (RU), Удут Елена Владимировна (RU), Ставрова Лариса Александровна (RU), Сотникова Наталья Владимировна (RU) |
Патентообладатель(и): | ГУ Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (RU) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2006-11-07 публикация патента:
27.08.2008 |
Изобретение относится к области экспериментальной медицины, конкретно к гематологии и фармакологии. Предложенный способ заключается в том, что после воспроизведения гипоплазии кроветворения у экспериментальных животных (мышей) путем однократного введения цитостатика в максимально переносимой дозе (МПД) (циклофосфана либо 5-фторурацила) производят подсчет абсолютного количества клеток гранулоцитарного ростка кроветворения - нейтрофилов - в периферической крови до и после введения вещества, при этом достоверным критерием гранулоцитипоэзстимулирующей активности вводимого фармакологического вещества является увеличение числа нейтрофилов до 150% и более. Технический результат представляет собой упрощение способа определения гранулоцитопоэзстимулирующей активности фармакологических веществ и расширение сферы его применения. 3 табл.
(56) (продолжение):
CLASS="b560m"20.11.1997. RU 2058138 С1, 20.04.1996. RU 2205026 C1, 27.05.2003. Lord BI, Woolford LB, Molineux G. "Kinetics of neutrophil production in normal and neutropenic animals during the response to filgrastim (r-metHu G-CSF) or filgrastim SD/01 (PEG-r-metHu G-CSF)". Clin Cancer Res. 2001 Jul; 7(7):2085-90. PMID: 11448927 [PubMed - indexed for MEDLINE]. Найдено в Интернет 27.11.2007. ПРОВАЛОВА Н.В., СКУРИХИН Е.Г., ПЕРШИНА О.В. «К ВОПРОСУ О МЕХАНИЗМАХ ДЕЙСТВИЯ АДАПТОГЕНОВ», ЧЕЛОВЕК. ПРИРОДА. ОБЩЕСТВО. АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ, МАТЕРИАЛЫ 12-Й МЕЖДУНАРОДНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ, с.604, СМУ, 27-30 декабря 2001 г. Найдено в Интернет 27.11.2007, http://www.sovmu.spbu.ru/main/conf/man-nat-soc/2001/10-6.htm.
Формула изобретения
Способ оценки гранулоцитопоэзстимулирующей активности, заключающийся в определении после моделирования цитостатической гипоплазии костного мозга количества клеток гранулоцитарного ростка кроветворения до и после введения фармакологического вещества, отличающийся тем, что определение проводят в периферической крови и при увеличении абсолютного числа нейтрофилов до 150% и более после введения вещества, данное фармакологическое вещество оценивают как обладающее гранулоцитопоэзстимулирующей активностью.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области экспериментальной медицины, конкретно к гематологии и фармакологии.
Известны адекватные и высокочувствительные способы определения гранулоцитопоэзстимулирующей активности различных фармакологических средств и синтетических и природных соединений [1]. Однако их общим недостатком во всех случаях является значительная трудоемкость, необходимость развитой материально-технической базы и сложность используемых методик.
Известен способ определения гранулоцитопоэзстимулирующей активности фармакологических веществ по регистрации абсолютного количества незрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге экспериментальных животных до и после введения фармакологического вещества на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, и при увеличении их количества не менее чем в 2 раза считают вводимое вещество активным [1].
Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.
Изучение показателей, регистрируемых по способу-прототипу, требует значительных трудозатрат, навыка исследователя и достаточно длительного времени (изучение общей клеточности костного мозга и подсчет миелограмм).
Задачей, решаемой данным изобретением, является упрощение способа определения гранулоцитопоэзстимулирующей активности фармакологических веществ.
Поставленная задача достигается тем, что после воспроизведения гипоплазии кроветворения у экспериментальных животных (мышей) путем однократного введения цитостатика в максимально переносимой дозе (МПД) (циклофосфана либо 5-фторурацила) производят подсчет абсолютного количества клеток гранулоцитарного ростка кроветворения - нейтрофилов - в периферической крови, при этом критерием достаточной гранулоцитопоэзстимулирующей эффективности является увеличение их числа до 150% и более.
Новым в предлагаемом способе является определение количества клеток гранулоцитарного ростка кроветворения в периферической крови и использование в качестве критерия гранулоцитопоэзстимулирующей активности увеличение абсолютного числа нейтрофилов до 150% и более после введения фармакологического вещества.
Одной из актуальных проблем экспериментальной гематологии и фармакологии является поиск новых эффективных лекарственных средств, способных стимулировать кроветворение при гипопластических состояниях различного генеза. Используемые в настоящее время с этой целью в эксперименте и клинике препараты зачастую являются малоэффективными, либо обладают рядом нежелательных эффектов, либо высокой стоимостью [1, 2, 3]. Таким образом, весьма перспективным можно считать создание и изучение потенциальных стимуляторов, в том числе и грануломоноцитопоэза. В связи с этим становится актуальной и проблема разработки быстрой, качественной и достоверной оценки гранулоцитопоэзстимулирующей активности средств, планируемых к применению в качестве гемостимуляторов.
Клетки гранулоцитарного ряда периферической крови (нейтрофилы) представляют собой очень мобильную фракцию клеточных элементов: при их выходе из органов гемопоэза они могут участвовать в создании маргинального сосудистого резервного пула лейкоцитов, циркулировать определенное время в токе крови либо, напротив, быстро мигрировать в ткани организма [4, 5]. В связи с этим даже при одном уровне продукции нейтрофилов в гемопоэтической ткани и их одинаково быстром выходе из органов гемопоэза при различных физиологических и патологических состояниях число нейтрофилов в периферической крови может колебаться в определенных пределах.
Поэтому факт использования в качестве достоверного критерия эффективности гранулоцитопоэзстимулирующей активности увеличение в периферической крови числа нейтрофилов до 150% и более с целью упрощения способа определения гранулоцитопоэзстимулирующей активности веществ для специалиста является неочевидным.
Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не являющиеся очевидными для специалиста и не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют быстро, качественно и достоверно определять гранулоцитипоэзстимулирующую активность веществ, планируемых к применению в качестве стимуляторов гранулоцитопоэза, и предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине с выходом в практическое здравоохранение для создания новых эффективных гемостимуляторов. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.
Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом.
Экспериментальным животным (мыши) путем однократного внутрибрюшинного введения цитостатика в максимально переносимой дозе (МПД) (циклофосфан, 5-фторурацил) воспроизводится гипоплазия кроветворения.
Через 24 ч после инъекции цитостатика опытным мышам начинают вводить препарат, планируемый к применению в качестве стимулятора гранулоцитопоэза. Режим и доза введения каждого препарата определяется индивидуально в зависимости от его ожидаемой специфической активности, токсичности, побочных эффектов и пр. факторов. Контрольные животные после введения цитостатика аналогичным способом введения и в соответствующем режиме получают физиологический раствор.
На следующие сутки после окончания введения испытуемого средства у мышей обеих групп производят забор периферической крови для исследования лейкоцитов. Для этой цели можно использовать как автоматический гематологический анализатор, так и общепринятые стандартные гематологические методы [6], один из которых приведен ниже.
В этом случае из надреза предварительно обработанного спиртом кончика хвоста выдавливают каплю крови, которая набирается до отметки «0,5» в смеситель для белой крови и разводится до метки «11» 3-5%-ным раствором уксусной кислоты, после чего содержимое смесителя тщательно перемешивается в течение 2-3 мин. Перед заполнением камеры Горяева две капли жидкости из смесителя удаляют. Подсчет ведут в 100 больших квадратах, сгруппированных по 4 (объектив 8, окуляр 15). Подсчитав число лейкоцитов во всех 100 квадратах, записывают результат, а затем производят расчет по формуле:
где Х - количество лейкоцитов в 1 л крови;
а - сумма лейкоцитов, подсчитанных в 100 квадратах;
б - разведение крови в 20 раз;
в - число сосчитанных малых квадратов - 1600;
4×109 - множитель, приводящий результат к 1 л крови.
Одновременно с набором крови в смеситель готовят тонкие мазки крови для подсчета лейкоцитарной формулы на заранее обезжиренных предметных стеклах и высушивают их на воздухе. Зафиксированные (3-5 мин в метаноле) мазки окрашивают по методу Нохта-Максимова. Краска для этого готовится путем смешивания очищенной воды, 0,1%-ного водного раствора азура II (ТУ 6-09-07-553-75) и 0,1%-ного водного раствора эозина (ТУ 6-09-183-75) в соотношении 6:1:0,5. Окрашивание длится 35-45 минут, после чего мазки промывают и высушивают.
Подсчет лейкоцитарной формулы производят с помощью иммерсионной системы микроскопа. При этом сосчитывают не менее 100 лейкоцитов, а затем определяют процентное содержание их отдельных морфологических форм. Затем вычисляют абсолютное содержание лейкоцитов каждого вида в периферической крови. При этом используется следующая пропорция:
а - 100%;
Х - б,
где Х - содержание лейкоцитов определенного вида в 1 л крови;
а - общее количество лейкоцитов в крови, подсчитанное в камере Горяева;
б - процентное содержание лейкоцитов соответствующего вида, подсчитанное в мазке крови.
Анализируя полученные данные, сравнивают абсолютное количество сегментоядерных нейтрофилов в 1 л периферической крови у мышей, получавших только циклофосфан, и у животных, получавших испытуемый препарат на фоне циклофосфана. Величина указанного показателя в опытной группе должна составлять не менее 150% от таковой у контрольных животных.
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши) в количестве 298 шт., массой 18-20 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).
Пример 1.
Определяли специфическую (гранулоцитопоэзстимулирующую) активность рчГ-КСФ («Нейпоген», Hoffman-la-Roche, Швейцария).
Для тестирования активности препарата использовали мышей-самцов линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Все животные получали однократно внутрибрюшинно циклофосфан в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) в 0,2 мл физиологического раствора. Через 24 ч после инъекции цитостатика опытным мышам начинали вводить рчГ-КСФ в дозе 125 мкг/кг в объеме 0,2 мл подкожно, ежедневно в течение 4-х дней. В качестве растворителя использовали забуференный физиологический раствор. Контрольные животные после введения цитостатика получали четырехкратно в эквивалентном объеме растворитель.
На 5-е сутки после введения циклофосфана (на следующий день после окончания введения рчГ-КСФ) у мышей обеих групп производили забор периферической крови для определения абсолютного количества нейтрофилов. При этом для подтверждения уровня активности гиперпластических процессов в костном мозге определяли абсолютное количество незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов (по способу-прототипу) и число гранулоцитарных колониеобразующих единиц (КОЕ-Г) в костном мозге с помощью метода клонирования в полувязкой среде [6].
В ходе исследований введение рчГ-КСФ достоверно повышало уровень содержания нейтрофилов в периферической крови до 237,9% от контрольных значений. При этом описанные изменения явились отражением возрастания содержания КОЕ-Г в костном мозге до 608,6% от контрольных значений и числа незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в гемопоэтической ткани (до 243,8% и 116,5% от контрольных значений соответственно) (табл.1).
Таблица 1 | ||||
Показатели гранулоцитарного ростка кроветворения при введении рчГ-КСФ на фоне миелосупрессии, вызванной циклофосфаном, (Х±m) | ||||
Показатели | Нейтрофилы периферической крови, 109/л | Незрелые нейтрофильные гранулоциты в костном мозге, ×10 6/ бедро | Зрелые нейтрофильные гранулоциты в костном мозге, ×106/ бедро | КОЕ-Г в костном мозге, ×105 миелокариоцитов |
Фон | 3,89±0,16 | 1,33±0,3 | 3,64±0,21 | 5,8±0,29 |
Контроль | 0,87±0,04* | 3,22±0,6* | 2,97±0,17* | 0,21±0,03* |
рчГ-КСФ | 2,07±0,21*# | 7,85±1,2* # | 3,46±0,09# | 3,45±0,07*# |
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05 | ||||
# - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05 |
Таким образом, рчГ-КСФ приводил к увеличению числа нейтрофилов в периферической крови более чем на 150% от контрольных значений, отражающему и соответствующему высокой интенсивности репаративных процессов в костном мозге, вызванном введением данного препарата.
Пример 2.
Определяли специфическую (гранулоцитопоэзстимулирующую) активность субстанции глюкуроновой кислоты (фармацевтическая компания «Поиск», Томск).
Для тестирования активности субстанции использовали мышей линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Все животные получали однократно внутрибрюшинно 5-фторурацил в максимально переносимой дозе (228 мг/кг) в 0,2 мл физиологического раствора. Через 24 ч после инъекции цитостатика опытным мышам начинали вводить раствор субстанции глюкуроновой кислоты в дозе 30 мг/кг в объеме 0,2 мл внутривенно, ежедневно в течение 3-х дней. В качестве растворителя использовали физиологический раствор. Контрольные животные после введения цитостатика получали трехкратно в эквивалентном объеме растворитель.
На 4-е сутки после введения 5-фторурацила у мышей обеих групп производили забор периферической крови для определения абсолютного количества нейтрофилов. При этом для подтверждения уровня активности гиперпластических процессов в костном мозге определяли абсолютное количество незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов (по способу-прототипу) и число гранулоцитарных колониеобразующих единиц (КОЕ-Г) в костном мозге с помощью метода клонирования в полувязкой среде [6].
В ходе исследований введение глюкуроновой кислоты достоверно повышало уровень содержания нейтрофилов в периферической крови до 159,1% от контрольных значений. При этом в костном мозге, в отличие от контроля, отмечалось появление КОЕ-Г и регистрировалось возрастание числа незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в гемопоэтической ткани (до 241,2% и 158,3% от контрольных значений соответственно) (табл.2).
Таблица 2 | ||||
Показатели гранулоцитарного ростка кроветворения при введении рчГ-КСФ на фоне миелосупрессии, вызванной 5-фторурацилом, (Х+m) | ||||
Показатели | Нейтрофилы периферической крови, 109/л | Незрелые нейтрофильные гранулоциты в костном мозге, × 10 6/ бедро | Зрелые нейтрофильные гранулоциты в костном мозге, × 106/ бедро | КОЕ-Г в костном мозге, на 10 5 миелокариоцитов |
Фон | 3,89±0,16 | 1,33±0,3 | 3,64±0,21 | 5,8±0,29 |
Контроль | 0,22±0,02* | 0,97±0,04 | 1,45±0,11* | 0,0±0,0 |
Глюкуроновая кислота | 0,35±0,02*# | 2,34±0,03# | 2,3±0,09*# | 2,6±0,09*# |
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05 | ||||
# - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05 |
Таким образом, глюкуроновая кислота приводила к увеличению числа нейтрофилов в периферической крови более чем в 1,5 раза, сопровождавшемуся возрастанием интенсивности гиперпластических процессов в костном мозге, вызванным введением данного препарата, также регистрируемым способом-прототипом.
Пример 3.
Определяли специфическую (гранулоцитопоэзстимулирующую) активность жидкого экстракта шлемника байкальского (ЭШБ), полученного из ГНЦЛС (Харьков, Украина).
Для тестирования активности субстанции использовали мышей линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Все животные получали однократно внутрибрюшинно циклофосфан в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) в 0,2 мл физиологического раствора. Через 24 ч после инъекции цитостатика опытным мышам начинали вводить зондом per os раствор экстракта шлемника байкальского в дозе 1 мл/кг в объеме 0,2 мл, ежедневно в течение 9-ти дней. Контрольные животные после введения цитостатика получали в течение 9-ти дней эквивалентный объем физиологического раствора.
На 10-е сутки после введения циклофосфана у мышей обеих групп производили забор периферической крови для определения абсолютного количества нейтрофилов. При этом для подтверждения уровня активности гиперпластических процессов в костном мозге определяли абсолютное количество незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов (по способу-прототипу) и число гранулоцитарных колониеобразующих единиц (КОЕ-Г) в костном мозге с помощью метода клонирования в полувязкой среде [6].
В ходе исследований введение экстракта шлемника байкальского достоверно повышало уровень содержания нейтрофилов в периферической крови до 123,0% от контрольных значений. При этом в костном мозге не регистрировалось статистически значимых изменений содержания КОЕ-Г по сравнению с контрольными значениями и числа незрелых нейтрофильных гранулоцитов в гемопоэтической ткани. В то же время имела место тенденция к снижению количества зрелых нейтрофильных гранулоцитов, но не достигающая статистической значимости (табл.3).
Таблица 3 | ||||
Показатели гранулоцитарного ростка кроветворения при введении экстракта шлемника байкальского на фоне миелосупрессии, вызванной циклофосфаном, (Х±m) | ||||
Показатели | Нейтрофилы периферической крови, 10 9/л | Незрелые нейтрофильные гранулоциты в костном мозге, × 106/ бедро | Зрелые нейтрофильные гранулоциты в костном мозге, × 106/ бедро | КОЕ-Г в костном мозге, на 105 миелокариоцитов |
Фон | 3,89±0,16 | 1,33±0,3 | 3,64±0,21 | 5,8±0,29 |
Контроль | 0,87±0,04* | 3,22±0,6* | 2,97±0,17* | 0,21±0,03* |
ЭШБ | 1,07±0,05*# | 3,85±1,01* | 2,85±0,08 | 0,25±0,1* |
* - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05 | ||||
# - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05 |
Таким образом, экстракт шлемника байкальского приводил к увеличению числа нейтрофилов в периферической крови, но менее чем в 1,5 раза от контроля. При этом не отмечалось возрастания интенсивности регенераторных процессов в костном мозге, определяемых как по способу-прототипу, так и с помощью более чувствительных культуральных методов. В связи с этим можно утверждать, что выявленное увеличение количества нейтрофилов в периферической крови являлось результатом активации определенных перераспределительных механизмов и не было связано со специфической гранулоцитопоэзстимулирующей активностью исследуемого вещества.
Таким образом, увеличение количества нейтрофилов в периферической крови до 150% и более после введения средств, планируемых к применению в качестве стимуляторов гранулоцитопоэза, на фоне моделирования гипоплазии кроветворения у экспериментальных животных (мышей) путем однократного введения цитостатика в максимально переносимой дозе (циклофосфана либо 5-фторурацила) является достоверным и простым в методическом плане критерием оценки гранулоцитопоэзстимулирующей активности веществ.
Предлагаемый способ позволяет достоверно и просто определять наличие гранулоцитопоэзстимулирующей активности.
Литература
1. Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е. и др. Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ. // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. - 2002. - №1(9). - С.29-32.
2. Гершанович М.Л. Осложнения при химио- и гормонотерапии злокачественных опухолей. - М.: Медицина, 1982. - 224 с.
3. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. и др. Механизмы гемостимулирующего эффекта гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при цитостатическом воздействии. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1999. - №8. - С.194-199.
4. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. - Новосибирск: Наука, 1989. - 344 с.
5. Дыгай A.M., Клименко Н.А. Воспаление и гемопоэз. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 276 с.
6. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.
Класс G01N33/15 медицинских препаратов