способ продуцирования стрептокиназы с использованием генетически модифицированного escherichia coli

Формула изобретения

1. Генетически сконструированный штамм E.coli PSK4 для продуцирования стрептокиназы, депонированный в Коллекции типовых микробных культур Института микробной технологии, г.Чандигар, Индия, под номером доступа МТСС 5120.

2. Генетически сконструированный штамм по п.1, который обладает нижеследующими типичными характеристиками:

a) несет рекомбинантную плазмиду длиной 4,3 т.п.о.;

b) рекомбинантная плазмида содержит фрагмент гена, кодирующего стрептокиназу; и

c) несет маркер устойчивости к канамицину, сообщающий устойчивость к канамицину.

3. Состав среды для выращивания штамма по п.1, пригодной для продуцирования стрептокиназы, который содержит фосфат калия в концентрации 5-20 г/л, фосфат аммония в концентрации 2-6 г/л, сульфат магния в концентрации 1-3 г/л, лимонную кислоту в концентрации 1-2 г/л, EDTA в концентрации 5-10 мг/л, хлорид кобальта в концентрации 2-4 мг/л, хлорид марганца в концентрации 10-20 мг/л, хлорид меди в концентрации 0,5-2,5 мг/л, борную кислоту в концентрации 2-5 мг/л, молибдат натрия в концентрации 1-5 мг/л, ацетат цинка в концентрации 5-25 мг/л, хлорид железа в концентрации 50-100 мг/л, гидрохлорид тиамина в концентрации 4-8 мг/л и глицерин в качестве источника углерода.

4. Способ продуцирования внутриклеточной стрептокиназы с использованием генетически модифицированного штамма E.coli PSK4 (МТСС 5120), который включает нижеследующие стадии:

a) адаптацию генетически модифицированного штамма E.coli с № доступа МТСС 5120 в питательной среде, содержащей источник углерода, основные соли и микроэлементы, для получения посевной культуры;

b) добавление посевной культуры со стадии (а) к ферментационной среде и ферментацию указанной культуры в течение периода времени от 8 до 12 ч при непрерывном встряхивании;

c) добавление индуктора к ферментационной среде со стадии (b) и ферментацию среды в течение еще 3-5 ч для получения включений; и

d) сбор, лизис и ресолюбилизацию включений со стадии (с) для получения стрептокиназы.

5. Способ по п.4, в котором на стадии (а) питательная среда содержит фосфат калия в количестве 5-20 г/л, фосфат аммония в количестве 2-6 г/л, сульфат магния в количестве 1-3 г/л, лимонную кислоту в количестве 1-2 г/л, EDTA в количестве 5-10 мг/л, глицерин в количестве 10-35 г/л, 1-10 мл раствора микроэлементов, содержащего ничтожно малые количества хлорида кобальта, хлорида марганца, хлорида меди, борной кислоты, молибдата натрия, ацетата цинка, хлорида железа, гидрохлорида тиамина.

6. Способ по п.4, в котором на стадии (b) ферментационная среда содержит фосфат калия в количестве 5-20 г/л, фосфат аммония в количестве 2-6 г/л, сульфат магния в количестве 1-3 г/л, лимонную кислоту в количестве 1-2 г/л, EDTA в количестве 5-10 мг/л, глицерин в количестве 10-35 г/л, хлорид кобальта в количестве 2-4 мг/л, хлорид марганца в количестве 10-20 мг/л, хлорид меди в количестве 0,5-2,5 мг/л, борную кислоту в количестве 2-5 мг/л, молибдат натрия в количестве 1-5 мг/л, ацетат цинка в количестве 5-25 мг/л, хлорид железа в количестве 50-100 мг/л, гидрохлорид тиамина в количестве 4-8 мг/л.

7. Способ по п.4, в котором на стадии (b) ферментацию осуществляют методом оптимизированной периодической ферментации или периодической ферментации с подпиткой.

8. Способ по п.4, в котором на стадии (b) и (с) время ферментации находится в пределах 8-17 ч.

9. Способ по п.4, в котором на стадии (b) показатель рН среды находится в пределах 6-8.

10. Способ по п.4, в котором на стадии (b) температура находится в пределах 30-40°С.

11. Способ по п.4, в котором на стадии (b) температура находится в пределах 35-39°С.

12. Способ по п.4, в котором на стадии (b) встряхивание осуществляют в шейкере со скоростью вращения 700-900 об./мин.

13. Способ по п.4, в котором на стадии (b) концентрация растворенного кислорода составляет примерно 5-20%.

14. Способ по п.13, в котором концентрация растворенного кислорода составляет примерно 10%.

15. Способ по п.7, который представляет собой периодическую ферментацию с подпиткой с добавлением питательных веществ на одной или нескольких промежуточных стадиях ферментации.

16. Способ по п.15, в котором питательные вещества добавляют на двух промежуточных стадиях ферментации с промежутком времени между ними, равным примерно 40-60 мин.

17. Способ по п.16, в котором питательные вещества содержат глицерин в количестве 600-900 г/л, EDTA в количестве 10-15 мг/л, хлорид кобальта в количестве 3-5 мг/л, хлорид марганца в количестве 15-30 мг/л, хлорид меди в количестве 2-5 мг/л, борную кислоту в количестве 3-8 мг/л, молибдат натрия в количестве 2-7 мг/л, ацетат цинка в количестве 5-25 мг/л, хлорида железа в количестве 50-100 мг/л.

18. Способ по п.4, в котором индуктор, добавляемый на стадии (с), является изопропилтиогалактозидом (IPTG).

19. Способ по п.18, в котором индуктор добавляют в количестве 0,01-10 мМ после образования клеточной биомассы в количестве 7-18 г массы клеток в сухом состоянии/л.

20. Способ по п.4, в котором на стадии (d) сбор биомассы осуществляют центрифугированием и/или микрофильтрацией.

21. Способ по п.4, в котором на стадии (d) лизис включений осуществляют при помощи химического лизиса, обработки ультразвуком, шаровой мельницы или деструкции клеток под давлением.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу продуцирования стрептокиназы с использованием генетически сконструированного штамма E.coli PSK4, депонированного в Коллекцию типовых микробных культур Института микробной технологии, г. Чандигар, Индия, под номером доступа МТСС 5120, который сверхпродуцирует стрептокиназу внутри клетки. В частности, способ, рассмотренный в настоящем описании изобретения, представляет собой усовершенствование ферментативного продуцирования стрептокиназы с использованием оптимизированной питательной среды, состоящей в основном из простых солей и микроэлементов. Таким образом, способ по настоящему изобретению является усовершенствованным и более экономичным способом продуцирования стрептокиназы, который может найти применение в тромболитической терапии.

Уровень техники

Стрептокиназа, которая является эффективным активатором фибринолиза, обычно используется в клинической медицине для тромболитической терапии для лечения разных нарушений кровообращения, например легочной тромбоэмболии, глубокого тромбоза вен и инфаркта миокарда. Стрептокиназа оказывает фибринолитическое действие, активируя инертный зимоген крови, плазминоген (PG), активную сериновую протеазу, плазмин (PN), которые разрушают фибрин с образованием растворимых продуктов расщепления. Установлено, особенно в случае инфаркта миокарда, что при лечении данного заболевания стрептокиназа оказывает такое же эффективное действие, как и ее более дорогие тромборастворяющие альтернативы, такие как урокиназа (UK) и активатор плазминогена ткани (tPA). Пригодность стрептокиназы для тромболитической терапии хорошо обоснована. Можно привести ссылки на публикации Paques, E.P., 1986, Haemostasis, Vol. 16, Suppl. 3, 21; ISIS-3 (Третье международное исследование продолжительности жизни при инфаркте миокарда: рандомизированное сравнение стрептокиназы с активатором плазминогена ткани и анистреплазой, а также асприна и гепарина в 41299 случаях с подозрением на острый инфаркт миокарда) Collaborative Group, 1992, Lancet 339753.

Стрептокиназа является белком с простой цепью длиной 47 кДа, состоящим из 414 аминокислотных остатков (можно сделать ссылку на описание биохимических свойств стрептокиназы в обзорной статье Castellino, F.J., 1981, Chem. Rev., 81, 431). Стрептокиназа продуцируется естественным путем и секретируется разными штаммами гемолитических стрептококков вместе с несколькими другими нежелательными токсическими продуктами, такими как дезоксирибонуклеазы, стрептолизин или гиалуронидаза и протеазы, которые затрудняют процесс очистки требуемого белка. С другой стороны, до сих пор было невозможно получить генетически усовершенствованные штаммы из указанных хозяев из-за отсутствия разработанной методики переноса генов. С учетом терапевтической пригодности и клинического применения стрептокиназы в тромболитической терапии в прошлом были сделаны попытки найти альтернативный источник продуцирования стрептокиназы методами рекомбинантных ДНК. Можно сделать ссылку на публикации Malke and Ferretti, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Vol. 81, p.351, 1984; Hagenson et al., 1989, Enzyme and Microbial Technology, Vol. 11, 650; Estrada et al., 1992, Biotechnology, Vol. 10, 1138; кроме того, можно сделать ссылку на патенты США № 5296366, 5240845, 4764469, 2043953, патент Японии № 2020828, европейский патент № 489201 и патент Кубы № 90. При выполнении исследований, описанных в вышеуказанных публикациях и патентах, ген, кодирующий SK, выделяли из естественного хозяина, стрептококка, и клонировали в разных гетерологичных хозяевах, таких как E.coli, Bacillus и дрожжи.

Для улучшения выхода стрептокиназы ген, определяющий стрептокиназу С, А и G (можно сделать ссылку на публикации Huang et al., 1989, Molecular Microbiology, Vol. 2(3), 197; и Estrada et al., 1992, Biotechnology, Vol. 10, 1138), клонировали и экспрессировали в E.coli, а также в Streptococcus sanguis (можно сделать ссылку на публикацию Malke et al., 1984, Molecular and General Genetics, Vol. 1, 360). В обоих случаях был получен белок в количестве, равном соответственно 0,64 мг/л и 40 мг/л. В случае E.coli 94% выделенного белка находилось в периплазматическом пространсте и 6% в цитозоле, в то время как при использовании S.sanguis весь фермент был обнаружен во внеклеточном пространстве. Кроме того, многие клоны, продуцирующие стрептокиназу, были очень неустойчивыми вследствие летальной активности, обусловленной секрецией генного продукта или белка. В научной литературе недавно было описано внутриклеточное продуцирование стрептокиназы в E.coli (можно сделать ссылку на публикацию Xue-Wu Zhang et al., 1999, Enzyme and Microbial Technology, Vol. 24, 647), в результате которого было получено 300-400 мг/мл белка SK из одного литра культуры клеток E.coli с использованием богатой и комплексной среды для выращивания клеток.

Рекомбинантный штамм E.coli, созданный для сверхпродуцирования стрептокиназы, часто характеризуется низкой плотностью клеток и недостаточной биомассой, что влияет на общий выход белкового продукта. Компания Philips Petroleum (можно сделать ссылку на публикацию Hagenson et al., 1989, Enzyme and Microbial Technology, Vol. 11, 650) и кубинская научно-исследовательская группа (можно сделать ссылку на публикацию Estrada et al., 1992, Biotechnology, Vol. 10, 1138; и патент Кубы № 90) предприняли попытку продуцировать рекомбинантную стрептокиназу в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris и получили соответственно 1,8 мг/л и 1,0 г/л SK, применяя непрерывную ферментацию и богатую питательную среду, содержащую комплексные и дорогостоящие ингредиенты. В научной литературе было описано продуцирование 645 мг/л SK генетически сконструированным штаммом E.coli (можно сделать ссылку на публикацию Xue-Wu Zhang et al., 1999, Enzyme and Microbial Technology, Vol. 24, 647) в условиях ферментации с использованием богатой питательной среды.

Цель изобретения

Таким образом, главной целью настоящего изобретения является создание усовершенствованного и экономичного способа продуцирования стрептокиназы с использованием генетически сконструированного штамма E.coli, продуцирующего вышеуказанный белок внутри клетки.

Другой целью настоящего изобретения является получение фрагмента дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), несущего полную генетическую информацию для продуцирования стрептокиназы внутри клетки рекомбинантного штамма E.coli, полученного вышеуказанным способом, и получение экспрессирующей плазмидной ДНК (pSK4), несущей генетическую информацию для продуцирования стрептокиназы в приемлемом хозяине E.coli. В плазмиде pSK4 символ р означает плазмиду и SK означает стрептокиназу. Указанная плазмида была депонирована в Коллекцию типовых микробных культур Института микробной технологии под номером доступа МТСС 5120.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание способа получения большого количества клеточной биомассы генетически сконструированного штамма E.coli PSK4 (№ доступа МТСС 5120) при помощи ферментативных процессов для увеличения общего продуцирования стрептокиназы и выделения больших количеств стрептокиназы во время последующей обработки.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к созданию усовершенствованного и экономичного способа продуцирования стрептокиназы с использованием генетически сконструированного штамма E.coli PSK4, депонированного под международным номером доступа МТСС 5120, который содержит репликативный плазмидный вектор, способный внутриклеточно продуцировать стрептокиназу с высоким выходом. Полученная таким образом стрептокиназа обладает биологическими свойствами, такими как растворение тромбов и активация плазминогена, которые подобны природной стрептокиназе. Кроме того, был разработан способ ферментации культуры клеток рекомбинантного штамма E.coli с высокой плотностью клеток с использованием недорогого состава питательной среды, благодаря чему была получена большая клеточная биомасса, обеспечивающая более высокий выход стрептокиназы из клеточного экстракта. Следуя стадиям способа по настоящему изобретению, можно получить высокий выход стрептокиназы из культуры клеток E.coli (номер доступа МТСС 5120), которая является биологически активной и может быть использована в лечебных целях.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу продуцирования внутриклеточной стрептокиназы при помощи генетически сконструированного штамма E.coli (депонированного в Коллекцию типовых микробных культур Института микробной технологии, сектор 39-А, г. Чандигар - 160036, Индия, под номером доступа МТСС 5120), сверхпродуцирующего стрептокиназу внутри клетки, методом оптимизированной периодической ферментации и периодической ферментации с подпиткой с использованием простых и недорогих компонентов среды. Указанный способ включает

1. Получение фрагмента ДНК, несущего генетическую информацию для продуцирования стрептокиназы, методами рекомбинантных ДНК или синтеза известными методами.

2. Встраивание вышеуказанного фрагмента ДНК в приемлемый реплицируемый плазмидный вектор известными методами рекомбинантных ДНК с получением реплицируемого экспрессирующего плазмидного вектора, способного продуцировать стрептокиназу в приемлемом хозяине в соответствующих условиях.

3. Введение плазмидной ДНК, полученной на стадии 2, в соответствующую клетку-хозяина, такую как E.coli, B.subtilis или дрожжи.

4. Адаптация клетки-хозяина, полученной на стадии 3, к питательной среде определенного состава, состоящей из основных солей, микроэлементов и источника углерода.

5. Настройка аэрации растворенным кислородом в количестве 0-100%, перемешивание со скоростью 50-1000 об/мин и поддержание рН в пределах 5-8.

6. Добавление антибиотика, такого как канамицин, ампициллин и тому подобный, в количестве 1-1000 микрограммов/миллилитр в ферментер.

7. Добавление в ферментационную среду посевной культуры клетки-хозяина, несущей требуемую экспрессирующую плазмиду, в количестве 0,1-10%.

8. Культивирование в ферментере в течение периода времени от 6 до 24 часов.

9. Необязательное введение дополнительных питательных веществ в ферментационную среду через промежутки времени от 15 до 90 минут со скоростью от 100 мл/час до 1000 мл/час для увеличения выхода биомассы.

10. Добавление индуктора (IPTG) в количестве 0,01-10 мМ после образования достаточного количества клеток.

11. Сбор культуры клеток обычным центрифугированием и/или микрофильтрацией.

12. Лизис/разрушение клеток E.coli при помощи химического лизиса, обработки ультразвуком, шаровой мельницы или деструкции клеток под давлением.

13. Выделение и ресолюбилизация включений стрептокиназы из ферментационной среды.

14. Выделение и отделение белка стрептокиназы при помощи обычной хроматографии.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ, рассмотренный в данном описании изобретения, основан прежде всего на использовании генетически сконструированного штамма E.coli, несущего плазмидную ДНК, кодирующую продуцирование стрептокиназы, для высопродуктивного ферментативного продуцирования стрептокиназы с использованием питательной среды определенного состава и физиологических параметров, таких как аэрация, рН, условия индукции, подача питательных веществ и т.д. Крупномасштабное производство стрептокиназы с использованием рекомбинантных штаммов E.coli (№ доступа МТСС 5120) ранее осуществлялось с использованием комплексной питательной среды для выделения больших количеств стрептокиназы. Благодаря использованию специально созданной экспрессирующей плазмиды внутриклеточное продуцирование SK было достигнуто в условиях ферментации, позволяющих получить примерно 200-330 мг SK/л культуры клеток.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения фрагмент ДНК, несущий генетическую информацию для продуцирования стрептокиназы, выделяют из рекомбинантной плазмидной конструкции pJKD-21, несущей кассету открытой рамки считывания для продуцирования стрептокиназы.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения экспрессирующую плазмиду создают, получая вышеописанный фрагмент ДНК, несущий генетическую информацию для продуцирования стрептокиназы, известными методами рекомбинантных ДНК или методами синтеза, который встраивают в приемлемую реплицируемую плазмиду, такую как рЕТ-9А, известными методами рекомбинантных ДНК с образованием реплицируемого экспрессирующего плазмидного вектора.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный плазмидный экспрессирующий вектор вводят в приемлемого хозяина, такого как E.coli, B.subtilis или дрожжи, известными методами трансформации и адаптируют культуру к синтетической среде, содержащей один источник углерода, основные соли и микроэлементы нижеследующего состава: глицерин в качестве источника углерода в количестве 10-35 г/л, фосфат калия в количестве 5-20 г/л, фосфат аммония в количестве 2-6 г/л, сульфат магния в количестве 1-3 г/л, лимонная кислота в количестве 1-2 г/л, EDTA в количестве 5-10 мг/л, хлорид кобальта в количестве 2-4 мг/л, хлорид марганца в количестве 10-20 мг/л, хлорид меди в количестве 0,5-2,5 мг/л, борная кислота в количестве 2-5 мг/л, молибдат натрия в количестве 1-5 мг/л, ацетат цинка в количестве 5-25 мг/л, хлорид железа в количестве 50-100 мг/л и гидрохлорид тиамина в количестве 4-8 мг/л.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения адаптированную культуру культивируют в ферментере при рН 6-8, аэрации растворенным кислородом в количестве 0-100% и перемешивании со скоростью 50-1000 об/мин в вышеуказанной синтетической среде.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения посевной инокулят в количестве 0,1-10%, также полученный с использованием вышеуказанной синтетической среды, инокулируют в ферментер, содержащий стерильную синтетическую среду.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антибиотик, такой как канамицин, ампициллин и тому подобный, добавляют в количестве 1-1000 микрограммов/миллилитр к посевной и ферментационной среде до добавления культивируемого организма. После выращивания культуры клеток в течение 6-24 часов добавляют индуктор, представляющий собой изопропил-п-D-тиогалактопиранозид (IPTG), в количестве 0,01-10 мМ для индукции культуры для продуцирования стрептокиназы.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения ферментацию осуществляют в течение периода времени от 4 до 10 часов и собирают биомассу обычным центрифугированием или микрофильтрацией.

В другом варианте осуществления изобретения полученную таким образом биомассу лизируют известными методами лизиса клеток и собирают включения стрептокиназы.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения собранные включения стрептокиназы ресолюбилизируют в буферах, содержащих мочевину или гидрохлорид гуанидина, производят вторичную укладку цепи и очистку, получая при этом ферментативно активную и чистую стрептокиназу. В предпочтительном варианте осуществления изобретения амплифицированную ДНК длиной 1,3 т.п.о. присоединяют к приемлемым экспрессирующим плазмидным векторам, таким как рКК-233-2, рЕТ-9А, Trc-99 и т.д. (в количестве 30-50 копий/клетку), предпочтительно к вектору рЕТ-9А, который расщепляют рестрикционными ферментами, такими как Nde I, BamHI и т.п. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения плазмидные векторы, связанные с ДНК, кодирующей стрептокиназу, вводят в штаммы E.coli, BL 21DE3 или JM 105, предпочтительно в штамм BL 21DE3.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения микроэлементы и источник углерода стерилизуют отдельно и добавляют в стерильный ферментер, содержащий раствор основных солей. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения в ферментер добавляют дополнительные питательные вещества для увеличения биомассы. Далее настоящее изобретение будет описано в виде примеров, которые, однако, не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Получение репликативной плазмиды (pSK4), экспрессирующей стрептокиназу без сигнального пептида, для внутриклеточного продуцирования стрептокиназы в E.coli (№ доступа МТСС 5120)

Источником ДНК, служащим для выделения зрелого гена, кодирующего стрептокиназу, с отсутствием нативных сигнальных пептидных последовательностей, была плазмида pJKD-21. 3 мкг плазмиды pJKD-21 расщепляли 5-10 единицами рестрикционных ферментов NdeI и BamHI известными методами и инкубировали при 37°С в течение 8 часов. Реакцию прекращали, нагревая реакционную смесь при 80°С в течение 10 минут, и расщепленный образец подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле в течение 1 часа при 150 мВ. Фрагмент ДНК длиной 1,3 т.п.о., выделенный из плазмиды pJKD-21, вырезали из геля и очищали с использованием набора для очистки генов. Одновременно с выполнением вышеуказанной реакции 1 мкг плазмиды рЕТ9а (приобретенной коммерческим путем в компании New England Biolabs) также расщепляли соответственно 5 и 10 единицами NdeI и BamHI и инкубировали при 37°С в течение 8-10 часов. Полученный гидролизат смешивали в 0,5 мкг фрагмента ДНК длиной 1,3 т.п.о. пламиды pJKD-21 с достижением общего объема, равного 50 мкл. Смесь ДНК осаждали при -20°С в присутствии 100 мкл абсолютного этанола и 5 мкл ацетата натрия. Преципитат ДНК растворяли в 17 мкл воды и добавляли 3-4 единицы ДНК-лигазы Т4 вместе с комплементарным буфером (приобретенным коммерческим путем в компании New England Biolabs, США). Реакционную смесь инкубировали при 16°С в течение ночи и переносили в E.coli BL21DE3 известными методами трансформации. Трансформированные клетки культивировали на планшетах со средой LB (среда Луриа), содержащей 20 мкг/мл антибиотика канамицина и инкубировали при 37°С в течение ночи. 10 единичных колоний отбирали из 10 мл среды LB, содержащей 20 мкг канамицина, и инкубировали при 37°С в течение 4-5 часов до достижения оптической плотности (OD) клеток, равной 0,5, после чего добавляли 0,01 мМ IPTG и продолжали инкубировать клетки в течение ночи. Клетки осаждали центрифугированием и анализировали при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с 10% додецилсульфата натрия. В колониях была обнаружена интенсивная полоса, соответствующая белку длиной 47 кДа, которая отсутствовала в контрольных клетках, трансформированных контрольной плазмидой рЕТ9а. Отобранный клон получил название pSK4 и был депонирован в Коллекцию типовых микробных культур Института микробной технологии, г. Чандигар, под номером доступа МТСС 5120. Указанный клон подвергали ферментации для определения уровня продуктивности и биологического исследования стрептокиназы.

Пример 2

Адаптация рекомбинантного штамма E.coli к синтетической среде

Штамм E.coli (№ доступа МТСС 5120), выращиваемый на комплексной среде, подобной среде Луриа (LB), адаптировали к синтетической среде, содержащей 25 г/л глицерина в качестве источника углерода, 13 г/л фосфата калия, 4 г/л фосфата аммония, 1,2 г/л сульфата магния, 1,7 г/л лимонной кислоты, 8,4 мг/л EDTA и раствор микроэлементов (1-10 мл), содержащий ничтожно малые количества хлорида кобальта, хлорида марганца, хлорида меди, борной кислоты, молибдата натрия, ацетата цинка, хлорида железа и гидрохлорида тиамина. 100 мкл питательной среды LB в ранней стационарной фазе роста инокулировали в 100 мл встряхиваемой колбе, содержащей 10 мл предварительно нагретой синтетической среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина, и инкубировали в ротационном шейкере при 37°С со скоростью вращения 100 об/мин в течение 8 часов. 100 мкл указанной культуры инокулировали в другой 100 мл встряхиваемой колбе, содержащей 10 мл предварительно нагретой синтетической среды, содержащей 50 мкг/мкл канамицина, и инкубировали в ротационном шейкере при 37°С со скоростью вращения 100 об/мин в течение 8 часов. 1 мл указанной культуры снова инокулировали в 500 мл встряхиваемой колбе, содержащей 50 мл предварительно нагретой синтетической среды, содержащей 50 мкг/мкл канамицина, и инкубировали в течение 8 часов. 500 мкл аликвоты адаптированной культуры смешивали с равным объемом 50% глицерина в 1 мл пробирках и хранили при -70°С в качестве исходных растворов в глицерине.

Пример 3

Получение посевной культуры рекомбинантного E.coli для ферментации

Для каждой ферментации одну пробирку с исходным раствором в глицерине, полученным в примере 2, инокулировали в 500 мл встряхиваемой колбе, содержащей 50 мл предварительно нагретой синтетической среды, содержащей 25 г/л глицерина в качестве источника углерода, 13 г/л фосфата калия, 4 г/л фосфата аммония, 1,2 г/л сульфата магния, 1,7 г/л лимонной кислоты, 8,4 мг/л EDTA и раствор микроэлементов (1-10 мл), содержащей ничтожно малые количества хлорида кобальта, хлорида марганца, хлорида меди, борной кислоты, молибдата натрия, ацетата цинка, хлорида железа и гидрохлорида тиамина. Добавляли 50 мкг/мкл канамицина, смесь инкубировали в течение 10 часов и использовали в качестве посевного инокулята для всех ферментаций.

Пример 4

Периодическая ферментация для продуцирования рекомбинантной стрептокиназы

2,0 л среды из основных солей, содержащей 13 г/л фосфата калия, 4 г/л фосфата аммония, 1,2 г/л сульфата магния, 1,7 г/л лимонной кислоты, 8,4 мг/л EDTA, стерилизовали в 3 л ферментере Chemap. Глицерин (10-35 г/л) предпочтительно в количестве 30 г/л и раствор микроэлементов (1-10 мл), содержащий ничтожно малые количества хлорида кобальта, хлорида марганца, хлорида меди, борной кислоты, молибдата натрия, ацетата цинка, хлорида железа и гидрохлорида тиамина, стерилизировали отдельно и добавляли в охлажденный ферментер, конечный объем доводили до 2,45 л, добавляя стерильную дистиллированную воду. Показатель рН доводили до 7,4, используя 5 н. раствор гидроксида натрия. Добавляли 50 мкг/мкл стерилизованного фильтрованием канамицина, после чего вводили посевной инокулят.

Добавляли 50 мл посевного инокулята, полученного в примере 3, до достижения конечного объема, равного 2,5 л. Основное культивирование выполняли при 37°С в течение 12 часов. Показатель рН в ферментере поддерживали равным 7,4 с помощью водного раствора аммиака и HCl. Скорость вращения ферментера была равна 700 об/мин, и начальная скорость аэрации была задана равной 2,5 л/мин. Скорость вращения медленно увеличивали до 900 об/мин для поддержания минимальной концентрации растворенного кислорода, обеспечивающей 10% насыщение воздухом. Ферментацию выполняли в течение 10 часов и после достижения в ферментере концентрации биомассы, равной 7 г DCW (масса клеток в сухом состоянии)/л, ферментер индуцировали 0,2 мМ IPTG. Ферментацию продолжали в течение еще 4 часов, после чего биомассу собирали для выделения стрептокиназы.

Пример 5

Периодическая ферментация с подпиткой для продуцирования рекомбинантной стрептокиназы

2,0 л среды из основных солей, содержащей 13 г/л фосфата калия, 4 г/л фосфата аммония, 1,2 г/л сульфата магния, 1,7 г/л лимонной кислоты, 8,4 мг/л EDTA, стерилизовали в 3 л ферментере Chemap. Глицерин (10-35 г/л) предпочтительно в количестве 30 г/л и раствор микроэлементов (1-10 мл), содержащий ничтожно малые количества хлорида кобальта, хлорида марганца, хлорида меди, борной кислоты, молибдата натрия, ацетата цинка, хлорида железа и гидрохлорида тиамина, стерилизировали отдельно и добавляли в охлажденный ферментер, конечный объем доводили до 2,45 л, добавляя стерильную дистиллированную воду. Показатель рН доводили до 7,4, используя гидроксид натрия. Добавляли 50 мкг/мкл стерилизованного фильтрованием канамицина, после чего вводили 50 мл посевного инокулята, полученного в примере 3, и доводили конечный объем до 2,4 л. Основное культивирование осуществляли при 37°С. Показатель рН в ферментере поддерживали равным 7,4 с помощью водного раствора аммиака и HCl. Скорость вращения ферментера была равна 700 оборотам/мин, и начальная скорость аэрации была задана равной 2,5 л/мин. Скорость вращения медленно увеличивали до 900 об/мин для поддержания минимальной концентрации растворенного кислорода, обеспечивающей 10% насыщение воздухом. Ферментацию выполняли в течение 10 часов, после чего добавляли 50 мл свежей питательной среды, содержащей 795 г/л глицерина, 20 г/л сульфата магния, 13 мг/л EDTA, 4 мг/л хлорида кобальта, 23,5 мг/л хлорида марганца, 2,5 мг/л хлорида меди, 5 мг/л борной кислоты, 4 мг/л молибдата натрия, 16 мг/л ацетата цинка и 40 мг/л хлорида железа. Ферментацию продолжали в течение 40 минут и добавляли еще 50 мл свежей питательной среды, содержащей 795 г/л глицерина, 20 г/л сульфата магния, 13 мг/л EDTA, 4 мг/л хлорида кобальта, 23,5 мг/л хлорида марганца, 2,5 мг/л хлорида меди, 5 мг/л борной кислоты, 4 мг/л молибдата натрия, 16 мг/л ацетата цинка и 40 мг/л хлорида железа. После достижения в ферментере концентрации биомассы, равной 18 г DCW (масса клеток в сухом состоянии)/л, ферментер индуцировали 1 мМ IPTG. Ферментацию продолжали в течение еще 4 часов, после чего биомассу собирали для выделения стрептокиназы.

Пример 6

Выделение и ресолюбилизация включений из ферментационной среды

Ферментационную среду центрифугировали с ускорением 5000 g в течение 15 минут при 4°С для удаления биомассы. Клетки промывали в буфере, содержащем (i) 10 мМ трис-HCl, рН 8, (ii) 10 мМ EDTA и (iii) 100 мМ хлорида натрия, и вторично центрифугировали. Клеточный дебрис вторично суспендировали в буфере, содержащем (i) 10 мМ трис-HCl, рН 8, (ii) 10 мМ EDTA, (iii) 100 мМ хлорида натрия, (iv) 1 мМ фенилметилсульфонилфторида. К вышеуказанному раствору предпочтительно добавляли 0,64% лизоцима, перемешивали в течение 3 часов при 4°С и обрабатывали ультразвуком в течение 30 минут. Обработанный ультразвуком раствор центрифугировали с ускорением 5000 g, получая при этом включения стрептокиназы.

К вышеуказанным выделенным включениям добавляли 8М раствор мочевины или 6М раствор гуанидин-HCl, перемешивали в течение 24 часов и центрифугировали с ускорением 5000 g. Супернатант разводили в 100 раз, используя буфер, содержащий 0,05 мМ трис при рН 7,5, и диализовали, получая при этом активную рекомбинантную стрептокиназу.