способ оценки антагонистических свойств бактерий кишечной группы к патогенным микобактериям

Формула изобретения

Способ оценки антагонистических свойств бактерий кишечной группы к патогенным микобактериям, включающий засев бактерий кишечной группы на поверхность нижнего слоя питательной среды, содержащее двузамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, L-аспарагин глицерин, лимонную кислоту, лимоннокислое аммиачное железо, гумивит, агар и дистиллированную воду при следующем содержании компонентов:

L-аспарагин	4,0 г
двузамещенный фосфорнокислый калий	0,5 г
сернокислый магний	0,5 г
лимонная кислота	2,0 г
лимоннокислое аммиачное железо	0,05 г
глицерин	40,0 г
агар	30,0 г
гумивит	90,0-95,0 мл
дистиллированная вода	до 1000,0 мл

культивирование при температуре 37°С в течение 96 ч, прогрев на водяной бане при температуре 100°С в течение 5-10 мин, скашивание при комнатной температуре, нанесение верхнего слоя среды приведенного состава, засев на поверхность верхнего слоя культуры индикаторного штамма с последующим культивированием и оценку антагонистической активности по отношению количества колоний индикаторного штамма, выросших на плотной питательном агаре к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на двухслойной среде.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии, касается способа изучения взаимоотношений микроорганизмов и может быть использовано для оценки антагонистических свойств бактерий кишечной группы к патогенным микобактериям.

Известны различные способы определения антагонистической активности микробов с использованием плотных однослойных, двух- и трехслойных питательных сред. На однослойные различные по составу питательные среды культуры засевают в лунки перпендикулярными штрихами или перекрывающимися каплями или на одной половине с последующим подсевом индикаторных микробов штрихами на другой половине /1/. Двух- и трехслойные питательные среды были использованы для изучения бактериоциногенности /2/, антагонистической активности лактобацилл к грибам /3/, эшерихиям /4/, протеям, стафилококкам, псевдомонадам /5/, для оценки действия бифидобактерий на рост гарднерелл, энтеробактерий, стафилококков, энтерококков и псевдомонад /6/, а также способности Bacillus spp. и Hafnia spp. подавлять рост микрококков, стафилококков и эшерихий /1/. В качестве предпочтительного аналога рассматривается способ отсроченного антагонизма с использованием двухслойной среды. Однако известные способы не позволяют выявлять антагонистические свойства по отношению к патогенным микобактериям из-за особенностей их биологии, касающихся скорости роста и требований к питательным средам, что затрудняет совместное культивирования с другими микроорганизмами.

Цель изобретения - повышение эффективности.

Поставленная цель достигается способом, включающим посев исследуемого материала на поверхность питательного агара с последующим культивированием при температурном и временном оптимуме, прогрев выросших культур, нанесение второго слоя питательного агара, посев индикаторного штамма с последующим культивированием при температурном и временном оптимуме и количественной оценкой.

Гумивит - щелочной гидролизат низинных сортов торфа (выпускается ООО Агропром), представляет собой высокодисперсный золь натриевых солей комплекса гумусных кислот - гуминовых, гуматомелановых и фульвокислот /8/. Раствор солей гуминовых кислот состоит из длинных фрагментарных цепочек с различными функциональными группами, важнейшими из которых являются карбоксильные (СООН) и фенольные (ОН), способные образовывать хелатные комплексы с микроэлементами, что обеспечивает их высокую обменную емкость и транспорт в клетку микроорганизмов /9, 10/. Гумивит - жидкость от темно-коричневого до черного цвета со специфическим сладковатым запахом.

Для приготовления питательного агара в химически чистую стерильную колбу емкостью 2,0 л наливают 300,0 мл дистиллированной воды, прогревают на водяной бане до 75-85°С. В воде растворяют последовательно 2,0 г лимонной кислоты, 4,0 г L-аспарагина, 0,5 г сернокислого магния, 0,5 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 40,0 г глицерина, 90,0-95,0 мл гумивита и 30,0 г агара. Каждый компонент добавляют после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов общий объем доводят до 1000,0 мл стерильной дистиллированной водой. Устанавливают рН 7,1-7,2 добавлением 1н. NaOH или 1н. HCl. Раствор автоклавируют в течение 30 минут при 1 атм. Горячую среду разливают по пробиркам по 3 мл и скашивают.

Способ осуществляется следующим образом.

В стерильные пробирки заливают по 3 мл расплавленного питательного агара и скашивают. На поверхность косяка засевают штаммы бактерий кишечной группы. Пробирки с засеянными штаммами помещают в термостат и выдерживают при температуре 37°С в течение 96 часов. Затем пробирки с посевами прогревают на водяной бане при температуре 100°С в течение 5-10 минут и скашивают при комнатной температуре. На поверхность косяка наслаивают 1 мл расплавленного питательного агара (температура 65-70°С) и оставляют застывать при комнатной температуре, после чего на поверхность верхнего слоя засевают культуру индикаторного штамма микобактерий. Контролем служат пробирки с однослойной средой с использованием питательного агара.

В экспериментальных исследованиях использовали штаммы бактерий кишечной группы Escherichia coli и Enterobacter faecalis (пробиотический препарат «Окарин» производства фирмы ИмБио, г.Нижний Новгород), штаммы микобактерий М. tuberculosis (шт.Academia), М. bovis (шт.Ravenal, Vallee, BCG) и M.avium (шт.ГИСК). В таблице 1 приведены варианты питательного агара.

Таблица 1 Состав разных вариантов питательного агара
Состав	Вариант новой среды
	1-й	2-й	3-й	4-й
L-аспарагин, г	4,0	4,0	4,0	4,0
Двузамещенный фосфорнокислый калий, г	0,5	0,5	0,5	0,5
Сернокислый магний, г	0,5	0,5	0,5	0,5
Лимонная кислота, г	2,0	2,0	2,0	2,0
Лимоннокислое аммиачное железо, г	0,05	0,05	0,05	0,05
Глицерин, г	40,0	40,0	40,0	40,0
Агар, г	30,0	30,0	30,0	30,0
Гумивит, мл	85,0	90,0	95,0	100,0
Дистиллированная вода, мл	до 1000,0	до 1000,0	до 1000,0	до 1000,0

Пример 1. Определяли эффективность питательного агара для культивирования бактерий. Посевы культур микобактерий производили нанесением 10 мкл суспензии, обеспечивавшей рост 30-60 КОЕ при посеве на среду Левенштейна- Йенсена, на все сравниваемые варианты питательного агара. Посевы культур бактерий кишечной группы производили нанесением 10 мкл суспензии, содержавшей 5×10 ⁶ КОЕ в 1 мл, на все сравниваемые варианты питательного агара. Контроль - мясо-пептонный агар (МПА). При оценке роста культур учитывали интенсивность роста (+ слабый, ++ средний, +++ обильный). Полученные результаты (таблица 2) показали, что оптимальными являются варианты 2 и 3 питательного агара (таблица 1), обеспечивавшие более высокую интенсивность роста микобактерий и бактерий кишечной группы относительно варианта 1 питательного агара и сравнимые с таковыми на МПА для бактерий кишечной группы. Повышение количества гумивита (вариант 4 солевого агара) не влияло на интенсивность роста.

Таблица 2 Массивность роста микобактерий (3 недели) и бактерий кишечной группы (3 дня) на питательном агаре разных вариантов
Среда	Штаммы микроорганизмов
	М. bovis Vallee	М. bovis BCG	M.tub. Academia	M. avium ГИСК	Бактерии кишечной группы Escherichia coli, Enterobacter faecalis
Вариант 1	+	+	+	+	++
Вариант 2	++	+	+	+	++
Вариант 3	+++	+	+	++	+++
Вариант 4	+++	+	+	++	+++
МПА	-	-	-	-	++

Пример 2. Определяли осуществимость способа выявления антагонистических свойств по отношению к патогенным микобактериям у бактерий кишечной группы в двух сериях опытов.

Первая серия опытов

В стерильные бактериологические пробирки наливали по 3 мл расплавленного агара, содержавшего солевой состав среды Сотона и 90 мл гумивита. На поверхность расплавленного и остывшего питательного агара с добавлением гумивита засевали по 10 мкл суспензии исследуемого штамма, содержавшей 5×10⁶ микробных клеток в 1 мл. Пробирки с засеянными штаммами помещали в термостат и выдерживали при температуре 37°С в течение 96 часов. Пробирки с выросшими культурами прогревали на водяной бане при температуре 100°С в течение 5 минут и скашивали при комнатной температуре. На поверхность косяка наслаивали по 1 мл питательного агара с добавлением гумивита и оставляли при комнатной температуре на 18-20 часов. Далее на поверхность верхнего слоя засевали 10 мкл суспензии культуры индикаторного штамма, обеспечивавшей рост 10-30 КОЕ в контроле. Засеянные пробирки помещали в термостат и выдерживали при температуре 37°С в течение 45 суток.

Вторая серия опытов

То же без прогревания пробирок с выросшими культурами на водяной бане. Контроль - однослойный питательный агар с добавлением 90 мл гумивита. Оценку результатов проводили по индексу блокирования роста (ИБР) - отношение количества колоний индикаторного штамма в контроле к количеству колоний индикаторного штамма в опыте. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 Антагонистическая активность бактерий кишечной группы к микобактериям
Среда	Индикаторные штаммы, количество колоний после выращивания в течение 15, 30 и 45 суток
	М. avium (штамм ГИСК)			М. tuberculosis (штамм Academia)			М. bovis (штамм Vallee)			M. bovis (штамм Ravenal)			М. bovis (штамм BCG)
	15	30	45	15	30	45	15	30	45	15	30	45	15	30	45
1 серия опытов
Двухслойная среда	-	2	7	-	2	2	-	-	5	-	1	2	-	2	3
Однослойная среда - контроль		11	19		18	20		25	27		10	19		14	21
ИБР		5,5	2,7		9,0	10,0			5,4		10,0	9,5		7	7
		2 серия опытов
Двухслойная среда	-	(к)	(к)	-	(к)	(к)	-	(к)	(к)	(к)	(к)	(к)	(к)	(к)	(к)
Однослойная среда - контроль		11	19		18	20		25	27		10	10		14	21
ИБР
Примечание: - -отсутствие роста, (к) - контаминация культурами бактерий кишечной группы

Как видно из таблицы 3, антагонистическая активность бактерии кишечной группы изменяется в зависимости от вида патогенных микобактерий. Наибольшая активность отмечена по отношению к M.tuberculosis (шт. Academia), M.bovis (шт. Ravenal), а наименьшая - по отношению к M.avium (шт. ГИСК), следовательно, предложенный показатель для количественной оценки антагонистической активности ИБР позволяет сравнивать антагонистические свойства бактерий кишечной группы по отношению к патогенным микобактериям. Кроме того, во второй серии опытов отмечалась контаминация культур индикаторных штаммов культурами исследуемых штаммов, что исключало возможность выявления.

Проведенные исследования подтверждают, что предложенный способ позволяет определять антагонистическую активность бактерий кишечной группы к патогенным микобактериям в двухслойной среде с использованием питательного агара, содержащего солевую основу среды Сотона, агар и гумивит, и прогреванием выросших культур исследуемого штамма. Из доступных источников информации не известны способы изучения взаимодействия бактерий кишечной группы с микобактериями. Особенности биологии микобактерий затрудняют их одновременное выращивание с другими микроорганизмами. Неспособность микобактерий синтезировать разнообразные химические вещества и витаминоподобные факторы роста самостоятельно, что снижает обмен веществ клеток микроорганизмов, следствием чего является очень медленный рост, обусловливает их потребность в полноценных, богатых белком, углеродом, минеральными веществами и стимуляторами роста питательных средах, которая реализуется использованием питательных яичных, картофельных, кровяных сред. Известные плотные среды для культивирования микобактерий не могут быть использованы в составе многослойных сред, создающих условия для оценки взаимодействия микробов с различными типами метаболизма, поскольку технология их приготовления предусматривает их свертывание. Таким образом, совокупность отличительных признаков соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень». Предложенный способ может быть рекомендован для выбора пробиотического препарата для применения молодняку крупного рогатого скота, заражающегося патогенными микобактериями алиментарным путем в первые дни жизни, как средства лечебно-профилактического воздействия.

Источники информации

1. Mardth Р.А., Soltesz L.V. In vitro interactions between lactobacilli and other microorganisms occurring in the vaginal flora//Scand.J, Infect. Dis. Suppl. 1983, (1.40)3:47-51.

2. Кудлай Д.Г., Уртаева З.A., Смеянов B.B. и др. Изучение антагонистической активности бифидобактерий in vitro и in vivo с использованием гнотобиотической техники// Журн. микробиол. - 1999. - №.5. - С.72-75.

3. Magnusson J., Schnurer J. Lactobacillus coryniformis subsp. Coryniformis strain S13 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound// Appl. Environ. Microbiol. - 2001 - №1 (67) - P.1-5.

4. McGroarty J.A., Reid G. Detection of a lactobacillus substance that inhibits Escherichia coli. Cand.J. Microbiol. 1988., (134):974-978.

5. Osset J., Bartolome R.M., Garsia E.A., Assessement of the capacity of Lactobacillus to inhibit the growth of uropathogens and block their adhesion to vaginal epithelial cells//J.Infect.Dis. - 2001 - №183(3). - P.485-491.

6. Коршунов B.M., Уртаева 3.A., Смеянов B.B. и др. Изучение антагонистической активности бифидобактерий in vitro и in vivo с использованием гнотобиологической технологии//Журн. микробиол. - 1999. - №5. - С.72-75.

7. Альтшуллер М.Л., Блинкова Л.П., Батуро А.П. Обнаружение штаммов-антагонистов у представителей родов Bacillus и Hafnia// Журн. микробиол. - 1993. - №6. - С.22-23.

8. Гришин Г.И., Слинина К.Н. Дар природы - гумивит// Практик. - 2004. - №3-4. - С.80-82.

9. Левинский Б.В. Все о гуматах. - Иркутск: ИП Макаров С.Е., 1999. - 198 с.

10. Сорокина Н.Ф. Физиология активности продуктов окисления торфа//Новые процессы и продукты переработки торфа. - Минск: Наука, 1982. - С.109-115.