способ прогнозирования хронического течения урогенитальной гонококковой инфекции

Формула изобретения

Способ прогнозирования хронического течения урогенитальной гонококковой инфекции путем выявления наличия возбудителя и определения факторов персистенции микроорганизмов, отличающийся тем, что определяют количество сопутствующих возбудителю грибов рода Candida, а также наличие у них факторов персистенции - антилизоцимной и антикомплементарной активностей и при титре грибов рода Candida не менее 10² колониеобразующих клеток в миллилитре, и при проявлении одновременно антилизоцимной активности не менее 1,3 микрограмм в миллилитре на единицу оптической плотности и антикомплементарной активности не менее 1,5·10 ⁶ антилитических единиц комплемента диагностируют хроническое течение урогенитальной инфекции.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской микробиологии, а именно к способам прогнозирования течения инфекционно-воспалительных заболеваний урогенитального тракта.

В частности, способ предназначен для прогнозирования затяжного течения урогенитальной инфекции, этиологическим агентом, который является гонококк (Nesseria gonorrhoeae), а также направлен на оценку вероятности возникновения инфекционно-воспалительных осложнений при урогенитальной гонорее.

Гонококковая инфекция остается одной из основных инфекций, передающихся половым путем [1, 7]. Росту заболеваемости гонореей способствуют увеличение вялотекущих хронических форм, которые трудно поддаются выявлению и приводят к еще большему распространению инфекции, а также к развитию тяжелых осложнений - воспалительных заболеваний органов малого таза, нередко приводящих к мужскому и женскому бесплодию [2].

Учитывая сказанное, становится очевидной необходимость эффективного способа прогнозирования хронического течения гонококковой инфекции и возможных осложнений, чтобы предупредить их своевременной оптимальной терапией.

Известен способ прогнозирования неблагоприятного течения гнойно-воспалительного заболевания микробной этиологии, где из пробы материала выделяют чистую культуру возбудителя, которую затем идентифицируют и определяют ее способность к инактивации факторов естественной противоинфекционной резистентности, а именно определяют активность комплемента по 50%-ному гемолизу на агаровых пластинах в супернатанте культуральной жидкости возбудителя и в незаселенной питательной среде и при выявлении способности возбудителя деградировать комплемент хозяина прогнозируют хроническое течение инфекционного процесса [3]. Указанный способ разработан преимущественно для хирургических инфекций, этиологическим агентом которых являлись условно-патогенные микроорганизмы - стафилококки или кишечная палочка, и не предназначен для нейсериальных инфекций.

Известен способ прогнозирования течения урогенитальной гонореи, основанный на способности возбудителя инактивировать факторы местного иммунитета, что приводит к длительному сохранению микроорганизма в клетках хозяина [4]. Способ заключается в том, что оценивают соотношение антикомплементарной активности гонококка, определяемое процентом подавления комплементзависимого гемолиза эритроцитов в присутствии эталонного количества сывороточного комплемента, вызывающего 100% гемолиз, а также активности местной системы комплемента мочеполового тракта, определяемое процентом гемолиза сенсибилизированных эритроцитов, которое вычисляют по формуле (антикомплементарная активность) / (активность комплемента), и при значении данного соотношения менее 1 ожидают непродолжительное и/или неосложненное течение заболевания, при значениях соотношения, большем или равном 1, прогнозируют затяжное течение заболевания с вероятностью возникновения инфекционно-воспалительных осложнений. По совокупности признаков данный способ является наиболее близким заявляемому. Данный способ взят в качестве прототипа.

В указанном способе осуществляется комплексный подход к анализу взаимоотношений «возбудитель - макроорганизм», что позволяет прогнозировать характер течения инфекции.

Однако прогнозировать течение гонококковой инфекции с помощью указанного способа возможно только при условии, что диагноз гонореи поставлен бактериологическим (культуральным) методом. Недостатком способа является необходимость культуральной диагностики гонореи, что сопряжено со сложностями, вызванными высокой требовательностью возбудителя к условиям культивирования - богатые питательные среды, микроаэрофильные условия, отсутствие конкурентной микрофлоры в исследуемом материале, наличие некультивируемых форм, подверженность колоний аутолизу [4]. Таким образом, у некоторой части больных с гонококковой инфекцией не удается выделить чистую культуру возбудителя, либо однократно выделенная она теряется при пересевах и, следовательно, становится невозможным определение свойств гонококка.

Повторная попытка выделить чистую культуру нецелесообразна ввиду назначения антибиотикотерапии. Поэтому, несмотря на то, что диагноз гонореи подтвержден (что возможно как культуральным, так и микроскопическим методом - согласно приказа М3 РФ №415 от 20.08.2003) [5], прогноз сделать не представляется возможным. Следствием является то, что с помощью этого способа часть пациентов с вероятным хроническим течением гонококковой инфекции не выявляется.

Основной задачей предлагаемого способа является повышение точности прогнозирования течения урогенитальной гонококковой инфекции.

Для решения указанной задачи в предлагаемом способе прогнозирования хронического течения урогенитальной гонококковой инфекции, включающем выявление наличия возбудителя и определение факторов персистенции микроорганизмов, определяют количество сопутствующих возбудителю грибов рода Candida, а также наличие у них факторов персистенции - антилизоцимной и антикомплементарной активностей и при титре грибов рода Candida не менее 10 ² колониеобразующих клеток в миллилитре, и при проявлении одновременно антилизоцимной активности не менее 1,3 микрограмм в миллилитре на единицу оптической плотности и антикомплементарной активности не менее 1,5·10⁶ антилитических единиц комплемента диагностируют хроническое течение урогенитальной инфекции.

Предлагаемый способ не известен из уровня техники, то есть является новым.

Новизной предлагаемого способа является то, что при обнаружении гонококка одновременно высеваются сопутствующие грибы рода Candida и у сопутствующих микроорганизмов оценивают факторы персистенции, которые являются информативными критериями для прогнозирования течения урогенитальной гонореи.

Существенным отличием предлагаемого способа является то, что оценивают не свойства возбудителя, а характеристики сопутствующей микрофлоры, а именно высеянных грибов рода Candida и при титре грибов не менее 10² колониеобразующих клеток в миллилитре и при проявлении одновременно антилизоцимной активности не менее 1,3 микрограмм в миллилитре на единицу оптической плотности и антикомплементарной активности не менее 1,5·10 ⁶ антилитических единиц комплемента диагностируют хроническое течение урогенитальной инфекции.

Достигаемый при осуществлении способа технический результат состоит в том, что новый способ прогнозирования позволяет, исключив определение факторов персистенции возбудителя (гонококка), что трудоемко и нестабильно из-за его прихотливости, проводить прогнозирование хронического течения урогенитальной гонококковой инфекции по факторам персистенции сопутствующей симбионтной микрофлоры - грибов рода Candida, определение которых существенно проще, надежнее, так как имеет лучшую воспроизводимость, не зависящую от проводимой у пациента антибиотикотерапии. Заявляемый способ не требует специального оборудования и доступен для любой бактериологической лаборатории.

Таким образом, точность прогноза предложенного способа повышается счет выявления тех пациентов, для которых по способу-прототипу было невозможно провести прогнозирование из-за невыделения конечной чистой культуры возбудителя, так как гонококк очень требователен к условиям культивирования, может быть ослаблен из-за проведенной пациенту на момент диагностирования антибиотикотерапии и даже находиться в некультивируемой форме.

Новыми признаками заявляемого способа являются:

- определяют количество сопутствующих возбудителю грибов рода Candida (установлен их граничный титр - не менее 10² колониеобразующих клеток в миллилитре);

- определяют у грибов рода Candida наличие факторов персистенции - антилизоцимной и антикомплементарной активностей (установлено необходимое одновременное наличие антилизоцимной активности на уровне не менее 1,3 микрограмм в миллилитре на единицу оптической плотности и антикомплементарной активности на уровне не менее 1,5·10⁶ антилитических единиц комплемента), при которых диагностируют хроническое течение урогенитальной инфекции.

Наличие первого нового признака в заявляемом способе позволяет выявить новый более информативный признак прогнозирования хронического течение урогенитальной гонококковой инфекции, что в итоге позволяет повысить точность прогнозирования. Практика лечения показала, что у пациентов с хронической гонококковой инфекцией существенно снижены иммунные свойства организма, что влечет за собой дополнительную повышенную колонизацию урогенитального тракта симбионтными микроорганизмами, в первую очередь грибами рода Candida до уровня не менее 10² колониеобразующих клеток в миллилитре.

Второй новый признак позволяет уточнить первый новый признак за счет установления одновременного наличия двух граничных значений: антилизоцимной активности грибов рода Candida и их антикомплементарной активности. Каждый из этих факторов косвенно отражает степень снижения иммунных свойств организма пациента, а вместе эти факторы в итоге позволяют при простой реализации повысить точность прогноза.

В основу предлагаемого способа положено новое знание, полученное в результате экспериментальных исследований грибково-бактериальных взаимодействий в биоценозе урогенитального тракта при гонококковой инфекции. Обнаружилось, что внеклеточные факторы грибов рода Candida в значительном проценте случаев повышают персистентные свойства Neisseriae gonorhoea, а именно антилизоцимную и антикомплементарную активности (табл.1).

Таблица 1.
Изменение свойств гонококка по сравнению с исходным уровнем.
Воздействующий фактор	Свойства гонококка
	АЛА			АКА
	повышение	понижение	отсутствие	повышение	понижение	отсутствие
Супернатант грибов рода Candida	84,5%	2,82%	12,7%	45,1%	4,2%	50,1%

Также новым знанием были выявленные особенности микробиоценоза репродуктивного тракта пациентов с хронической гонококковой инфекцией по сравнению со свежей. У больных с хронической гонореей одновременно с гонококком выделялись грибы р. Candida, при этом и возбудитель и симбионты обладали высокими персистентными свойствами - АЛА и АКА. Учитывая известный факт, что высокая способность гонококка истощать факторы естественной резистентности организма приводит к хронизации инфекционного процесса [6], а также впервые полученные сведения о наличии и свойствах симбионтов, было сделано предположение, что грибы р. Candida, повышая персистентные свойства нейссерий и истощая защитные силы макроорганизма, оказывают синергидное с возбудителем действие на колонизационную резистентность слизистой урогенитального тракта, способствуя хронизации процесса.

Это позволило предположить, что обнаружение вместе с гонококком грибов рода Candida с высокими персистентными свойствами при свежей гонорее может служить информативным прогностическим критерием хронизации процесса. Дальнейшие клинико-лабораторные исследования подтвердили это предположение и выявили пороговые значения предлагаемых параметров (табл.2)

Таблица 2.
Соответствие уровней исследуемых показателей характеру течения заболевания.
Характеристика грибов рода Candida
Количество грибов	АЛА	АКА
<10 2 КОЕ/мл	<1,3 мкг/мл	<1,5·106 АнтиЛЕК
102 КОЕ/мл	<1,3 мкг/мл	<1,5·106 АнтиЛЕК
102 КОЕ/мл	<1,3 мкг/мл	1,5·106 АнтиЛЕК
102 КОЕ/мл	1,3 мкг/мл	<1,5·10 6 АнтиЛЕК
<102 КОЕ/мл	1,3 мкг/мл	<1,5·10 6 АнтиЛЕК
<102 КОЕ/мл	<1,3 мкг/мл	1,5·106 АнтиЛЕК
<102 КОЕ/мл	1,3 мкг/мл	1,5·106 АнтиЛЕК
102 КОЕ/мл	1,3 мкг/мл	1,5·106 АнтиЛЕК
Примечание - *	Принятые сокращения: СГИ - свежая гонококковая инфекция; ХГИ - хроническая гонококковая инфекция.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Для проведения прогнозирования течения урогенитальной гонореи патологический материал (отделяемое уретры, цервикального канала) высевают на элективные среды. Общепринятым методом выделяют чистую культуру возбудителя, которую идентифицируют по морфологическим, тинкториальным, биохимическим свойствам до вида как N. gonorrhoeae; 0,1 мл патологического материала разводят до 10^-1, 10 ^-2, 10^-3 и стерильными шпателями делают посев по 0,1 мл полученной взвеси на разные чашки Петри с Кандида-агаром. Посевы инкубируют при 30°С в течение 48 часов. Выделенную культуру грибов по совокупности культуральных, морфологических и сахаролитических свойств идентифицируют как грибы рода Candida. Выросшие на чашке Петри колонии подсчитывают и, умножая на 100 и на степень разведения патологического материала (10, 100, 1000 соответственно), вычисляют количество (титр) грибов в одном миллилитре материала. Для прогноза течения заболевания по известным методикам также определяют Антилизоцимную и антикомплементарную активности [8].

Прогноз хронического течения урогенитальной инфекции делают, если иттр грибов рода Candida не менее 10 ² колониеобразующих клеток в миллилитре, и при проявлении одновременно антилизоцимной активности не менее 1,3 микрограмм в миллилитре на единицу оптической плотности и антикомплементарной активности не менее 1,5·10⁶ антилитических единиц комплемента.

Пример 1. У больного М., 35 лет (амбулаторная карта №1121 за 2004 г.) с диагнозом «Свежая гонорея; подострый передний уретрит» на шестой день заболевания при первичном обращении был осуществлен забор отделяемого из уретры в объеме 0,1 мл, в пробирку с 0,9 мл 0,9 процентного раствора натрия хлорида. Из этой пробирки взвесь, в которой является разведением 10 ^-1, был перенесен 0,1 мл взвеси в другую пробирку вместе с 0,9 мл 0,9 процентного раствора натрия хлорида. Таким образом, было получено разведение 10^-2. Аналогично получали разведения 10^-3 и 10 ^-4. По 0,1 мл из каждой пробирки наносили на чашки Петри с Кандида-агаром с помощью стерильных шпателей. На чашках после 48 часовой инкубации при температуре 30°С сформировались типичные колонии беловато-желтого цвета с куполообразным возвышением, они были выделены в чистую культуру и идентифицированы по совокупности культуральных, морфологических и сахаролитических свойств как грибы рода Candida.

С целью уточнения прогноза течения заболевания было подсчитано число колоний в тех чашках, где при максимальном разведении наблюдался рост Candida. У выделенной культуры были определены антилизоцимная и антикомплементарная активности. Для этого готовилась суточная культура грибов, которую стандартной бактериологической петлей засевали в 3 мл жидкой питательной среды - питательный бульон (ПБ) (Питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой; НПО "Питательные среды", г.Махачкала). Культивировали при 37°С 24 ч. На спектрофотометре СФ-46 (длина волны 540 нм) измеряли оптическую плотность бульонной культуры против питательного бульона (Y). Супернатант отделяли от бактериальных клеток центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин. Для определения антилизоцимной активности микроорганизмов в качестве тест - штамма использовали суточную агаровую культуру Micrococcus lysodeikticus NCTC 2665. Выросшие бактериальные клетки тест-штамма убивали хлороформом в течение 60 минут, смывали, фильтровали через крупнопористый фильтр, дважды отмывали 0,2 М фосфатным буфером с трилоном Б и один раз 0,2 М фосфатным буфером (рН=6,2), затем оптическую плотность суспензии микрококка доводили до 0,300.

На 0,2 М фосфатном буфере (рН=6,2) готовили раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл.

Супернатант исследуемых культур микроорганизмов объемом 0,9 мл смешивали с 0,1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубировали 40-60 мин при температуре 37°С. Затем 0,5 мл смеси супернатанта и лизоцима добавляли к 2,0 мл суспензии тест-штамма Microccocus lysodeikticus и измеряли оптическую плотность полученной смеси через 30 и 150 с на спектрофотометре СФ-46 (длина волны 540 нм) против 0,2 М фосфатного буфера.

В качестве контроля использовали смесь питательного бульона с лизоцимом в соотношении 9:1.

По степени лизиса суспензии тест-культуры расчитывали антилизоцимную активность исследуемой культуры по формуле

где А - антилизоцимная активность, нг инактивированного лизоцима/(мл супернатанта^· ед. оптической плотности бульонной культуры);

V₁ - объем (0,1 мл) раствора лизоцима исходной концентрации (20000 нг/мл);

V₂ - объем (0,9 мл) супернатанта бульонной культуры исследуемого штамма;

С - исходная концентрация лизоцима (20000 нг/мл);

Y - оптическая плотность бульонной культуры исследуемого штамма, ед. оптической плотности;

D₀ - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 с;

D_K - изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 с.

Антикомплементарную активность микроорганизмов определяли следующим образом. Источником комплемента служил препарат для РСК. Вероналовый буфер и сенсибилизированные эритроциты барана (СЭБ) готовили стандартно [Кэбот Е., Мейер М., 1968]. Для определения максимальной скорости лизиса применяли спектрофотометр СФ-46, в процессор которого вводили экспериментально полученный калибровочный коэффициент 167,9, позволяющий в режиме А(3) с периодом измерения 10 с получать значения скорости лизиса в млн. СЭБ/мл (10⁶ ЛЕК) в секунду, где ЛЕК-литическая единица комплемента. Реакции проводили при 37°С в 1 см кювете, объем проб - 3 мл, длина волны - 800 нм. 50 мкл супернатанта суточной бульонной культуры исследуемых микрооргнаизмов смешивали с равным объемом сыворотки - источника комплемента, и термостатировали при 37°С в течение 30 мин, затем добавляли 2,7 мл охлажденного (при 4°С) вероналового буфера, пробирку прогревали на водяной бане в течение 3 мин при 37°С, добавляли 200 мкл суспензии сенсибилизированных эритроцитов в концентрации 1,5·10⁸ СЭБ/мл, перемешивали, переносили содержимое в кювету и немедленно начинали измерение скорости лизиса эритроцитов до ее максимального значения. Результат сравнивали с контролем (вместо супернатанта - бульон), разницу пересчитывали на единицу оптической плотности культуры (540 нм). Антикомплементарную активность выражали в антилитических единицах комплемента.

В данном примере титр грибов в материале больного не превышал 10 колониеобразующих клеток на миллилитр (рост только в первой чашке Петри), антилизоцимная и антикомплементарная активности микроорганизмов были 1,25 микрограмм в миллилитре на единицу оптической плотности и 1,5·10⁶ антилитических единиц комплемента, что не позволяло прогнозировать продолжительное течение воспалительного процесса. Правильность прогноза подтвердилась дальнейшим течением заболевания. Проведенные клинические и лабораторные (отрицательные бактериоскопия и посев урогенитального отделяемого) исследования после однократного курса антибиотикотерапии, а также повторные двукратные клинико-лабораторные обследования с интервалом один месяц позволили снять больного с учета.

Пример 2. Больной Ш., 28 лет, обратился в ОКВД (амбулаторная карта №2371 за 2005 г.) с жалобами на скудные выделения из уретры, учащенные позывы на мочеиспускание. Болен в течение пяти недель. Самостоятельно не лечился. Заболевание связывает с половым контактом. В посеве из уретры выделен гонококк. С диагнозом «свежая гонококковая инфекция; торпидный передний уретрит» больному был назначен курс антибактериальной терапии. С целью уточнения прогноза заболевания был осуществлен посев отделяемого уретры на Кандида-агар методом серийных разведений. Титр выросших колоний составил 10 ³ колониеобразующих клеток в миллилитре; культура идентифицирована как род Candida и определена ее антилизоцимная и антикомплементарная активности, для чего были выполнены действия, аналогичные описанным в методиках предыдущего примера. В результате антилизоцимная активность составила 1,8 микрограмм в миллилитре на единицу оптической плотности, а антикомплементарная активность - 1,5·10 ⁶ антилитических единиц комплемента.

Таким образом, как титр грибов, так и величина их персистентных свойств превышала экспериментально и статистически выявленные пороговые значения показателей хронизации процесса. С помощью заявляемого способа был сделан прогноз развития хронической гонореи, что и подтверждилось клинико-лабораторными наблюдениями. При проведении повторного после лечения лабораторного контроля в отделяемом уретры вновь выявлены гонококки. С диагнозом «Хроническая гонорея; торпидный тотальный уретрит; хронический простатит» больному был назначен дополнительный курс антибиотикотерапии с использованием препаратов, воздействующих на неспецифическую реактивность организма. Клинико-лабораторные наблюдения этого больного продлилось, таким образом, до 4,5 месяцев, когда двукратные лабораторные исследования дали отрицательный результат.

Анализируя клинико-лабораторные данные ведения 65 пациентов, авторами был сделан вывод о высокой точности (надежности) прогностических критериев заявляемого способа прогнозирования хронического течения урогенитальной гонококковой инфекции по сравнению со способом-прототипом (табл.3). Способ прост, не требует сложного оборудования и доступен для всех бактериологических лабораторий.

Таблица 3.
Сравнительный анализ точности заявляемого способа и способа прототипа при неблагоприятном течении урогенитальной гонореи.
Наименование характеристики	Прототип	Предлагаемый способ
Количество обследуемых, чел.	65
Выделено чистых культур гонококка	65
Количество культур гонококка, у которых определены свойства	53*
Число сделанных прогнозов	16	20
Число подтвердившихся прогнозов	21
Точность прогноза	76,2%	95,2%
Примечание - * 12 штаммов при повторном пересеве не выросли.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Борисов С.Д., Дерябин Д.Г, Минаков А.А, Михайленко С.В., Окшин A.M., Лапина И.А. Смешанная урогенитальная инфекция в контексте проблемы сохранения репродуктивного здоровья. В: В.М. Боев (ред.) Среда обитания и здоровье населения. Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Оренбург, 2001, с.73-76.

2. Бухарин О.В., Иванов Ю.В., Кузьмин М.Д., Михайленко С.В. Характеристики изменений в микробиценозе у пациентов с хроническим неспецифическим уретритом. Журн. микробиол., 2001, 4: 86-90.

3. (19) RU (11) 2111493 (13) С1, (51) 6 G01N 33/543, 33/558. Способ прогнозирования неблагоприятного течения гнойно-воспалительного заболевания микробной этиологии.

4. Прототип (19) RU (11) 2161312 (13) С2, (51) 7 G01N 33/571. Способ прогнозирования течения урогенитальной гонореи.

5. Приказ М3 РФ №415 «Гонококковая инфекция» от 20.09.03, Москва.

6. Воронина Л.Г. Совершенствование диагностики, прогнозирования и лечения гонореи под контролем антилизоцимного признака гонококков. // Дисс....докт. мед наук. - Оренбург, 1998. - 222.

7. Fetners K. Is bacterial vaginosis a sexually transmitted infection. J. Sex. Transm. Infect. 2001, 77(5): 390.

8. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. - М.: Медицина. - Екатеринбург: УрО РАН. - 1999. ISB №5. - 7691-0689-4.